-
金银花即忍冬的干燥花蕾，味甘，性寒，具有清热解毒、疏风散热之功效。金银花的活性成分主要有黄酮类、有机酸类、挥发油、三萜类，其中以有机酸类的绿原酸、异绿原酸生物活性显著，具有抗菌(烟曲霉、大肠埃希菌)[1-2]、抗氧化、抗炎[3]、抗病毒，参与人体血小板凝集和凝血因子的生成等作用[4]。因此，有机酸类的活性成分一直是衡量金银花提取效率优劣的重要指标。
本实验参照文献[5-7]，优化了一个简便的高效液相色谱法(HPLC)同时检测金银花中绿原酸及异绿原酸A含量的方法，并采用正交设计的方法探讨金银花提取工艺的最佳条件。王玥等[8-9]运用HPLC法已验证绿原酸作为单一指标回流法显著优于超声法，在这基础上，我们将超声波与传统醇回流提取联用，一方面利用超声波技术的空化作用，能有效缩短整个提取工艺的时间，提高提取效率，另一方面拟解决回流法弥补超声波提取绿原酸量低的问题。现作报道。
-
金银花药材购自亳州市永刚饮片厂有限公司；绿原酸对照品(批号110753-201716)购自中国食品药品检定研究院，异绿原酸A对照品(批号B21539，纯度≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸、95%乙醇为分析纯，水为屈臣氏饮用水。
-
戴安U3000型高效液相色谱仪(包括HPG-3400SD泵，自动进样器，DAD-3000型检测器，Chromeleon 7.0工作站)；Mettler Toledo XPE 205型分析天平(0.01 mg)，JP300G型超声波提取机组，FXB系列小型中药粉碎机，RE-52AA型旋转蒸发器，SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵。
-
Waters SunFire C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.4%磷酸溶液:乙腈为87: 13，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，检测波长326 nm，柱温40 ℃。
-
精密称取绿原酸对照品10.390 mg、异绿原酸A对照品9.995 mg，分别置25 mL棕色容量瓶中，加50 %甲醇超声溶解稀释至刻度，制成质量浓度分别为415.60、399.80 μg/mL的绿原酸、异绿原酸A对照品的储备液。分别精密移取绿原酸、异绿原酸A各2 mL定容于25 mL的棕色容量瓶中，制成每1 mL含绿原酸33.248 μg、异绿原酸A 31.984 μg的混合对照品溶液。
-
精密称定过五号筛的金银花细粉5.0 g，加15倍量乙醇[8]超声、回流提取，抽滤，减压浓缩至浸膏，用50%甲醇溶解并定容至50 mL，摇匀，4 000 r/min离心12 min，取上清液1 mL，用50%甲醇定容至25 mL后，再取3 mL定容至10 mL的棕色容量瓶中备用。
-
分别精密吸取混合对照品溶液2、4、5、8、10、12 μL按色谱条件进样，以峰面积Y为纵坐标，以进样量X(μg)为横坐标，计算绿原酸、异绿原酸A线性回归方程。
-
精密吸取混合对照品溶液10 μL，按色谱条件连续重复进样6次，计算绿原酸、异绿原酸A色谱峰面积的相对标准偏差(RSD)。
-
精密称定6份5.0 g金银花药材细粉，60%乙醇经200 W超声15 min处理，0.5 h回流提取1次，按1.2.1.3项制备供试品溶液，记录峰面积，计算RSD。
-
分别于0、2、4、8、12 h，精密吸取同一供试品溶液进样，计算色谱峰面积的RSD。
-
精密称取已知含量的药材粉末约50 mg，60%乙醇经200 W超声15 min处理，0.5 h回流提取1次，按1.2.1.3项制备供试品溶液，精密加入高、中、低3个不同浓度的对照品储备液适量，每个浓度各做3份，计算各自的含量。
-
精密称定金银花细粉(过五号筛)5.0 g，选用L9(34)正交表进行试验，因素与水平见表 1。药材加15倍量乙醇经超声处理1次，回流提取1次，抽滤，减压浓缩至浸膏，按1.2.1.3项制备供试品。
水平 因素 A乙醇浓度/% B回流时间/h C超声功率/W D超声时间/min 1 60 0.5 200 15 2 70 1.0 350 30 3 80 1.5 500 45 表 1 因素水平
-
在1.2.1.1项下测得混合对照品和供试品溶液分离度良好，色谱图见图 1。
图 1 混合对照品和供试品的色谱图
-
绿原酸在0.066 5~0.399 0 μg，异绿原酸A在0.064 0~0.383 8 μg的质量范围内线性关系良好。线性回归方程分别是，绿原酸：Y=34.085 84X+0.229 7 (r=0.999 91)，异绿原酸A：Y=40.246 95X+0.206 73(r=0.999 12)。
