电泳迁移率变动分析化学发光法检测T细胞NF-κB活性

孙大康; 李柏青

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电泳迁移率变动分析化学发光法检测T细胞NF-κB活性

孙大康 , 李柏青

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电泳迁移率变动分析化学发光法检测T细胞NF-κB活性

蚌埠医学院免疫学教研室;安徽省感染与免疫重点实验室(蚌埠医学院), 安徽蚌埠 233030

作者简介: 孙大康(1973-),男,硕士(现在工作单位:山东滨州医学院免疫学教研室),研究方向:细胞和分子免疫学

基金项目:
国家自然科学基金资助项目(3070721)
中图分类号: R446.61

Detection of NF-κB activity in T cells by electrophorestic mobility shift assay and enhanced chemiluminescent technique

Department of Immunology, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China
CLC number: R446.61

摘要: 目的: 建立凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)化学发光法检测T细胞激活后核因子κB(NF-κB)活性的方法。方法: 人外周血单个核细胞(PBMC)用抗CD3单克隆抗体(mAB)激活T细胞后,提取细胞核蛋白与生物素标记的NF-κB特异性探针结合,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至正电荷尼龙膜,加链霉亲和素辣根过氧化物酶和化学发光底物后用X光胶片显影,检测NF-κB活性。结果: 人PBMC用抗CD3mAB刺激后15min,明显可见NF-κB活化,30min时达高峰,60min时降低。结论: EMSA化学发光法检测转录因子活性是一种较简捷和高灵敏度的技术,可用于检测T细胞活化后NF-κB活性变化。
- 免疫学技术 /
- 凝胶电泳迁移率变动分析 /
- 增强化学发光 /
- 核因子-κB /
- T细胞
Abstract: Objective: To establish a method for detection of NF-κB activity in human T cells after activation using gelelectrophorestic mobility shift assay(EMSA) and enhanced chemiluminescent(ECL) technique.Methods: Human peripheral blood mononuclear cells(PBMC) were stimulated with anti-CD3 mAb to generate activated T cells.Cell nuclear protein extracts were mixed with biotin-label probe of NF-κB specific oligonucleotides sequence,and protein-probe complex were separated from free probe by electrophoresis in nondenaturing polyacrylamide gel,and electrotransferred to positive charged nylon membrane,and added with streptoavidin-HRP conjugate and enhanced chemiluminescent reagent to detect NF-κB activity.Results: The NF-κB shift band were detected at 15 min after stimulation of human PBMC,and reached maximum peak at 30 min,and then decreased at 60 min of stimulation,and the results of control group demonstrated the method with high specific and sensitivity.Conclusions: Enhanced chemiluminescence based EMSA is very convenient and high sensitive technique to detect nuclear factor such as NF-κB activity in T cells after activation.
- immunologic technics /
- electrophorestic mobility shift assay /
- enhanced chemiluminescent /
- NF-κB /
- T cells

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电泳迁移率变动分析化学发光法检测T细胞NF-κB活性

作者简介: 孙大康(1973-),男,硕士(现在工作单位:山东滨州医学院免疫学教研室),研究方向:细胞和分子免疫学

蚌埠医学院免疫学教研室;安徽省感染与免疫重点实验室(蚌埠医学院), 安徽蚌埠 233030

收稿日期: 2005-07-05

基金项目: 国家自然科学基金资助项目(3070721)

关键词:

摘要: 目的: 建立凝胶电泳迁移率变动分析(EMSA)化学发光法检测T细胞激活后核因子κB(NF-κB)活性的方法。方法: 人外周血单个核细胞(PBMC)用抗CD3单克隆抗体(mAB)激活T细胞后,提取细胞核蛋白与生物素标记的NF-κB特异性探针结合,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移至正电荷尼龙膜,加链霉亲和素辣根过氧化物酶和化学发光底物后用X光胶片显影,检测NF-κB活性。结果: 人PBMC用抗CD3mAB刺激后15min,明显可见NF-κB活化,30min时达高峰,60min时降低。结论: EMSA化学发光法检测转录因子活性是一种较简捷和高灵敏度的技术,可用于检测T细胞活化后NF-κB活性变化。