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机体保护多肽(human body protection peptide，HuBPP)是从胃液中分离纯化的一种机体保护蛋白质，其相对分子质量为1 400，由15个氨基酸组成，它对多种损伤引起的胃肠道、肝脏、胰脏、胆管损伤具有明显的保护作用，具有促进伤口和骨折愈合、抑制炎性反应等多种活性。本研究对SD大鼠单次静脉和肌内注射给药以及连续1个月(4周)肌内注射给予供试品HuBPP，观察实验动物SD大鼠产生的毒性反应及其严重程度，并观察毒性反应的靶器官，提供无毒性反应剂量，从而为临床更安全的用药以及不良反应的监控提供参考信息。现作报道。
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HuBPP(批号20130301，每支10 mg)由某制药公司提供，溶媒试剂氯化钠溶液(批号2012052306)购自南京小营药业集团有限公司。实验动物SPF级SD大鼠购买自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK (沪) 2008-0016，合格证号0113787，饲养于江苏省药物安全性评价中心屏障系统内。
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按《化学药物急性毒性试验技术指导原则》要求[1]，实验采用肌内注射，给药剂量为20 mg/kg(按体表面积折算，约为成人临床拟用剂量的1 071倍，成人体质量按60 kg计)，肌内注射给药体积为每给药部位0.05 mL/100 g，并设立溶媒对照组。每个剂量组动物20只，雌雄各半。给药后，连续观察4 h进行观察，第2天以后每天上午观察1次，观察动物行为活动、神经系统活动、呼吸循环、摄食、大小便、皮毛等。连续观察14天，第3、8、14天对实验动物测质量。观察期结束，将动物安乐处死，进行大体解剖，对肉眼所见异常的组织器官进行组织病理学检查。
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量选择：本实验所做的HuBPP大鼠单次给药毒性实验表明，在药物常温最大溶解度(20 mg/mL)、左右侧后肢分别给药1次(0.05 mL/100 g体质量/给药部位)条件下，HuBPP大鼠肌肉单次注射给药剂量20 mg/kg下无明显毒性反应。依据《化学药物长期毒性研究技术指导原则》以及相关指导原则要求[1-4]，本研究分别选择0.2 mg/kg、1 mg/kg和4 mg/kg为本次实验的低、中、高剂量，分别约为人临床等效剂量的10、50和200倍(成人体质量按60 kg计)，另设溶媒对照组，每组大鼠30只，雌雄各半。以上各组动物的给药体积均为0.05 mL/100 g体质量[5]，给药部位为大鼠后肢一侧肌肉，每日给药1次，连续28 d。
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整个实验期间，每日观察动物症状；每周称摄食量、质量一次；给药末期(第4周)和恢复期(恢复2周)分别检测实验动物各项临床指标，包括血常规测定项目：白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板平均体积(MPV)、血小板体积分布宽度(PDW)、红细胞体积分布宽度(RDW)等；血液生化测定项目：白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、总胆红素(TBI)、总胆固醇(CHO)、三酰甘油(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)等，血清电解质测定项目，凝血时间测定项目等。对完成实验大的鼠进行安乐死[6-8]，处死的大鼠进行大体观察，准备相关试剂及器械进行解剖[9]。动物剖检由经过相关培训的技术人员在合格毒理学专家的监督下进行[10]，观察脏器并计算各主要脏器相对脏器重量系数[11]，对各脏器、腺体等进行组织病理学检查[12-13]。
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采用方差分析和q检验。
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大鼠静脉及肌内注射HuBPP后，4 h观察结束未见动物有毒性反应，在剩余观察期结束时动物外观体征、行为活动、粪便性状等无明显异常，质量及摄食无异常变化。大鼠在观察期结束时均进行大体解剖，心、肝、脾、肺、肾等主要脏器无肉眼可见病变。
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各组大鼠肌内注射给药1个月以及恢复期2周，各组动物外观体征、行为活动、粪便性状等未见明显异常。大鼠肌内注射给药1个月以及恢复2周期间，各给药组雄鼠、雌鼠质量和摄食量组间相比肉眼观均无明显毒性反应。