-
精密度：计算得绿原酸、异绿原酸A的RSD分别为0.32%、0.40%。表明仪器精密度良好。重复性：绿原酸、异绿原酸A的RSD分别为1.05%、1.17%。表明该方法的重复性良好。稳定性：绿原酸、异绿原酸A的RSD分别为0.45%，0.73%。表明供试品溶液在12 h内稳定。加样回收率实验：计算得到绿原酸、异绿原酸A的平均回收率分别是99.63%、100.18%，RSD分别为1.76%、1.89%(见表 2)。
成分 取样量/mg 样品含量/mg 加入量/mg 测得量/mg 回收率/% 平均回收率/%(RSD%) 绿原酸 49.985 1.306 6 0.831 2 2.124 8 98.44 49.945 1.305 6 0.831 2 2.142 7 100.71 50.010 1.307 3 0.831 2 2.121 2 97.92 49.995 1.306 9 1.039 0 2.371 6 102.47 49.980 1.306 5 1.039 0 2.316 4 97.20 99.63(1.76) 50.065 1.308 7 1.039 0 2.360 1 101.19 49.965 1.306 1 1.246 8 2.563 2 100.84 49.975 1.306 3 1.246 8 2.545 2 99.37 50.045 1.308 2 1.246 8 2.537 0 98.56 异绿原酸A 49.985 0.853 2 0.799 6 1.664 1 101.41 49.945 0.852 6 0.799 6 1.657 2 100.62 50.010 0.853 7 0.799 6 1.660 5 100.90 49.995 0.853 4 0.999 5 1.846 3 99.34 49.980 0.853 2 0.999 5 1.834 3 98.16 100.18(1.89) 50.065 0.854 6 0.999 5 1.867 1 101.30 49.965 0.852 9 1.199 4 2.095 0 103.56 49.975 0.853 1 1.199 4 2.039 2 98.89 50.045 0.854 3 1.199 4 2.023 5 97.48 表 2 加样回收率实验结果
-
绿原酸、异绿原酸A的提取结果：分别吸取正交试验条件下的供试品溶液按1.2.1.1项色谱条件进样，依法测定绿原酸、异绿原酸A的质量分数。对正交试验结果进行直观分析结果见表 3，方差分析见表 4~5。
试验号 A B C D 质量分数/(mg/g) 综合评分 绿原酸 异绿原酸A 1 1 1 1 1 26.14 17.07 96.95 2 1 2 2 2 26.10 16.79 96.07 3 1 3 3 3 27.24 17.43 100.00 4 2 1 2 3 25.65 15.83 92.49 5 2 2 3 1 26.05 17.34 97.56 6 2 3 1 2 25.38 16.31 93.37 7 3 1 3 2 23.58 16.55 90.76 8 3 2 1 3 24.97 16.87 94.23 9 3 3 2 1 23.85 15.91 89.42 绿原酸 K1 26.493 25.123 25.497 25.347 — — — K2 25.693 25.707 25.200 25.020 — — — K3 24.133 25.490 25.623 25.953 — — — R 2.360 0.584 0.423 0.933 — — — 异绿原酸A K1 17.097 16.483 16.750 16.773 — — — K2 16.493 17.000 16.177 16.550 — — — K3 16.443 16.550 17.107 16.710 — — — R 0.654 0.517 0.930 0.223 — — — 综合评分 K1 97.673 93.400 94.850 94.643 — — — K2 94.473 95.953 92.660 93.400 — — — K3 91.470 94.263 96.107 95.573 — — — R 6.203 2.553 3.447 2.173 — — — 表 3 正交试验安排及结果
因素 离均差平方和 自由度 均方 F P A 8.643 2 4.322 30.541 < 0.05 B 0.522 2 0.261 1.845 > 0.05 C(误差) 0.283 2 0.142 1.000 — D 1.346 2 0.673 4.756 > 0.05 表 4 绿原酸方差分析
