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耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药基因检测及其同源性分析

王璐 高绪锋 张凤丽 胡燕云 黄颖 徐元宏

引用本文:
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耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药基因检测及其同源性分析

    作者简介: 王璐(1985-), 女, 主管检验技师
    通讯作者: 徐元宏, xyhong1964@163.com
  • 基金项目:

    国家科技支撑计划子课题 2015BAI32H00

  • 中图分类号: R446.5

The detection of drug resistance genes of carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia and its homology analysis

    Corresponding author: XU Yuan-hong, xyhong1964@163.com
  • CLC number: R446.5

  • 摘要: 目的研究六安市人民医院耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)的耐药基因及同源性。方法收集2018年4-6月分离自临床标本的肺炎克雷伯菌40株,用法国梅里埃VITEK 2 COMPACT全自动细菌鉴定药敏仪进行鉴定和药敏。采用改良Hodge试验(MHT)和改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)对40株菌进行碳青霉烯酶表型的筛选,采用PCR方法检测其是否携带已知的主要碳青霉烯耐药基因KPC、OXA-48、NDM-1。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对其进行同源性分析。结果40株CRKP多分离自ICU病房(占55%),以呼吸道来源标本为主(占80%),对常用抗生素头孢菌素类、氨基糖苷类以及大环内酯类的耐药率均在80.0%以上。MHT和mCIM试验中有33株菌二者均为阳性,2株菌均为阴性,剩下5株MHT试验阳性而mCIM试验结果为阴性。32株菌携带KPC基因,未检出OXA-48及NDM-1基因。同源性分析结果显示40株CRKP分为7个型别,其中A型34株(占85%),B、C、D、E、F及G型各1株(各占2.5%)。结论分离的CRKP以携带KPC-2基因为主,共有7个型别,以A型为主,为有效治疗和预防CRKP感染提供了参考依据。
  • 图 1  部分菌株MHT结果

    图 2  部分菌株mCIM结果

    图 3  部分PCR试验结果(23~42为菌株序号, OXA-48、KPC、NDM-1为阳性对照)

    表 1  碳青酶烯耐药基因引物序列

    基因名称 引物序列(5′~3′) 产物大小/bp
    KPC CGT CTA GTT CTG CTG TCT TG
    CTT GTC ATC CTT GTT AGG CG 798
    OXA-48 GCG TGG TTA AGG ATG AAC AC
    CAT CAA GTT CAA CCC AAC CG 438
    NDM-1 GGT TTG GCG ATC TGG TTT TC
    CGG AAT GGC TCA TCA CGA TC 621
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    表 2  CRKP菌株对常用抗生素耐药情况

    抗生素 耐药率/%
    氨苄西林/舒巴坦 100.0
    哌拉西林/他唑巴坦 97.5
    头孢唑啉 100.0
    头孢他啶 100.0
    头孢曲松 100.0
    头孢吡肟 85.0
    头孢替坦 80.0
    厄他培南 100.0
    亚胺培南 92.5
    阿米卡星 80.0
    庆大霉素 97.5
    妥布霉素 92.5
    环丙沙星 100.0
    左旋氧氟沙星 97.5
    复方新诺明 72.5
    阿奇霉素 100.0
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    表 3  MHT、mCIM试验及几种常见的碳青霉烯耐药基因检出结果

    试验内容 阳性株数 阳性率/%
    MHT实验结果 38 95.0
    mCIM试验结果 33 82.5
    携带KPC基因 30 75.0
    携带OXA-48基因 0 0.0
    携带NDM-1基因 0 0.0
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-07-17
  • 录用日期:  2018-10-25
  • 刊出日期:  2019-01-15

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药基因检测及其同源性分析

    通讯作者: 徐元宏, xyhong1964@163.com
    作者简介: 王璐(1985-), 女, 主管检验技师
  • 1. 安徽省六安市人民医院 检验科, 237000
  • 2. 广东省深圳市盐田区人民医院 检验科, 518081
  • 3. 安徽医科大学第一附属医院 检验科, 安徽 合肥 230022
基金项目:  国家科技支撑计划子课题 2015BAI32H00