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给药28 d，高剂量组雌鼠MCHC显著高于溶媒对照组、低剂量和中剂量组(P < 0.05~P < 0.01), MPV低于溶媒对照组和低剂量组(P < 0.05)。恢复期结束后，高剂量组雄鼠RDW显著低于溶媒对照组、低剂量和中剂量组(P < 0.05)，高剂量组雌鼠血小板PDW显著小于溶媒对照组(P < 0.05)(见表 1)。
分组 雌性，28 d(n=10) 雌性，恢复2周
(n=5)PDW/%雄性，恢复2周
(n=5)RDW/%MCHC/(g/L) MPV/fL 溶媒对照组 342.10±3.60 12.39±0.50 46.14±2.01 13.08±0.46 低剂量组 341.30±5.17 12.09±0.63 43.44±1.89 12.84±0.38 中剂量组 343.70±3.86 11.60±0.96 42.50±1.44 12.74±0.18 高剂量组 348.60±2.07**##▲ 11.14±1.09*# 42.54±2.15* 12.22±0.26*#▲ F 7.28 4.39 4.10 5.77 P < 0.01 < 0.01 < 0.05 < 0.01 MS组内 14.718 0.689 3.577 0.114 q检验：与溶媒对照组比较*P < 0.05，**P < 0.01；与低剂量组比较#P < 0.01，##P < 0.01；与中剂量组比较▲P < 0.05 表 1 肌内注射HuBPP 28 d重复给药对大鼠血液生化指标的影响(x±s)
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连续给药28 d后，中剂量组雌鼠TG显著高于溶媒对照组(P < 0.05)。恢复期结束后，高剂量组和中剂量组雄鼠ALB显著低于溶媒对照组(P < 0.05)；低剂量组雌鼠ALT、GLU和TG显著高于溶媒对照组(P < 0.05~P < 0.01)；中剂量组ALT高于溶媒对照组(P < 0.05)(见表 2)。
分组 雌性，给药28 d
(n=10)TG/(mmol/L)雌性，恢复2周(n=5) 雄性，恢复2周(n=5)
ALB/(g/L)ALT/(U/L) GLU/(mmol/L) TG/(mmol/L) 溶媒对照组 0.29±0.10 40.80±4.21 7.76±1.30 0.55±0.19 37.88±1.23 低剂量组 0.40±0.15 50.60±3.58** 10.16±1.40* 1.03±0.24** 36.94±0.81 中剂量组 0.46±0.14* 45.80±3.27* 8.66±1.06 0.48±0.10## 36.00±0.92* 高剂量组 0.38±0.11 40.40±1.52## 6.90±1.08# 0.39±0.08## 35.46±1.12* F 3.09 10.62 6.50 14.85 5.32 P < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.016 10.886 1.485 0.028 1.068 q检验：与溶媒对照组比较*P < 0.05，**P < 0.01；与低剂量组比较#P < 0.01，##P < 0.01 表 2 肌内注射HuBPP 28 d重复给药对大鼠血清生化指标的影响(x±s)
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连续给药28 d后，高、中剂量组雄鼠活化部分凝血活酶时间(APTT)低于溶媒对照组(P < 0.01)。恢复期结束后，高、中剂量雌鼠ATPP均低于低剂量组(P < 0.05)，与溶媒对照组差异无统计学意义(P>0.05)(见表 3)。恢复期HuBPP各组鼠凝血各检测指标与溶媒组比较未发现明显毒性反应。
分组 给药1个月(雄) 给药1个月(雌) 恢复期(雄) 恢复期(雌) 溶媒对照组 18.69±1.28 17.27±1.10 19.22±0.95 17.88±0.35 低剂量组 18.92±1.89 17.18±0.76 18.38±1.55 18.34±0.97 中剂量组 16.71±1.14**## 17.61±1.16 16.76±1.80# 16.26±1.15## 高剂量组 16.31±1.18**## 17.38±1.16 18.82±1.90▲ 16.08±1.50## F 9.07 0.31 4.76 11.18 P < 0.01 >0.05 < 0.01 < 0.01 MS组内 1.976 1.120 2.446 1.159 q检验：与溶媒对照组比较**P < 0.01；与低剂量组比较#P < 0.01，##P < 0.01；与中剂量组比较▲P < 0.05 表 3 肌内注射HuBPP 28 d重复给药对大鼠凝血时间的影响(ni=10；x±s；s)
