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肝脏手术特别是肝移植手术中常出现肝缺血/再灌注(I/R)的操作过程，这可导致肺脏等多器官的损伤，严重者出现功能衰竭。肝脏手术I/R所致急性肺损伤的发病机制目前尚不清楚。山莨菪碱为M胆碱受体拮抗剂，研究[1]证实其对多个器官I/R损伤具有良好的保护作用。本研究制作70%肝脏I/R损伤模型，以山莨菪碱进行预处理，旨在探讨山莨菪碱预处理对大鼠肝I/R诱发肺损伤的影响，为临床防治研究提供理论支持。
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本实验选择健康清洁成年雄性SD大鼠48只，体质量210~280 g，由西安交通大学医学部动物实验中心提供。盐酸消旋山莨菪碱注射液(天津金耀氨基酸有限公司，批号：1409051)；SP试剂盒购自北京中山生物技术有限公司；丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)与超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京生物建成工程研究所；图像采集系统、光学显微镜等由西安交通大学医学院病理学实验室提供。
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48只大鼠按随机数字表法平均分成3组，分别为假手术组(S组)、肝脏缺血再灌注组(IR组)和山莨菪碱预处理组(A组)，每组16只。S组：大鼠开腹后分离肝门不做结扎；IR组：大鼠开腹后结扎肝门，60 min后恢复肝脏血流，开放血流3 h后处死大鼠；A组：制模过程同IR组，阻断入肝血流前30 min，自尾静脉注射稀释成1 mL的山莨菪碱(约2 mg/kg)，其余同IR组。S组和IR组自尾静脉注射等剂量的0.9%氯化钠溶液。
按NAUTA等[2]的方法制作70%肝脏I/R模型：动物于术前禁食12 h，自由饮水，采用腹腔内注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，2~4 min后以钳夹四肢无反应作为麻醉成功标志，然后将大鼠仰卧位固定于操作台上。经阴茎背静脉注入稀释肝素(200 U/kg)，使其肝素化。自腹下部沿正中线纵行向上剪开皮肤，直至胸腹交界处。逐层打开腹腔，分离肝门及肝十二指肠韧带，寻找到肝门，IR组和A组用小动脉夹夹闭肝左叶和肝中叶部分肝门，30 min后松开小动脉夹肝脏恢复血流，然后逐层关闭腹腔，3 h后处死大鼠。S组只解剖，肝门不作血管夹闭。
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大鼠处死后，取右肺上叶置于10%中性甲醛溶液浸泡固定，待行HE染色和免疫组织化学(免疫组化)。取右肺下叶组织，称重为湿重，然后放入70 ℃烤箱中烘烤48 h后，称重为干重，计算肺组织湿重/干重(W/D)比值。取部分右肺组织用滤纸吸干，置于-70 ℃冰箱保存，待进一步检测MDA含量、MPO和SOD活性。
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取部分肺组织经过脱蜡，水化，染色，脱水，透明，封片，在100倍和400倍光镜下观察肺组织病理形态学变化，采集图像。
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取部分右上叶肺组织标本，石蜡包埋，制成3 μm厚的切片。SP法免疫组化染色按SP试剂盒操作说明实施。随机抽取上述切片，以PBS代替HO-1和iNOS多克隆抗体作为阴性对照(其余步骤不变)。全自动图像分析系统对阳性染色进行分析，测定HO-1和iNOS阳性表达的吸光度值，随机测定5个高倍视野，计算其平均值作为该切片的代表值。
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取部分肺组织50 mg用冷0.9%氯化钠溶液制成肺组织匀浆，4℃ 3 000 r/min离心10 min，上清液-80 ℃保存，检测前再次离心取上清液；用试剂盒分别采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量、黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性和过氧化氢还原法测定MPO活性，严格按照试剂盒说明书操作步骤进行检测。
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采用单因素方差分析和q检验。
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S组双肺组织表面光滑，呈淡粉红色，打开胸腔后很快萎缩；IR组肺脏体积增大颜色变深，组织包膜下可见点状、片状出血灶，肺泡腔有渗出液；A组肺组织轻度增大，肺组织可见点状、片状出血灶，但较IR组轻。
