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金樱子为蔷薇科常绿攀缘植物金樱子Rasa laevigata Michx·的果实,是安徽省大别山区的主产中药材之一[1]。金樱子作为一种传统中药,其味酸、甘、涩, 平,有利尿、降血脂等作用[2-3]。现代医学研究表明,金樱子具有收涩、固精、止泻等功效,是一味很有价值的药食两用中药[4-5]。据文献报道,金樱子中的化学成分主要有甾体、黄酮、三萜、苯丙素、酚酸和多糖等化合物,其中黄酮类化合物具有非常好的抗氧化、清除自由基、抗血小板凝集等作用[6-8],是其药理作用的重要成分。为了进一步探讨金樱子黄酮类化合物药理活性的物质基础,从中寻找具有药用价值的生物活性成分,揭示金樱子总黄酮的药理活性机制和对其进行质量评价,本实验采用不同极性溶剂,对金樱子总黄酮进行分离萃取,为金樱子的深入研究与开发利用提供理论基础。
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金樱子于2015年11月采自安徽省六安市金寨县,经皖西卫生职业学院药学系徐茂红副教授鉴定为金樱子Rosa laevigata Michx·的果实。金樱子去籽后103 ℃干燥4 h,粉碎后过40目筛,用60%乙醇提取、AB-8型大孔吸附树脂纯化得精制金樱子总黄酮[9],冷冻干燥备用。
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芦丁对照品(纯度98%,上海生化试剂一厂);数显恒温水浴锅(金坛市正基仪器有限公司),TU-1901双光束紫外可见分光光度计(上海第三分析仪器厂),精密电子天平(Precisa公司),旋转蒸发器RE-52(上海青蒲沪西仪器厂),冷冻干燥机FD-1(北京博医康公司),高效液相色谱仪1525(美国WATERS公司)。
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准确称取金樱子总黄酮1.0 g,溶于500 mL 60%乙醇中,减压回收乙醇,得190 mL金樱子总黄酮溶液。
分段萃取:以等体积石油醚萃取数次至上液澄清透明无色,得石油醚萃取相;下液继续用等体积三氯甲烷萃取至下液澄清透明无色,得浅黄色三氯甲烷相;上液继续用等体积乙酸乙酯萃取,得乙酸乙酯相;下液继续用等体积正丁醇萃取,得正丁醇相;剩下的即为水相。各相分别减压浓缩,冷冻干燥,称量计重。
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参照文献[10],确定HPLC-UV测定条件为:色谱柱为Hypersil ODS2柱(4.6 mm×250 mm,10 μm),检测波长365 nm,流速1 mL/min,柱温20 ℃,进样量10 μL, 分析时间26 min,流动相梯度洗脱条件见表 1。用HPLC-UV法测定各组分在此波长下的峰值[11]。
时间/min 甲醇/% 水/% 冰乙酸/% 0 40 59.6 0.4 2.5 40 59.4 0.6 3.5 50 49.4 0.6 5.0 55 44.5 0.5 5.5 55 44.5 0.5 10.0 65 34.6 0.4 13.0 65 34.6 0.4 13.5 85 14.8 0.2 16.0 85 14.8 0.2 18.0 100 0 0 25.0 100 0 0 -
采用1.3.2的色谱条件,改用二极管阵列检测器(DAD)检测,根据张东方等[12]研究结果,采用HPLC-DAD法绘制色谱流出曲线,然后描绘每个色谱峰的峰面积-波长曲线,拟合紫外图谱,识别黄酮有效部位,进而进行含量测定,通过各峰的形状确定各相中是否含有黄酮类成分。
1.1. 材料
1.2. 试剂与仪器
1.3. 方法
1.3.1. 金樱子总黄酮的分段萃取
1.3.2. 各萃取组分高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)测定
1.3.3. 各萃取组分高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)测定
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金樱子总黄酮各相萃取结果中,三氯甲烷相和正丁醇相总黄酮含量较高,分别为28.95%和32.19%,乙酸乙酯相最低,为5.23%(见表 2)。
萃取相 质量/g 占总组分比例/% 石油醚 0.164 3 16.43 三氯甲烷 0.289 5 28.95 乙酸乙酯 0.052 3 5.23 正丁醇 0.321 9 32.19 水 0.063 2 6.32 -
按照建立的色谱条件,依次进样石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相,得金樱子总黄酮不同萃取组分色谱图(见图 1)。由图 1可知,五相中共有3个共有峰,分别是a、b、c,且为大极性成分;而石油醚相和三氯甲烷相有3个特征峰,分别为d、e、f,为小极性成分。五种萃取部位组分中含有3个共有峰,分别是a、b、c;含有3个特征峰分别是d、e、f。石油醚相中含有化学成分多,以小极性的成分为主;三氯甲烷相中含有成分较多,小极性成分所占比例较大;乙酸乙酯相中含有组分最少,多为大极性成分;正丁醇相中含有物质比较多,多为大极性成分;水相中含有较少,多为大极性成分。萃取物中的成分种类随着有机溶剂的极性增加而减少,且小极性成分都集中在石油醚相和三氯甲烷相,大极性成分都集中在乙酸乙酯相和正丁醇相中,实现了对金樱子总黄酮的初步分离。
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金樱子总黄酮的3D峰图见图 2,各峰放大结果见图 3。黄酮类化合物在200~400 nm有连续双峰[11],通过图 3的各峰情况可以判断峰#1、#2、#3、#4、#5和#6是黄酮,峰#7和#8不是黄酮。同时计算黄酮峰总面积占总峰面积的73.25%。在进样量和响应值都相同的情况下,峰面积比与含量比等值,即黄酮含量为73.25%。
通过对各萃取相HPLC-DAD的测定分析,发现石油醚相、乙酸乙酯相几乎不含黄酮;而三氯甲烷相、正丁醇相含黄酮较多,水相也含少量黄酮(见图 4)。
三氯甲烷相各峰放大结果见图 5,峰#3、#5是黄酮,峰#1、#2和#4不是黄酮,同时计算黄酮峰总面积占总峰面积的47.72%,即黄酮含量为47.72%。
正丁醇相各峰放大结果见图 6,峰#3、#5和#6是黄酮多糖苷,峰#1、#2、#3、#4、和#7不是黄酮,同时计算黄酮峰总面积占总峰面积的44.07%,即黄酮含量为44.07%。
水相各峰放大结果见图 7,峰#1是黄酮,峰#2不是黄酮,同时计算黄酮峰总面积占总峰面积的9.17%,即黄酮含量为9.17%。