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随着现代社会交通的发展，高能量损伤及多发性软组织损伤愈来愈多见。外固定支架在治疗严重软组织损伤及复杂开放性下肢骨折有其独特优势，但其大量应用的同时所带来的各种并发症也越来越引起人们重视。其中，应用外固定支架最常见的并发症为钉道感染，研究[1-2]显示, 临床工作中这种并发症的发生率甚至超过了50%，而且采用外固定支架治疗的病人中有1%发生了严重的钉道感染。外固定支架固定的稳定性是其最关键和最基本的要求，而钉道感染可造成螺钉松动影响外固定架的稳定性，甚至会导致骨髓炎，严重影响病人的病情恢复[3]，因此寻找更好的预防钉道感染的方法具有重要意义。
随着新一代材料的问世及对微生物致炎机制理解的加深，研究[4-5]证实二氧化钛(TiO2)的光催化特性可有效抑制细菌增殖，并且此类特性已被广泛地应用于水质、土壤和空气净化、自清洁等多种领域。本实验旨在采用阳极氧化技术制作TiO2涂层钛螺钉，通过建立兔胫骨骨折合并金黄色葡萄球菌感染模型，对比观察术后兔感染、日常活动等一般情况，定期进行影像学检查，通过HE染色、细菌培养等检查，评价TiO2涂层外固定支架钛螺钉的抗菌效果。
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采用阳极氧化法制备TiO2涂层。经过抛光和超声波清洗后，采用含有0.3wt%NH4F和2vol%H2O的乙二醇电解液，采用阳极氧化法制作TiO2涂层，阳极氧化时间控制在3.5~4 h。通过X射线衍射分析(ESCA5800，ULVAC-PHI，Chigasaki，日本)和扫描电镜(日本日立S-4800，东京，日本)分别评价TiO2涂层的纯度和厚度。
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取普通钛螺钉和经阳极氧化处理过的TiO2涂层螺钉各5枚进行抑菌实验，分为普通螺钉组(TS组)和TiO2涂层组(TC组)。将螺钉进行常规高温高压灭菌后放置在已接种金黄色葡萄球菌菌株(金黄色葡萄球菌ATCC25920，中原生物)的固体培养基中。整个操作过程中在超净台下完成，避免杂菌污染。将固体培养基放置恒温箱(37℃)中孵化(加常规光照)，10 h后观察抑菌圈直径。
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30只新西兰大耳白兔(雄性)SPF环境下适应性喂养1周(新西兰大耳白兔达3月龄)确定健康后，随机分为钉道组(MO组)和TiO2涂层螺钉组(TG)各15只，将饲养观察1周后的新西兰大耳白兔固定在手术台上，自耳缘静脉注射3%戊巴比妥注射液(剂量1 mL/kg)，麻醉成功后，右小腿外侧剃毛，聚维酮碘溶液消毒皮肤，铺一次性无菌巾，带无菌手套，自右胫骨膑下外侧纵行切开长约2.5 cm的切口，切开皮肤皮下达骨膜，钝性剥离并切除骨膜，显露胫骨干骺端至胫骨中段，2.7 m钻头高速钻孔至对侧(2孔，间距为4 mm)，胫骨中段2.0 m钻头高速钻孔至对侧(2孔，间距为4 mm)。植入外固定架，胫骨干骺端TG组和MO组分别植入TiO2涂层螺钉和普通螺钉；胫骨中段2组均植入普通螺钉。选取胫骨中上段线横行锯断胫骨，冲洗后逐层缝合。术后在胫骨干骺端钉道处2组分别滴入0.1 mL 1×108 CFU/mL的ATCC25920金黄色葡萄球菌菌液。术后动物隔离分笼饲养，自由饮食。兔笼常规日光灯光照。
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观察动物术后感染、日常活动等情况，对术后1 d、第1周、第4周外固定架拍照2次(注意包含钉道周围软组织)。每张钉道照片采用盲法评估软组织炎性程度，钉道感染软组织炎性程度评分见图 1。3个本课题组成员评分后取均值。软组织炎性评分见表 1[6]。
图 1 钉道感染严重程度评分参考
观察指标 分值/分 皮下脓肿形成 有 3 可疑 1.5 无 0 钉道周围渗出 有 2 可疑 1 无 0 钉道周围红肿 有 1 可疑 0.5 无 0 表 1 钉道炎性程度评分
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术后1 d、1周及4周时，TG组和MO组分别随机处死兔子5只，拔除外固定架后，迅速将无菌棉签插入胫骨干骺端螺钉钉道内，5 min后取出放入25 mL 0.85%氯化钠溶液的离心管中，放入均质器(8 000 r/min处理2 min)混匀。然后通过Baird-Parker平板计数法进行细菌计数，将1/10、1/100和1/1 000的稀释液接种到Baird- Parker琼脂平板中，置于37 ℃恒温箱中16 h，计算细菌数量。