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S组肺组织结构完整，未见明显的异常，肺泡腔完整，由单层肺泡上皮细胞组成；IR组肺组织血管充血，肺泡腔破裂且大小不一，可见红色渗出液，肺间质增厚水肿，有大量炎性细胞浸润；A组肺组织可见充血水肿，肺间质增厚有炎性细胞浸润，但较IR组轻(见图 1)。
图 1 光镜下3组肺组织HE染色结果
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光镜下，IR组、A组大鼠肺组织肺泡上皮细胞、肺间质炎性细胞及血管内皮细胞等细胞内HO-1的表达呈阳性(呈棕黄色)，A组表达最强，S组表达最弱(呈弱阳性)。与S组比较，IR组和A组肺组织HO-1蛋白表达均明显增加(P < 0.01)；与IR组比较，A组肺组织HO-1蛋白表达明显增加(P < 0.01)(见表 1、图 2)。
分组 n HO-1 iNOS S组 16 0.036±0.008 0.021±0.007 IR组 16 0.165±0.013** 0.136±0.012** A组 16 0.202±0.016**△△ 0.078±0.014**△△ F — 745.46 407.98 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.000 2 0.000 1 q检验：与S组比较**P < 0.01；与IR组比较△△P < 0.01 表 1 3组大鼠肺组织HO-1和iNOS蛋白表达的比较(x ±s)
图 2 镜下3组肺组织HO-1蛋白表达
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光镜下，IR组和A组大鼠肺组织中肺泡间质的血管平滑肌细胞、单核-巨噬细胞、支气管上皮细胞、血管内皮细胞等胞内iNOS的表达呈阳性(呈棕黄色)，IR组表达最强，S组表达最弱(呈弱阳性)。与S组比较，IR组和A组肺组织iNOS蛋白表达均明显增加(P < 0.01)；与IR组比较，A组肺组织iNOS蛋白表达明显降低(P < 0.01)(见表 1、图 3)。
图 3 镜下3组肺组织iNOS蛋白表达
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与S组比较，IR组和A组肺组织W/D比值、MDA含量、MPO活性均明显增高(P < 0.01)，SOD活性均明显降低(P < 0.01)；与IR组相比较，A组肺组织W/D比值、MDA含量、MPO活性均明显降低(P < 0.01)，SOD活性明显增高(P < 0.01)(见表 2)。
分组 n W/D比值 MDA/(nmol/mg) MPO/(U/g) SOD/(U/mg) S组 16 2.99±0.32 1.22±0.25 1.36±0.80 94.52±8.11 IR组 16 6.16±0.82** 2.96±0.44** 5.12±1.28** 68.45±9.82** A组 16 4.42±0.78**△△ 2.06±0.35**△△ 3.18±1.12**△△ 81.33±9.22**△△ F — 87.46 96 48.04 32.99 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.461 0.126 1.178 82.404 q检验：与S组比较**P < 0.01；与IR组比较△△P < 0.01 表 2 3组肺组织W/D比值、MDA含量、MPO和SOD活性的比较(x ±s)
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肝脏I/R损伤在临床上十分常见，创伤、休克、肝叶切除、肝移植等过程中都有可能发生, 不仅引起肝脏本身的损害，还可导致远隔器官如肺、肾、小肠等器官的功能受损，肺脏是其中最易受累的器官之一。我们的前期研究[3]发现，肝I/R损伤能加重大鼠肺损伤，上调肺组织中的HO-1及iNOS表达。本实验研究结果显示，与S组比较，IR组和A组肺组织HE染色病理改变显著加重，肺叶W/D比显著升高，肺组织MDA、MPO表达显著升高，而SOD显著降低，表明肝I/R过程中造成了肺损伤。
山莨菪碱是提取自茄科植物山莨菪中的一种生物碱，与阿托品等莨菪烷类药物同属于M胆碱受体拮抗剂[4]。主要用于治疗胃肠道痉挛收缩所引起的腹痛、感染中毒性休克等[5]。近年来研究[6]发现山莨菪碱对生命重要器官脑、肝、肾、心等器官的I/R损伤具有良好的保护作用，但其机制尚不清楚。研究[7-8]证实山莨菪碱对大鼠肝脏I/R损伤有保护作用，其机制可能是山莨菪碱能改善再灌注后的肝脏微循环障碍、减少氧自由基的生成。山莨菪碱可能通过抑制细胞因子肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-1等的释放，抑制中性粒细胞聚集和氧自由基的产生、稳定细胞膜和溶酶体膜、改善和疏通微循环等作用，对重要器官I/R损伤发挥保护作用[9]。实验过程中我们发现，山莨菪碱对I/R的肝脏具有保护作用。山莨菪碱是否对肝脏I/R损伤过程中肺损伤具有保护作用，目前尚少报道。因此，本实验首先建立70%肝脏I/R损伤模型，探讨山莨菪碱预处理对大鼠肝I/R诱发肺损伤的保护作用。
