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2015年世界卫生组织统计,癌症是91个国家70岁前人群的主要死亡原因。全球癌症的发病率及死亡率呈迅速增长之态。目前全世界肺癌的发病率(11.6%)及死亡率(18.4%)均排第一位[1],是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。目前对中晚期肺癌治疗主要采取综合治疗,放疗是肺癌综合治疗中重要的治疗方法之一。在不同期别肺癌中均可应用放疗,但总体治疗效果较差,治疗失败主要原因是局部未控及远处转移。非小细胞肺癌尤其是腺癌对放疗不敏感,为提高放疗敏感性,放射增敏剂是有效解决该难题的重要方法之一。
研究[2-3]发现全反式维A酸(all-trans retinoic acid,ATRA)作为维生素A的主要代谢产物,主要参与调控细胞的增殖分化,诱导肿瘤细胞凋亡,是一种诱导分化剂。研究[4]发现ATRA能够增加胃癌细胞的凋亡及放射敏感性,可能与抑制细胞周期G2/M期的阻滞作用、下调Bcl-2与survivin mRNA表达、上调NF-κB与Bax mRNA表达有关。李明等[5]研究发现ATRA联合放疗具有协同诱导脑胶质瘤细胞凋亡的作用,其分子机制可能与凋亡相关基因p38及MAPK蛋白表达上调、NF-κB蛋白表达下调有关。本研究探讨ATRA对肺腺癌细胞株H1299放射敏感性的影响,为肺癌放射增敏提供依据。
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不同浓度ATRA对肺腺癌H1299细胞均有抑制作用,浓度为10 μmol/L时最佳(P < 0.01),72 h时其抑制率达到最大值(见表 1)。相对单独ATRA处理,10 μmol/L ATRA联合不同剂量的射线照射后,细胞生长抑制率明显增加(P < 0.01)(见表 2)。
分组 生长抑制率/% F P MS组内 24 h 48 h 72 h 对照组 101.52±2.09 102.17±3.15 102.89±1.76 0.24 >0.05 5.796 ATRA组/(μmol/L) 1.25 76.18±3.83** 70.27±4.32** 62.18±2.83**■■ 10.75 < 0.01 13.780 5 65.46±1.87**## 59.86±2.86**#■ 42.46±3.87**##■■△△ 48.57 < 0.01 8.884 10 58.54±3.04**##▲▲ 50.55±2.27**##▲■ 37.54±4.04**##■■△△ 32.92 < 0.01 10.239 F 134.18 144.48 249.97 — — — P < 0.01 < 0.01 < 0.01 — — — MS组内 7.944 10.479 10.601 — — — q检验:与对照组比较**P < 0.01;与ATRA 1.25 μmol/L组比较#P < 0.05,##P < 0.01;与ATRA 5 μmol/L组比较▲P < 0.05, ▲▲P < 0.01;与24 h比较■P < 0.05, ■■P < 0.01;与48 h比较△△P < 0.01 表 1 ATRA抑制H1299细胞生长(ni=6;x±s)
放射剂量/Gy 存活率/% t P 单纯放射组 10 μmol/L ATRA+放射组 0 0.87±0.03 0.75±0.03 4.90
< 0.014 0.47±0.07** 0.24±0.02** 5.47 < 0.01 8 0.10±0.02**## 0.02±0.002**## 6.89 < 0.01 10 0.04±0.008**##▲▲ 0.002±0.0006**##▲▲ 8.20 < 0.01 F 282.12 1 117.69 — — P < 0.01 < 0.01 — — MS组内 0.002 0.000
—— q检验:与0 Gy组比较**P < 0.01;与4 Gy组比较##P < 0.01;与8 Gy组比较▲▲P < 0.01 表 2 射线单独照射和10 μmol/L ATRA联合射线照射对H1299细胞存活的影响(ni=3;x±s)
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ATRA作用和射线照射后的细胞凋亡增多(P < 0.01),ATRA联合射线照射作用后的细胞总凋亡率明显高于单纯射线照射(P < 0.01)(见图 1、表 3)。
分组 凋亡率/% 对照组 0 放射组 23.70±2.13 ATRA组 27.80±3.08* ATRA+放射组 43.56±2.76**##▲▲ F 54.59 P < 0.01 MS组内 5.426 q检验:与对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与放射组比较##P < 0.01;与ATRA组比较▲▲P < 0.01 表 3 ATRA及ATRA联合射线照射诱导H1299细胞凋亡情况(ni=3;x±s)
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与对照组、放射组、ATRA组相比,ATRA+放射组细胞G0/G1期比例明显增加(P < 0.01)(见表 4)。
分组 周期分布/% G0/G1 S G2/M 对照组 10.00±0.91 60.20±0.87 30.80±1.78 放射组 26.52±0.22** 39.27±3.17** 35.73±2.95# ATRA组 63.64±3.99**## 5.98±1.62**## 30.38±2.37 ATRA+放射组 42.30±1.98**##▲▲ 4.86±4.17**##▲▲ 52.81±2.19**##▲▲ F 302.93 283.39 59.79 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 5.179 7.705 5.571 q检验:与对照组比较**P < 0.01;与放射组比较##P < 0.01;与ATRA组比较▲▲P < 0.01 表 4 ATRA及ATRA联合射线照射对H1299细胞周期的影响(ni=3;x±s)
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与放射组相比,ATRA+放射组的细胞存活分数(SF2)值降低,ATRA可以增加肺腺癌H1299细胞放射敏感性,增敏比为1.406(见表 5)。