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术后1 d、1周、4周末行胫骨X线检查，对比骨折端对位情况，观察骨折端骨痂生长情况，判断骨折端愈合的差异。
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术后1 d、1周、4周末取钉道周围软组织和骨组织进行石蜡包埋固定，HE染色。HE染色病理切片平面与钉道轴线平行且经过钉道边缘，以便于由浅及深观察钉道周围软组织感染以及骨组织炎性浸润情况。
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采用t(或t′)检验。
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能谱分析表明，氧原子与钛原子的摩尔比约为2: 1，在钛螺钉表面形成的材料是TiO2。扫描电子显微镜测量显示氧化产生的TiO2膜均匀，膜厚约为2 μm(见图 2)。
图 2 普通钛钉(左)和TiO2涂层螺钉(右)的外观比较
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10 h后琼脂培养基菌落开始形成(见图 3A、图 3B)。TiO2涂层螺钉周围可见明显抑菌圈，而普通螺钉未见明显抑菌圈。TC组的抑菌圈半径(测量抑菌圈半径，以螺钉中央为点，垂直于螺钉轴分别测量螺钉中央距离两侧抑菌圈的距离)较TS组大[(2.96±2.86)cm vs (33.96±6.10)cm，t=10.29, P<0.01], TiO2涂层螺钉在可见光照下较普通钛螺钉能够明显抑菌。
图 3 抑菌试验结果
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术后1 d、1周和4周软组织炎性程度评分MO组均高于TG组(P<0.05~P<0.01)(见表 2)。
分组 n 术后1 d 术后1周 术后4周 MO组 5 3.70±0.21 5.50±0.69 5.80±0.25 TG组 5 2.20±0.97 1.60±0.46 1.70±0.55 t — 3.38* 10.52 15.17 P — < 0.05 < 0.01 < 0.01 *示t′值 表 2 2组钉道感染软组织外观评分比较(x±s；分)
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术后1 d细菌数(对数值)2组差异无统计学意义(P>0.05)。术后1周和术后4周，TG组细菌数量(对数值)均较MO组下降(P<0.01)(见表 3)。
分组 n 术后1 d 术后1周 术后4周 MO组 5 3.93±0.91 5.26±1.07 7.46±0.64 TG组 5 3.47±0.64 2.85±0.66 3.20±0.94 t — 0.97 4.28 8.37 P — >0.05 < 0.01 < 0.01 表 3 2组钉道分泌物细菌培养计数比较(x±s；log10x)
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胫骨X线摄片结果显示，术后1周时TG组(见图 4A)较MO组(见图 4B)对位好，且骨痂量较MO组多，TG组1周时骨折线开始模糊，而MO组骨折线仍较清晰。4周时，TG组(见图 4C)骨折端已到达骨性愈合，骨折端对位对线可；MO组(见图 4D)骨折端位移仍较明显，骨折线已模糊，但骨髓腔尚未相通，未达到骨性愈合。
图 4 2组X线下骨折愈合情况
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MO组在术后1 d时软组织HE染色可见大量中性粒细胞、淋巴细胞及浆细胞浸润；1周时炎性细胞浸润更明显，局部可见灶状坏死；4周时钉道内可见大量渗出物，纤维组织增生和灶状坏死并存。而TG组软组织HE染色则仅在钉道周围见少量炎性细胞浸润(见图 5)。骨组织的HE染色，MO组术后1 d、1周、4周均表现为钉道内大量炎性细胞浸润，部分骨组织螺纹破坏吸收；而TG组则表现为钉道螺纹清晰无破坏及吸收现象，钉道内炎性细胞渗出较少(见图 6)。
图 5 各组钉道软组织典型组织学表现(HE染色）
图 6 各组钉道软组织典型组织学表现(HE染色）