本研究参照文献[7-8]确定山莨菪碱剂量为2 mg/kg进行预处理，结果表明，与IR组比较，A组肺组织HE染色病理改变显著减轻，肺叶W/D比显著降低，肺组织MDA、MPO表达显著降低，而SOD表达显著升高，表明山莨菪碱预处理对肝脏I/R后肺损伤具有一定的保护作用。
HO-1又称热休克蛋白32 (HSP32)，是血红素的限速酶和关键酶，有研究[10]表明HO-1活性的上调，可产生抗炎、抗氧化、抗凋亡等生物学效应，对肝脏I/R损伤起重要的保护作用[10]。iNOS主要存在炎性细胞中，是一种重要炎性介质，病理状态下iNOS受炎性介质诱导生成增加，可产生大量NO，然而病理情况下大量的NO参与介导许多病理过程如肝脏I/R损伤、炎症及休克等，导致器官损伤[11]。本实验研究发现，与S组比较，IR组和A组的HO-1和iNOS蛋白表达显著增加；与IR组比较，A组的HO-1蛋白表达显著增加，而iNOS蛋白表达显著降低。表明肝脏I/R损伤后肺组织中HO-1和iNOS蛋白表达都显著增加，而山莨菪碱预处理可以显著增加HO-1蛋白表达和减少iNOS蛋白表达，这可能与山莨菪碱预处理能减轻肝脏I/R后肺损伤的机制有关。
综上所述，山莨菪碱预处理可减轻大鼠肝I/R肺损伤，其机制可能与上调肺组织中的HO-1及下调iNOS蛋白表达有关。但肝脏I/R肺损伤是个多环节构成、多因素参与的复杂过程，是否存在其他方面的因素，有待我们进一步研究。
山莨菪碱预处理对大鼠肝缺血再灌注诱发肺损伤的影响
Effect of anisodamine pretreatment on the lung injury induced by hepatic ischemia-reperfusion in rats
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摘要:
目的探讨山莨菪碱预处理对大鼠肝缺血再灌注诱发肺损伤的影响。 方法48只SD健康雄性大鼠，采用随机数字表法，分为假手术组(S组)、肝缺血再灌注组(IR组)和山莨菪碱预处理组(A组)，各16只。S组只做解剖肝门，IR组和A组制备70%大部分肝缺血再灌注损伤模型。A组于阻断肝血流前30 min，静脉注射山莨菪碱2 mg/kg，S组和IR组静脉注射等剂量的0.9%氯化钠溶液。大鼠于再灌注后3 h处死，取肺脏组织，HE染色，光镜下观察病理学结果。计算肺湿/干重(W/D)比值。采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)，氧化氢还原法测定髓过氧化物酶(MPO)的表达；采用免疫组织化学法测定肺组织血红素氧合酶-1(HO-1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白的表达。 结果肺组织HE染色病理改变，IR组和A组肺损伤较S组重，A组肺损伤较IR组轻；与S组比较，IR组和A组肺组织W/D比值、MDA含量、MPO活性、HO-1和iNOS蛋白表达均明显增高(P < 0.01)，SOD活性明显降低(P < 0.01)；与IR组比较，A组肺组织W/D比值、MDA含量、MPO活性、iNOS蛋白表达均明显降低(P < 0.01)，肺组织HO-1蛋白表达和SOD活性均明显升高(P < 0.01)。 结论山莨菪碱预处理可减轻大鼠肝缺血再灌注诱发的肺损伤。 Abstract:Objective To investigate the effects of anisodamine pretreatment on the lung injury induced by hepatic ischemia-reperfusion in rats. Methods Forty-eight healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the sham operation group(group S), hepatic ischemia-reperfusion group(group IR) and anisodamine group(group A) using a random number table(16 rats each group).The hepatic portal in group S was dissected, and the ischemia-reperfusion model of 70% liver in group IR and group A were established.The group A was injected with 2 mg/kg anisodamine before 30 min of blocking liver blood flow and the group S and group IR were injected with the same volume of 0.9% sodium chloride solution.The rats were sacrificed after 3 h of reperfusion, the lung