摘要: 目的研究六安市人民医院耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)的耐药基因及同源性。方法收集2018年4-6月分离自临床标本的肺炎克雷伯菌40株,用法国梅里埃VITEK 2 COMPACT全自动细菌鉴定药敏仪进行鉴定和药敏。采用改良Hodge试验(MHT)和改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)对40株菌进行碳青霉烯酶表型的筛选,采用PCR方法检测其是否携带已知的主要碳青霉烯耐药基因KPC、OXA-48、NDM-1。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对其进行同源性分析。结果40株CRKP多分离自ICU病房(占55%),以呼吸道来源标本为主(占80%),对常用抗生素头孢菌素类、氨基糖苷类以及大环内酯类的耐药率均在80.0%以上。MHT和mCIM试验中有33株菌二者均为阳性,2株菌均为阴性,剩下5株MHT试验阳性而mCIM试验结果为阴性。32株菌携带KPC基因,未检出OXA-48及NDM-1基因。同源性分析结果显示40株CRKP分为7个型别,其中A型34株(占85%),B、C、D、E、F及G型各1株(各占2.5%)。结论分离的CRKP以携带KPC-2基因为主,共有7个型别,以A型为主,为有效治疗和预防CRKP感染提供了参考依据。

English Abstract

  • 临床上,肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KPN)常常引起呼吸道、泌尿道、消化道、血液及其他无菌部位(如腹腔、胸腔、关节等)感染[1]。KPN的分离率呈逐年稳步上升趋势,且耐碳青霉烯KPN(CRKP)的检出率也在逐年上升,至2017年,KPN对亚胺培南和美罗培南的耐药率达到20.9%和24.0%,耐药率上升幅度高达8倍[2]。KPN对碳青霉烯类药物耐药大多是由于其产碳青霉烯酶,尤以肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase,KPC)为主。我院自2018年以来,CRKP的检出率逐渐上升,本研究收集2018年4-6月分离自临床科室的CRKP 40株,进行碳青霉烯酶基因检测及菌株同源性分析,以期进一步了解我院CRKP的耐药性与分子流行病学特征,为有效治疗和预防CRKP感染提供参考。

    • 对亚胺培南、美罗培南或厄他培南中任一药物耐药定义为CRKP,所有菌株均为连续分离的非重复菌株,同一病人同一标本只取第1次分离株。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922,KPN ATCC1705,KPN ATCC1706,大肠埃希菌ATCC 8739,系安徽医科大学第一附属医院检验科惠赠。KPC、OXA-48、NDM-1阳性对照菌株系中国人解放军总医院检验科惠赠。

    • MAC平板、BP平板、MH平板及VITEK 2 Compact型全自动微生物分析仪和革兰阴性菌鉴定药敏卡(GN和GN13)均购自法国梅里埃公司,美罗培南药物敏感性纸片(10 μg)购自英国Oxoid公司,胰酪大豆胨液体培养基(TSB)购自北京三药公司,PCR仪购自美国BIO-RAD公司,电泳仪及凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司,PCR试剂购自日本Takara公司,引物交由生工生物工程有限公司合成。

    • 按照《全国临床检验操作规程》对临床菌株进行分离培养。标本分别接种于血平板和麦康凯,35 ℃培养16~18 h,挑取疑似菌落进行种类鉴定。菌种鉴定及药物敏感性试验采用法国梅里埃VITEK 2 Compact型全自动细菌鉴定药敏仪进行,菌株对常用抗菌药物的敏感性采用梅里埃VITEK 2 Compact GN 13卡进行检测,试验操作及折点判断依据美国临床实验室标准化研究所标准操作规程(CLSI-M100-27)进行。

    • 将大肠埃希菌ATCC 25922配置成0.5麦氏浊度的菌悬液,稀释10倍后均匀涂布于MH平板上,在平板中央贴10 μg美罗培南纸片。然后用接种环挑取单个过夜培养的新鲜菌落,以纸片边缘为起点离心方向划线接种,35 ℃孵育16~20 h后观察结果。以KPN ATCC 1705为阳性对照,KPN ATCC1706为阴性对照。若被测菌株线与大肠埃希菌ATCC 25922抑菌圈交汇处出现大肠埃希菌生长增强现象,即为阳性[3-4]