因素 离均差平方和 自由度 均方 F P A 0.793 2 0.397 10.038 > 0.05 B 0.474 2 0.237 6.000 > 0.05 C 1.321 2 0.660 16.722 > 0.05 D(误差) 0.079 2 0.040 1.000 表 5 异绿原酸A方差分析
以绿原酸质量分数为指标进行直观分析(见表 3)，影响因素的顺序是A > D > B > C，即乙醇浓度 > 超声时间 > 回流时间 > 超声功率。最佳提取工艺为A1B2C3D3，即60%乙醇超声(功率500 W)45 min，再回流提取1 h。以偏差平方和最小的因素为误差项进行方差分析(C因素)(见表 4)。结果表明A因素有统计学意义，B、D因素无统计学意义。
以异绿原酸A质量分数为指标进行直观分析，影响因素的顺序是C > A > B > D，即超声功率 > 乙醇浓度 > 回流时间 > 超声时间。最佳提取工艺为A1B2C3D1，即60%乙醇超声(功率500 W)15 min，再回流提取1 h(见表 3)。以偏差平方和最小的因素为误差项进行方差分析(D因素)(见表 5)。结果表明A、B、C因素均无统计学意义。
综合评估金银花提取效果，以绿原酸和异绿原酸A的质量分数为指标，权重系数各为50进行计算，得“综合评分=绿原酸质量分数/27.24×50+异绿原酸A质量分数/17.43×50”。以综合评分为指标进行直观分析，影响因素的顺序是A > C > B > D，结果表明A、B、C因素无显著性差异。即乙醇浓度 > 超声功率 > 回流时间 > 超声时间。最佳提取工艺为A1B2C3D3，即60%乙醇超声(功率500 W)45 min，再回流提取1 h(见表 3)。以偏差平方和最小的因素为误差项进行方差分析(D因素)，结果表明A、B、C因素差异无统计学意义(见表 6)。
因素 离均差平方和 自由度 均方 F P A 57.741 2 28.871 8.094 > 0.05 B 10.121 2 5.060 1.419 > 0.05 C 18.255 2 9.127 2.559 > 0.05 D(误差) 7.134 2 3.567 1.000 — 表 6 绿原酸、异绿原酸A方差分析
-
本研究建立了HPLC同时测定金银花中绿原酸和异绿原酸A的方法，该方法快捷、简便、稳定。选择流动相为0.4%磷酸溶液:乙腈=87: 13的等度洗脱，波长为326 nm，检测的绿原酸和异绿原酸A的峰响应均较高，在22 min内可以完成出峰，且各峰间的分离度符合要求，特异性显著。
通过分析正交试验表 4~6的结果分析，单以绿原酸为指标，最佳提取工艺是60%乙醇超声(功率500 W)45 min，再回流提取1 h；且60%的乙醇提取(P < 0.05)。以绿原酸、异绿原酸A的综合评分为指标，最佳提取工艺是60%乙醇超声(功率500 W)45 min，再回流提取1 h。该方法采用超声辅助醇提，在实际生产中可取消药材浸泡的环节，缩短提取时间，此种方法经济、快捷，提取效率高。原因是超声波提取产生的空化作用可以加快固液之间的传质，加速药材中有效成分的浸出。
金银花提取工艺中绿原酸和异绿原酸A的提取效率不太高的原因可能与金银花药材的产地有关，即不同产地的金银花药材其绿原酸、异绿原酸A的含量存在差异；药材在常压回流水浴的温度达89 ℃，较高的温度可能使绿原酸与异绿原酸A的结构发生变化，后期可采用减压回流的提取方式使60%乙醇提取溶剂的沸点降低，增加回流的效率。
正交试验比较金银花中绿原酸、异绿原酸A的提取工艺
Comparison of extraction process for chlorogenic acid and isochlorogenic acid A from Lonicerae flos by orthogonal experiment
-
摘要:
目的优化金银花的提取工艺，建立高效液相色谱法（HPLC）快捷检测绿原酸和异绿原酸A的方法。 方法以HPLC同时测定绿原酸、异绿原酸A的含量为指标，通过比较醇浓度、回流时间、超声功率、超声时间4因素对提取工艺的影响，优化超声波辅助醇法提取金银花的工艺。 结果以绿原酸、异绿原酸A的综合评分为指标，最佳提取工艺是60%乙醇超声（功率500 W）45 min，再回流提取1 h。 结论建立了准确灵敏的检测方法，优化的提取工艺经济、高效，能为生产提供理论依据。 