分组 D0 /Gy Dq/Gy N SF2 k 增敏比 放射组 2.463 2.157 2.871 0.765 0.611 — ATRA+放射组 1.751 1.651 3.167 0.512 0.859 1.406 表 5 ATRA对H1299细胞放射敏感性影响
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对照组、放射组、ATRA+放射组细胞中survivin与NF-κB的蛋白表达水平呈下降的趋势,且ATRP+放射组细胞中survivin与NF-κB的蛋白表达水平明显低于对照组和放射组(P < 0.01)(见图 2、表 6)。
分组 蛋白相对表达量 survivin NF-κB 对照组 1.12±0.05 1.00±0.06 放射组 0.64±0.08** 0.82±0.04* ATRA+放射组 0.31±0.03**## 0.57±0.08**## F 152.36 36.18 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.003 0.004 q检验:与对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与放射组比较##P < 0.01 表 6 各组H1299细胞survivin与NF-κB的蛋白表达情况(ni=3;x±s)
全反式维A酸对肺腺癌H1299细胞放射敏感性研究
Effect of all-trans retinoic acid on radiosensitivity of lung adenocarcinoma H1299 cells
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摘要:
目的探讨全反式维A酸(ATRA)对肺腺癌细胞株H1299放射敏感性影响及其分子机制。 方法MTT法检测ATRA对H1299细胞存活率的影响;平板克隆形成实验检测H1299细胞的放射敏感性;流式细胞术检测细胞周期;Western blotting检测survivin与NF-κB的蛋白表达情况。 结果不同浓度ATRA对H1299细胞均有抑制作用,浓度为10 μmol/L时最佳(P < 0.05)。相对单独ATRA处理,10 μmol/L ATRA联合不同剂量的射线照射后,细胞生长抑制率明显增加(P < 0.01)。ATRA作用和射线照射后的细胞凋亡增多(P < 0.01),ATRA联合射线照射作用后的细胞总凋亡率明显高于单纯射线照射(P < 0.01)。与对照组、放射组、ATRA组相比,ATRA+放射组G0/G1期比例明显增加(P < 0.01)。与放射组相比,ATRA+放射组的细胞存活分数值降低,ATRA可以增加肺腺癌H1299细胞放射敏感性,增敏比为1.406。Western blotting结果显示,ATRA+放射组细胞survivin、NF-κB蛋白表达明显降低(P < 0.01)。 结论ATRA对肺腺癌H1299细胞具有放射增敏作用,其机制可能与ATRA直接抑制H1299细胞增殖、促进H1299细胞凋亡,下调survivin及NF-κB蛋白表达有关。 Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of all-trans retinoic acid(ATRA) on the radiosensitivity of lung adenocarcinoma cell line H1299, and explore its possible molecular mechanisms. MethodsMTT assay was used to determine the effects of ATRA on the survival rate of H1299 cells, the radiosensitivity of H1299 cells was detected using plate cloning formation experiment, the H1299 cell cycle was detected using flow cytometry and the protein expression levels of survivin and NF-κB in the cells were detected using Western blotting. ResultsThe H1299 cells could be inhibited by ATRA at different concentrations, and the best concentration of which was 10 μmol/L(P < 0.05).Compared with the cells treated with ATRA alone, 10 μmol/L ATRA combined with different doses of radiation, the inhibition rate of cell growth significantly increased(P < 0.01), the number of cell apoptosiss increased(P < 0.01), and the total apoptosis rate of ATRA combined with radiation was significantly higher than that of ATRA alone(P < 0.01).Compared with the control group, radiation group, and ATRA group, the proportion of G0/G1 phase in ATRA combined with radiation group significantly increased(P < 0.01).Compared with the radiation group, the cell survival fraction in ATRA combined with radiation group decreased, and ATRA could increase the radiosensitivity of lung