    • 取1 μL过夜培养的CRKP菌落接种于2 mL TSB肉汤中,涡旋振荡15 s,将10 μg美罗培南纸片浸没于TSB菌液中,35 ℃孵育4 h。待孵育结束时,将美罗培南纸片从TSB菌液中取出,贴于0.5麦氏浊度大肠埃希菌ATCC25922涂布的MH琼脂平板上,35 ℃孵育18~24 h。KPN ATCC1705为阳性对照,KPN ATCC1706为阴性对照。根据CLSI M100 27th进行结果判读[4]

    • 采用煮沸法提取待测菌株的基因组DNA作为模板。取无菌水1 mL加入高压灭菌后的EP管中,挑取35 ℃、16~18 h生长的菌落适量在EP管壁研磨制成菌悬液,然后将菌悬液100 ℃加热30 min,冷却至室温后,高速离心取上清液作为PCR扩增的模板。同时使用多对特异引物序列进行多重PCR扩增,按如下设置扩增条件:预变性94 ℃ 5 min,然后变性94 ℃ 45 s、退火55 ℃ 45 s和延伸72 ℃ 1 min,35个循环,最后72 ℃延伸10 min。1%的琼脂糖凝胶电泳观察CRKP菌株是否携带待检的碳青霉烯耐药基因。将部分扩增产物送测序公司进行测序,测序结果在GenBank中进行比对分析,以确定扩增产物的种类和型别[5]。引物序列见表 1

      基因名称 引物序列(5′~3′) 产物大小/bp
      KPC CGT CTA GTT CTG CTG TCT TG
      CTT GTC ATC CTT GTT AGG CG 798
      OXA-48 GCG TGG TTA AGG ATG AAC AC
      CAT CAA GTT CAA CCC AAC CG 438
      NDM-1 GGT TTG GCG ATC TGG TTT TC
      CGG AAT GGC TCA TCA CGA TC 621

      表 1  碳青酶烯耐药基因引物序列

    • CRKP菌株35 ℃过夜后,挑取单个纯菌落,将其均匀涂抹于靶板上,放置后滴加1 μL α-腈基-4-羟基肉桂酸基质液,待干燥,将靶板放入VITEK MS仪器中,使用科研库进行聚类分析。仪器将细菌蛋白质峰图与数据库里参考图谱比较并进行多种算法计算,给出鉴定结果。可信水平在60.0%~99.9%为可接受结果。然后在系统内进行同种细菌间的聚类分析。

    • 应用Excel软件,对数据进行排序计算,应用WHONET 5.6软件对药敏试验结果进行统计分析。

    • CRKP 40株中分离自ICU病房的占55%,急诊科占15%,呼吸内科占10%,普外科一病区和神经内科二病区各占5%,神经内科一病区、肾脏内科及肿瘤内科各占2.5%。标本类型中以呼吸道的标本居多,占80%,其次是尿液、血液及分泌物各占5%,胸水和腹水各占2.5%。

    • 40株CRKP对厄他培南及环丙沙星耐药率均为100.0%,对亚胺培南耐药率为92.5%,对阿米卡星耐药率为80.0%,对三代头孢菌素类、氨基糖苷类、青霉素类耐药率均超过90.0%(见表 2)。

      抗生素 耐药率/%
      氨苄西林/舒巴坦 100.0
      哌拉西林/他唑巴坦 97.5
      头孢唑啉 100.0
      头孢他啶 100.0
      头孢曲松 100.0
      头孢吡肟 85.0
      头孢替坦 80.0
      厄他培南 100.0
      亚胺培南 92.5
      阿米卡星 80.0
      庆大霉素 97.5
      妥布霉素 92.5
      环丙沙星 100.0
      左旋氧氟沙星 97.5
      复方新诺明 72.5
      阿奇霉素 100.0

      表 2  CRKP菌株对常用抗生素耐药情况

    • 40株CRKP中,33株菌MHT和mCIM试验均为阳性,2株菌(9号和34号)均为阴性,剩下5株菌都是MHT试验阳性而mCIM试验结果为阴性(见表 3)。

      试验内容 阳性株数 阳性率/%
      MHT实验结果 38 95.0
      mCIM试验结果 33 82.5
      携带KPC基因 30 75.0
      携带OXA-48基因 0 0.0
      携带NDM-1基因 0 0.0