Abstract:ObjectiveTo optimize the extraction process of Lonicerae flos and to establish an HPLC method to detect chlorogenic acid and isochlorogenic acid A rapidly. MethodsThe content of chlorogenic acid and isochlorogenic acid A was simultaneously determined by HPLC and used as an indicator to compare the effect of the four factors(alcohol concentration, reflux time, ultrasonic power and ultrasonic time) on the extraction process, optimize the extraction process of Lonicerae flos by ultrasonic-assisted alcohol method. ResultsTaking the comprehensive score of chlorogenic acid and isochlorogenic acid A as an indicator, the best extraction process was using 60% alcohol ultrasounding(power 500W) for 45 min, then reflux extraction for 1 hour. ConclusionsAn accurate and sensitive detection method is established, the optimized extraction process is economical and efficient, which can provide theoretical basis for production. -
表 1 因素水平
水平 因素 A乙醇浓度/% B回流时间/h C超声功率/W D超声时间/min 1 60 0.5 200 15 2 70 1.0 350 30 3 80 1.5 500 45 
下载: 导出CSV
表 2 加样回收率实验结果
成分 取样量/mg 样品含量/mg 加入量/mg 测得量/mg 回收率/% 平均回收率/%(RSD%) 绿原酸 49.985 1.306 6 0.831 2 2.124 8 98.44 49.945 1.305 6 0.831 2 2.142 7 100.71 50.010 1.307 3 0.831 2 2.121 2 97.92 49.995 1.306 9 1.039 0 2.371 6 102.47 49.980 1.306 5 1.039 0 2.316 4 97.20 99.63(1.76) 50.065 1.308 7 1.039 0 2.360 1 101.19 49.965 1.306 1 1.246 8 2.563 2 100.84 49.975 1.306 3 1.246 8 2.545 2 99.37 50.045 1.308 2 1.246 8 2.537 0 98.56 异绿原酸A 49.985 0.853 2 0.799 6 1.664 1 101.41 49.945 0.852 6 0.799 6 1.657 2 100.62 50.010 0.853 7 0.799 6 1.660 5 100.90 49.995 0.853 4 0.999 5 1.846 3 99.34 49.980 0.853 2 0.999 5 1.834 3 98.16 100.18(1.89) 50.065 0.854 6 0.999 5 1.867 1 101.30 49.965 0.852 9 1.199 4 2.095 0 103.56 49.975 0.853 1 1.199 4 2.039 2 98.89 50.045 0.854 3 1.199 4 2.023 5 97.48
下载: 导出CSV
表 3 正交试验安排及结果
试验号 A B C D 质量分数/(mg/g) 综合评分 绿原酸 异绿原酸A 1 1 1 1 1 26.14 17.07 96.95 2 1 2 2 2 26.10 16.79 96.07 3 1 3 3 3 27.24 17.43 100.00 4 2 1 2 3 25.65 15.83 92.49 5 2 2 3 1 26.05 17.34 97.56 6 2 3 1 2 25.38 16.31 93.37 7 3 1 3 2 23.58 16.55 90.76 8 3 2 1 3 24.97 16.87 94.23 9 3 3 2 1 23.85 15.91 89.42 绿原酸 K1 26.493 25.123 