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血管瘤是婴幼儿最常见的血管性良性肿瘤,其确切的发病机制尚未完全阐明[1],治疗方法繁多(如激光、皮质激素、干扰素、手术等),但缺乏靶向性,疗效远不尽人意。建立一种理想的血管瘤动物模型, 为血管瘤的研究建立平台成为临床上的迫切需求。本研究利用组织块法体外培养增生期血管瘤内皮细胞,植入裸鼠皮下,生长成瘤建立裸鼠血管瘤动物模型。现作报道。
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接种48~72 h后内皮细胞从组织块边缘成团游出,贴壁生长,细胞呈圆形、椭圆形或多角形,饱满,边界清楚,折光性强,胞膜完整,细胞核呈圆或椭圆形,居中。2~3周后内皮细胞铺满培养瓶瓶底,呈单层分布,呈接触抑制生长特性,形成典型“铺路卵石状”排列。细胞质或膜中有明显的棕黄色颗粒沉着,细胞核无染色,表明第Ⅷ因子相关抗原、CD31和CD34染色均呈阳性表达(见图 1)。
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根据细胞计数结果,绘制第3代、第7代血管瘤内皮细胞生长曲线。第3代血管瘤内皮细胞的生长曲线呈“S”形,细胞数量在接种后6~7 d进入快速增殖期,第10 d左右细胞数量达到高峰值,此后进入平台期,观察期间未见明显的衰退期。第7代血管瘤内皮细胞生长曲线与第3代细胞生长曲线有所区别,走势较陡直,接种第3~4天细胞快速增殖,第6~7天数量达到高峰值,此后细胞数量进入持续时间较长的稳定期即平台期;从血管瘤内皮细胞的生长曲线看出,第7代细胞和第3代细胞生长情况差别较大。笔者推测可能是由于经反复传代后细胞的性状发生了改变,有可能7代以后细胞已不具备内皮细胞的生长特性(见图 2)。
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在模型建立8周时间,有1只裸鼠出现质量减轻、活动较少、精神萎靡,其余小鼠均存活良好,食欲旺盛、反应敏捷、活动有力。所形成的瘤体呈浅粉红色,质韧,切开表皮发现瘤体被包膜包绕,边界清楚,血供丰富,出血较多。所种40处瘤体存活率87.5%(35/40)。种植瘤体积生长情况见表 1、图 3。在第1周内,种植的内皮细胞所形成的包块体积进行性缩小至完全吸收。第2周以后,发现有瘤体渐进性增长,第2周到第4周时间内瘤体体积增长缓慢,4~8周瘤体体积增长较快。8周以后种植瘤体再次进入生长缓慢期,瘤体相继缓慢缩小,颜色变浅,第12周发现瘤体体积只有8周时的2/3,切开瘤体多是纤维和脂肪细胞,残存少量血管瘤内皮细胞和扩张的血管。这与临床观察到的血管瘤的发展过程极其相似:早期增殖极其迅速,常在出生后1个月内发病,6个月内廇体迅速增大,此后的6个月增长速度有所减慢,从1岁左右开始血管瘤大多开始趋向消退,50%在5岁以内完全消退不留任何痕迹。另有50%血管瘤消退后可残留瘢痕、纤维、脂肪组织和扩张血管等。
饲养时间/周 瘤体体积/cm3 1 0.022±0.001 2 0.295±0.027 4 0.357±0.032 8 0.918±0.043 12 0.692±0.103 表 1 肿瘤体积增长情况(x±s)
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切取的瘤体组织行切片HE染色,光镜下可见内皮细胞密集,呈团块样增生,形成条索或管状结构,另有纤维组织和少量脂肪细胞。内皮细胞质被染成红色,核被染成蓝紫色,偶见核分裂。正常的裸鼠肌肉组织作为对照,发现其细胞核分布均匀,无深染。未见明显细胞核聚集分布,细胞增殖正常(见图 4)。
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在光学显微镜下观察发现棕黄色颗粒满视野弥漫性分布,呈阳性表达。第8周,CD31和CD34阳性指数分别为92.43± 5.56(4+)和92.53±5.01(4+);第12周,其阳性指数分别为72.23±10.74(3+)和65.89±18.69(3+)。肌肉组织阴性表达。表明瘤体来源于体外培养的血管瘤内皮细胞,而非裸鼠组织(见图 5)。
内皮祖细胞在裸鼠体内再现人血管瘤的生物学特性研究
Biological characteristics of the endothelial progenitor cells in regenerating human hemangioma in nude mice
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摘要:
目的研究人血管瘤内皮祖细胞(EPcs)在裸鼠体内分化情况,进一步揭示其生物学特性。 方法组织块法体外培养增生期血管瘤内皮祖细胞(经CD31、CD34及Ⅷ因子相关抗原鉴定),浓集后分别种植于裸鼠双侧胸壁、腰部皮下,动态观察移植瘤生长情况及组织学变化,并用血管内皮细胞特异性标志物鼠抗人CD31、CD34免疫组化单克隆抗体染色研究所成瘤体的同源性。 结果体外培养血管瘤内皮祖细胞生长良好,细胞计数为3×108个/培养瓶,CD31、CD34及Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测阳性表达,裸鼠皮下植入后所形成的瘤体与原血管瘤生物学特点及病理特征相似,经CD31、CD34鉴定瘤体来源于人血管瘤内皮细胞。 结论内皮祖细胞是血管瘤发生的细胞来源,此可作为血管瘤的动物模型,为血管瘤的研究提供较理想平台。 Abstract:ObjectiveTo study the differentiation of human hemangioma endothelial progenitor cells(EPcs) in nude mice, and further reveal its biological characteristics. MethodsThe hemangioma endothelial progenitor cells in proliferative stage were cultured in vitro, identified by CD31, CD34 and Ⅷ-factor related antigens, and subcutaneously inoculated into the bilateral chest wall and waist of nude mice.The growth characteristics and histologic changes of transplanted tumors were regularly observed.The transplanted tumor's homology was identified by immunohistochemical staining of the vascular endothelial cell specific marker CD31 and CD34. ResultsThe growth of EPcs was good in vitro, the number of EPcs was 3×108, and the positive expressions of CD31, CD34 and Ⅷ-factor related antigen were detected by immunohistochemistry.The biological and pathological characteristics between tumor formation after subcutaneous implantation and original hemangioma were similar in nude mice.The tumor identified by CD31 and CD34 was derived from human hemangioma endothelial cells. ConclusionsThe cell source of hemangioma is derived from EPCs, which can be used as the animal models of hemangioma, and provide an ideal platform for the study of hemangioma. -
Key words:
- hemangioma /
- endothelial progenitor cell /
- animal model /
- nude mice
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表 1 肿瘤体积增长情况(x±s)
饲养时间/周 瘤体体积/cm3 1 0.022±0.001 2 0.295±0.027 4 0.357±0.032 8 0.918±0.043 12 0.692±0.103 -
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