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大量实验[7-9]表明，TiO2可以在可见光紫外线波段下产生氧自由基，从而抑制细菌的增殖和黏附。可以推测，TiO2的光催化抗菌特性可能用于防止钉道感染。在紫外光下，TiO2材料可以产生具有强大氧化还原能力的电子空穴对，该电子空穴继而与周围的水及氧气产生活性氧类等一系列羟基基团结合，短时间内达到去污和杀菌的目的。ZUCCHERI等[10]则通过实验证实，虽然紫外光只占日光总量的4%左右，但是可见光中的紫外部分就足以被TiO2利用借以催化杀菌，而涂层的纳米程度则可增加光催化的效率。本实验中，我们用阳极氧化法制作的TiO2涂层螺钉在可见光下显示出明显地抑菌效果。一般来说，螺钉周围的皮肤是防止微生物入侵的第一道重要防线。我们的研究揭示了TiO2涂层螺钉可以有效的预防钉道感染，且有持续的抗菌效果。KOSEKI等[11]研究发现，TiO2涂层螺钉的光催化特性在大鼠模型中具有良好的效果，具有显著的抑菌能力(76.7%抑制)。本文结果发现术后1 d，TG组的细菌数就少于MO组，而且在第1周和第4周，TG组细菌数则明显少于MO组，显示TiO2涂层螺钉良好持久的抗菌效果。HE染色结果显示，TiO2组炎症细胞浸润较少，与细菌计数结果较吻合。MO组也出现骨质破坏局部区域，但TG组无此变化。由于过度的炎症反应和骨质破坏，螺钉松动引起的细菌侵入的高风险造成钉道感染的恶性循环，最终导致螺钉不稳定，造成骨折端的活动，影响骨折的愈合。
与其他材料不同，TiO2涂层的螺钉仅仅在螺钉穿过皮肤的表面光催化起到杀菌作用，这些区域也恰好是细菌侵入机体造成钉道感染甚至骨髓炎的“门户”。抗生素涂层及银涂层在整个螺钉所有区域都发挥杀菌作用，这也是造成细菌对银离子及局部应用抗生素耐药的原因[12]；而在本实验设计中，螺钉仅在可见光覆盖的皮肤表面发挥作用，且TiO2只作为催化生成自由基的媒介本身并不消耗，不仅保证了长期应用的杀菌效果，更避免了耐药菌株及局部富集各类离子或抗生素所造成的机体毒性，有可能解决抗生素耐药的难题。当然，钉道感染的发生同样受到机体免疫力、合并糖尿病与否、创伤初期局部组织皮肤条件等因素的制约，都有待于进一步研究。
二氧化钛涂层外固定支架钛螺钉预防钉道感染的实验研究
Study on the external fixator of titanium dioxide-coated screw in preventing pinhole infection
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摘要:
目的评估二氧化钛涂层螺钉的抑菌能力，观察其用于外固定支架对骨折钉道感染的治疗效果。 方法制备二氧化钛涂层螺钉, 体外进行抑菌实验。新西兰大耳白兔30只，随机分为钉道(MO)组和二氧化钛涂层螺钉(TG)组各15只，建立骨折合并钉道感染模型，术后定期分别摄X片、拍照、取材进行HE染色，细菌培养和计数。 结果TC组的抑菌圈半径为(2.96±2.86)cm，大于TS组(33.96±6.10)cm(P < 0.01)。术后1 d、1周和4周MO组软组织炎性评分均高于TG组(P < 0.05~P < 0.01)。术后1 d细菌数(对数值)2组差异无统计学意义(P>0.05)；术后1周和4周TG细菌数量(对数值)均较MO组下降(P < 0.01)。术后1 d、1周、4周，MO组均有大量炎性细胞浸润且逐渐增多，而TG组仅见少量炎性细胞浸润；MO组均表现为部分骨组织螺纹破坏吸收；TG组则均表现为钉道螺纹清晰无破坏及吸收。X线示，TG组1周时骨折线开始模糊，而MO组骨折线仍较清晰；4周时，TG组骨折端已达骨性愈合，MO组骨折端位移仍较明显，未达骨性愈合。 结论二氧化钛涂层螺钉有光催化杀菌作用，用于外固定支架可有效预防骨折钉道感染。 Abstract:Objective To evaluate the antibacterial activity of titanium dioxide-coated screw, and observe its effects on pinhole infection in external fixator treating fractures. Methods Titanium dioxide-coated screw was prepared, and its antibacterial experiment was performed in vitro.Thirty New Zealand white rabbits were randomly divided into the pinhole group(MO group) and titanium oxide-coated screw group(TG group)(30 rabbits each group).A fracture complicated with pinhole infection model was established.Two groups were treated with taking X-ray, taking