25.497 25.347 — — — K2 25.693 25.707 25.200 25.020 — — — K3 24.133 25.490 25.623 25.953 — — — R 2.360 0.584 0.423 0.933 — — — 异绿原酸A K1 17.097 16.483 16.750 16.773 — — — K2 16.493 17.000 16.177 16.550 — — — K3 16.443 16.550 17.107 16.710 — — — R 0.654 0.517 0.930 0.223 — — — 综合评分 K1 97.673 93.400 94.850 94.643 — — — K2 94.473 95.953 92.660 93.400 — — — K3 91.470 94.263 96.107 95.573 — — — R 6.203 2.553 3.447 2.173 — — —
下载: 导出CSV
表 4 绿原酸方差分析
因素 离均差平方和 自由度 均方 F P A 8.643 2 4.322 30.541 < 0.05 B 0.522 2 0.261 1.845 > 0.05 C(误差) 0.283 2 0.142 1.000 — D 1.346 2 0.673 4.756 > 0.05
下载: 导出CSV
表 5 异绿原酸A方差分析
因素 离均差平方和 自由度 均方 F P A 0.793 2 0.397 10.038 > 0.05 B 0.474 2 0.237 6.000 > 0.05 C 1.321 2 0.660 16.722 > 0.05 D(误差) 0.079 2 0.040 1.000
下载: 导出CSV
表 6 绿原酸、异绿原酸A方差分析
因素 离均差平方和 自由度 均方 F P A 57.741 2 28.871 8.094 > 0.05 B 10.121 2 5.060 1.419 > 0.05 C 18.255 2 9.127 2.559 > 0.05 D(误差) 7.134 2 3.567 1.000 —
下载: 导出CSV
-
[1] 张瑾钰, 陈一强, 孔晋亮, 等.绿原酸、异绿原酸对烟曲霉生物膜抑制作用的体外研究[J].中国感染与化疗杂志, 2014, 14(4):327. doi: 10.3969/j.issn.1009-7708.2014.04.015 [2] 周志娥, 罗秋水, 熊建华, 等.绿原酸、异绿原酸A对大肠杆菌的抑菌机制[J].食品科技, 2014, 39(3):228. [3] 侯彩平, 何秋霞, 韩利文, 等.利用斑马鱼模型研究异绿原酸A的抗氧化和抗炎作用[C].中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会第一次(2016年)学术交流大会, 2016: 75. [4] 李祖晟, 朱志安.二咖啡酰奎宁酸药理实验研究进展[J].医药综述, 2004, 10(4):249. [5] 韩桂茹, 张淑萍, 安丽娜, 等.HPLC法测定金银花及小儿咽扁颗粒中4种绿原酸[J].中成药, 2013, 35(3):517. doi: 10.3969/j.issn.1001-1528.2013.03.020 [6] 李淼, 王永香, 孟谨, 等.HPLC法测定金银花中新绿原酸等8种成分的量[J].中草药, 2014, 45(7):1006. [7] 华梅, 毕玮, 陈剑, 等.金银花中异绿原酸A、B、C含量的HPLC测定方法研究[J].西部林业科学, 2017, 46(4):73. [8] 王玥, 杜守颖, 吴清, 等.金银花闪式提取工艺优选[J].中国实验方剂学杂志, 2012, 18(15):18. doi: 10.3969/j.issn.1005-9903.2012.15.004 [9] 闵春艳, 游本刚, 许琼明, 等.正交试验比较金银花药材中绿原酸与木犀草甘的乙醇提取工艺[J].中成药, 2011, 33(10):1815. doi: 10.3969/j.issn.1001-1528.2011.10.049 [10] 府旗中, 王伯初, 许祥武.应用超声波法提取金银花中绿原酸[J].重庆大学学报(自然科学版), 2007, 30(1):123. [11] 章运典, 陈玉海.金银花中绿原酸提取工艺研究[J].中成药, 2013, 35(7):1564. doi: 10.3969/j.issn.1001-1528.2013.07.053 -
点击查看大图
图(1)表(6)
计量
- 文章访问数: 4346
- HTML全文浏览量: 2369
- PDF下载量: 9
- 被引次数: 0