      表 3  MHT、mCIM试验及几种常见的碳青霉烯耐药基因检出结果

    • KPC、OXA-48、NDM-1 PCR凝胶电泳结果显示,32株CRKP携带KPC基因,测序后用Gene Bank进行比对,结果显示32株KPC基因型均是KPC-2型。此次试验未检出OXA-48及NDM-1基因(见表 3)。部分试验结果见图 1~2

      图  1  部分菌株MHT结果

      图  2  部分菌株mCIM结果

    • 按照相似度为80%~100%为同一型别的分类方法,该40株CRKP可分为7个型别,A型34株,占85%,是主要型别,B、C、D、E、F及G型各1株,各占2.5%(见图 3)。

      图  3  部分PCR试验结果(23~42为菌株序号, OXA-48、KPC、NDM-1为阳性对照)

    • 耐碳青霉烯的肠杆菌科往往对多种抗生素耐药严重,治疗极其困难,而成为全球范围的公共卫生问题,近几年又以CRKP最为突出[6-7]。研究证明,CRKP的耐药机制主要是由于携带碳青霉烯酶,以KPC为主,该酶因首次在KPN中被检出,因此命名为KPC[8],是含有丝氨酸残基的A类碳青霉烯酶,由265~269个氨基酸组成。携带KPC基因的KPN大多数为多重耐药菌,因为KPC基因存在于带有耐药性决定因素的大质粒上,其中包括对氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类等耐药的质粒[9]。CRKP在医院内广泛传播的因素目前尚未研究清楚,但可能与长期接触急性护理设施、较高的共病程度、长期使用抗生素以及长期使用留置管和中心静脉导管等有关,继而引起感染[10-11]。CRKP感染的病人,其住院时间延长,多数会住进ICU病房进行抢救治疗,且相较于产超广谱β-内酰胺酶或对碳青霉烯敏感的KPN病死率较高[12]。本研究中,CRKP对多种抗生素的耐药性普遍较高,对头孢菌素类、氨基糖苷类和喹诺酮类的耐药率都在90.0%以上,与其他报道[13-15]相似。有研究[16]表明治疗时采用多药联合或选用新的β-内酰胺酶抑制剂组合或许有效。

      本次试验中有26株CRKP MHT试验及mCIM试验阳性且检出KPC基因,4株MHT阳性、mCIM阴性并携带KPC基因。KPC基因检测阳性的菌株MHT试验结果均为阳性,这与胡仁静等[17]研究结果相同。有7株菌MHT及mCIM试验阳性,但未检测到KPC、OXA-48及NDM-1基因,推测可能携带有其他碳青霉烯类耐药基因,如VIM、IMP等[18]。还有2株菌MHT和mCIM试验均为阴性,且未检出待测基因,可能与MHT和mCIM试验在检测不同类别碳青霉烯类基因时灵敏度不同、菌株携带其他碳青霉烯类耐药基因或者存在外膜蛋白丢失等其他非耐药基因因素有关。本研究中CRKP多为KPC-2型,这与国内报道[15, 19-20]相符,但也有研究[21]认为CRKP流行菌株多为IMP-4型,但这需要大量数据的进一步研究。MALDI-TOF MS在过去十年中给微生物学诊断工作流程带来巨变[22]。研究表明,MALDI-TOF MS除了在微生物鉴定方面以外,在流行病学分型和耐药检测方面同样具有巨大的潜力,其分型准确度与脉冲场凝胶电泳和多位点序列分型大致相当,且具有快速、经济、方便等优点[23-25]。本文中采用MALDI-TOF MS进行同源性分析,40株CRKP分为7个类型,其中A型34株,占85%,B、C、D、E、F及G型各1株,各占2.5%,以A型为主,主要集中在ICU病房和急诊科,同时存在于神经内科、神经外科及普外科一病区,因此我们认为,本院存在以A型为主的CRKP的流行传播。

      综上所述,我院CRKP耐药程度较高且有流行播散的趋势,因此院感部门应对重点科室加强耐药监测,采取适当措施,严格控制进一步的传播流行。同时后续应当补充其他耐药基因检测及进一步研究是否存在外膜蛋白的丢失及药物泵出等机制,为研究CRKP的传播机制提供思路。

参考文献 (25)

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