photo, harvesting materials for HE staining, culturing bacteria and counting. Results The bacteriostatic radius in TG group[(2.96±2.86)cm] was greater that in MO group[(33.96±6.10)cm] (P < 0.01).The inflammation scores of soft tissue in MO group after 1 d, 1 week and 4 weeks were higher that in TG group(P < 0.05 to P < 0.01).The difference of bacteria count after 1 d of operation between two groups was not statistically significant(P>0.05), which in TG group after 1 week and 4 weeks of operation decreased compared with the MO group(P < 0.01).A large number of inflammatory cells infiltrated, and gradually increased in MO group after 1 d, 1 week and 4 weeks of operation, and a few inflammatory cells infiltrated in TG group.Partial bone tissue with thread destroy absorption in MO group, and pinhole with clear and no damage and absorption in TG group were identified.At the first week, X-ray findings showed that fracture line began to blur in TG group, while fracture line in MO group remained clear.At the fourth week, the fractures in TG group had reached the bony union, and the displacement of the fracture end in MO group was still obvious and did not reach bony union. Conclusions Titanium dioxide-coated screw has a photocatalytic bactericidal effect, which can effectively prevent the pinhole infection in external fixator treating fracture. -
Key words:
- external fixator /
- pinhole infection /
- fracture /
- dioxide titanium /
- photocatalytic sterilization
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表 2 2组钉道感染软组织外观评分比较(x±s；分)
分组 n 术后1 d 术后1周 术后4周 MO组 5 3.70±0.21 5.50±0.69 5.80±0.25 TG组 5 2.20±0.97 1.60±0.46 1.70±0.55 t — 3.38* 10.52 15.17 P — < 0.05 < 0.01 < 0.01 *示t′值 
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表 3 2组钉道分泌物细菌培养计数比较(x±s；log10x)
分组 n 术后1 d 术后1周 术后4周 MO组 5 3.93±0.91 5.26±1.07 7.46±0.64 TG组 5 3.47±0.64 2.85±0.66 3.20±0.94 t — 0.97 4.28 8.37 P — >0.05 < 0.01 < 0.01
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图(6)表(3)
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