adenocarcinoma H1299 cells with a sensitization ratio of 1.406.The results of Western blotting showed that the expression levels of survivin and NF-κB in H1299 cells significantly decreased in ATRA combined with radiation group(P < 0.01). ConclusionsATRA can increase the radiosensitivity of lung adenocarcinoma H1299 cells, and the mechanism may be related to ATRA directly inhibiting the proliferation of H1299 cells, promoting the apoptosis of H1299 cells and down-regulating the survivin protein and NF-κB protein expression. -
Key words:
- lung neoplasms /
- all-trans retinoic acid /
- radiosensitivity
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表 1 ATRA抑制H1299细胞生长(ni=6;x±s)
分组 生长抑制率/% F P MS组内 24 h 48 h 72 h 对照组 101.52±2.09 102.17±3.15 102.89±1.76 0.24 >0.05 5.796 ATRA组/(μmol/L) 1.25 76.18±3.83** 70.27±4.32** 62.18±2.83**■■ 10.75 < 0.01 13.780 5 65.46±1.87**## 59.86±2.86**#■ 42.46±3.87**##■■△△ 48.57 < 0.01 8.884 10 58.54±3.04**##▲▲ 50.55±2.27**##▲■ 37.54±4.04**##■■△△ 32.92 < 0.01 10.239 F 134.18 144.48 249.97 — — — P < 0.01 < 0.01 < 0.01 — — — MS组内 7.944 10.479 10.601 — — — q检验:与对照组比较**P < 0.01;与ATRA 1.25 μmol/L组比较#P < 0.05,##P < 0.01;与ATRA 5 μmol/L组比较▲P < 0.05, ▲▲P < 0.01;与24 h比较■P < 0.05, ■■P < 0.01;与48 h比较△△P < 0.01 表 2 射线单独照射和10 μmol/L ATRA联合射线照射对H1299细胞存活的影响(ni=3;x±s)
放射剂量/Gy 存活率/% t P 单纯放射组 10 μmol/L ATRA+放射组 0 0.87±0.03 0.75±0.03 4.90
< 0.014 0.47±0.07** 0.24±0.02** 5.47 < 0.01 8 0.10±0.02**## 0.02±0.002**## 6.89 < 0.01 10 0.04±0.008**##▲▲ 0.002±0.0006**##▲▲ 8.20 < 0.01 F 282.12 1 117.69 — — P < 0.01 < 0.01 — — MS组内 0.002 0.000
—— q检验:与0 Gy组比较**P < 0.01;与4 Gy组比较##P < 0.01;与8 Gy组比较▲▲P < 0.01 表 3 ATRA及ATRA联合射线照射诱导H1299细胞凋亡情况(ni=3;x±s)
分组 凋亡率/% 对照组 0 放射组 23.70±2.13 ATRA组 27.80±3.08* ATRA+放射组 43.56±2.76**##▲▲ F 54.59 P < 0.01 MS组内 5.426 q检验:与对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与放射组比较##P < 0.01;与ATRA组比较▲▲P < 0.01 表 4 ATRA及ATRA联合射线照射对H1299细胞周期的影响(ni=3;x±s)
分组 周期分布/% G0/G1 S G2/M 对照组 10.00±0.91 60.20±0.87 30.80±1.78 放射组 26.52±0.22** 39.27±3.17** 35.73±2.95# ATRA组 63.64±3.99**## 5.98±1.62**## 30.38±2.37 ATRA+放射组 42.30±1.98**##▲▲ 4.86±4.17**##▲▲ 52.81±2.19**##▲▲ F 302.93 283.39 59.79 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 5.179 7.705 5.571 q检验:与对照组比较**P < 0.01;与放射组比较##P < 0.01;与ATRA组比较▲▲P < 0.01 表 5 ATRA对H1299细胞放射敏感性影响
分组 D0 /Gy Dq/Gy N SF2 k 增敏比 放射组 2.463 2.157 2.871 0.765 0.611 — ATRA+放射组 1.751 1.651 3.167 0.512 0.859 1.406 表 6 各组H1299细胞survivin与NF-κB的蛋白表达情况(ni=3;x±s)
分组 蛋白相对表达量 survivin NF-κB 对照组 1.12±0.05 1.00±0.06 放射组 0.64±0.08** 0.82±0.04* ATRA+放射组 0.31±0.03**## 0.57±0.08**## F 152.36 36.18 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.003 0.004 q检验:与对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与放射组比较##P < 0.01 -
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