tissue was harvested, stained using HE, and the result of which was observed under light microscope.The ratio of wet to dry(W/D) of lung weight was calculated.The levels of malondialdehyde(MDA), superoxide dismutase(SOD) and myeloperoxidase(MPO) in lung tissue were detected using thiobaituricacid, xanthinoxidase and Hydrogen oxide reduction method, respectively.The expression levels of heme oxygenase-1(HO-1) and inducible nitric oxide synthase(iNOS) in lung tissue were determined by immunohistochemistry. Results The Results of HE staining in lung tissue showed that the lung injury in IR and A groups were more serious than that in group S, and the lung injury in group A was lighter than that in group IR.Compared with the group S, the ratio of W/D, MDA content, MPO activity and HO-1 and iNOS protein expression level significantly increased(P < 0.01), and the SOD activity significantly decreased in IR and A groups(P < 0.01).Compared with the group IR, the ratio of W/D, MDA content, MPO activity and iNOS protein expression level significantly decreased(P < 0.01), and the HO-1 protein level and SOD activity in lung tissue significantly increased in group A(P < 0.01). Conclusions Anisodamine pretreatment can alleviate the lung injury induced by hepatic ischemia-reperfusion in rats. -
Key words:
- hepatic ischemia-reperfusion /
- anisodamine /
- pretreatment /
- lung injury
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表 1 3组大鼠肺组织HO-1和iNOS蛋白表达的比较(x ±s)
分组 n HO-1 iNOS S组 16 0.036±0.008 0.021±0.007 IR组 16 0.165±0.013** 0.136±0.012** A组 16 0.202±0.016**△△ 0.078±0.014**△△ F — 745.46 407.98 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.000 2 0.000 1 q检验：与S组比较**P < 0.01；与IR组比较△△P < 0.01 
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表 2 3组肺组织W/D比值、MDA含量、MPO和SOD活性的比较(x ±s)
分组 n W/D比值 MDA/(nmol/mg) MPO/(U/g) SOD/(U/mg) S组 16 2.99±0.32 1.22±0.25 1.36±0.80 94.52±8.11 IR组 16 6.16±0.82** 2.96±0.44** 5.12±1.28** 68.45±9.82** A组 16 4.42±0.78**△△ 2.06±0.35**△△ 3.18±1.12**△△ 81.33±9.22**△△ F — 87.46 96 48.04 32.99 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.461 0.126 1.178 82.404 q检验：与S组比较**P < 0.01；与IR组比较△△P < 0.01
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