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给药末期高剂量组雄鼠Cl-高于溶媒对照组和低剂量组(P < 0.01)，中剂量组雌鼠Na+低于溶媒对照组(P < 0.05)，恢复期HuBPP各组雄鼠血清电解质各检测指标与溶媒组比较未见明显毒性反应(见表 4)。
分组 雌鼠，给药28 d(n=10)
Na+/(mmol/L)雄鼠，给药28 d(n=10)
Cl-/(mmol/L)雌鼠，恢复2周(n=5)
Na+/(mmol/L)雄鼠，恢复2周(n=5)
Cl-/(mmol/L)溶媒对照组 138.57±0.76 107.07±1.05 138.76±1.07 107.92±1.51 低剂量组 138.56±1.20 107.17±0.97 139.08±0.79 107.50±0.78 中剂量组 136.98±1.57* 108.15±0.85 138.66±0.82 109.50±0.65 高剂量组 138.16±1.52 108.76±1.27**## 138.36±1.07 108.26±1.13 F 3.31 6.01 0.49 3.23 P <0.05 <0.01 >0.05 >0.05 MS组内 1.698 1.095 0.897 1.147 q检验：与溶媒对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01；与低剂量组比较##P < 0.01 表 4 肌内注射HuBPP 28 d重复给药对大鼠血清电解质的影响(x±s)
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恢复期结束时，雌鼠低剂量组肝脏脏器系数显著高于其他组(P < 0.01)，其余各剂量组在给药28 d结束和恢复期结束时，脏器系数与溶媒对照组相比差异无统计学意义(见表 5~6)。
分组 心 肝 脾 肺 脑 溶媒对照组 0.348±0.034 2.623±0.229 0.195±0.028 0.479±0.046 0.737±0.105 低剂量组 0.380±0.034 2.679±0.170 0.201±0.026 0.480±0.037 0.785±0.043 低剂量组 0.380±0.034 2.679±0.170 0.201±0.026 0.480±0.037 0.785±0.043 中剂量组 0.375±0.026 2.809±0.181 0.197±0.027 0.477±0.030 0.804±0.067 高剂量组 0.370±0.029 2.766±0.206 0.201±0.030 0.454±0.057 0.768±0.093 F 2.08 1.80 0.12 0.81 1.24 P >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 MS组内 0.001 0.039 0.001 0.002 0.007 表 5 肌内注射HuBPP重复给药28 d对雌性大鼠脏器系数的影响(ni=10；x±s)
分组 心 肝 脾 肺 脑 溶媒对照组 0.351±0.047 2.415±0.122 0.192±0.039 0.422±0.050 0.656±0.142 低剂量组 0.343±0.034 3.108±0.209** 0.203±0.045 0.434±0.044 0.712±0.032 中剂量组 0.360±0.042 2.634±0.266## 0.218±0.034 0.464±0.063 0.721±0.055 高剂量组 0.337±0.039 2.362±0.114## 0.200±0.010 0.443±0.020 0.776±0.025 F 0.30 16.23 0.49 0.71 1.94 P >0.05 < 0.01 >0.05 >0.05 >0.05 MS组内 0.002 0.036 0.001 0.002 0.006 q检验：与溶媒对照组比较**P < 0.01；与低剂量组比较##P < 0.01 表 6 肌内注射HuBPP重复给药28 d恢复2周对雌性大鼠脏器系数的影响(ni=5；x±s)
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大鼠首次和末次肌内注射给予低、中、高剂量HuBPP后，病理检查结果与溶媒对照组相比，心肌纤维结构正常、肝小叶结构清晰、脾小体及红髓、肺泡及肺内支气管、肾皮质组织、肌纤维等结构均正常，未见明显毒性反应(见图 1~2)。
图 1 溶媒组主要脏器病理切片HE染色
图 2 高剂量组主要脏器病理切片HE染色
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据WHO统计, 各国住院病人不良反应发生率在10%~20%，其中有5 %的病人因此死亡[14]。而多数不良反应是由药物固有的效应导致，与药物性质和药品质量有关，因此，药物在进行临床前安全性评价具有十分重要的意义。
多肽类药物在治疗肿瘤、糖尿病、心血管疾病、免疫疾病以及抗病毒、抗菌等方面具有显著的疗效[14]，且这类药物具有活性显著、特异性强、毒性较弱，在体内不易产生蓄积，与其他药物的相互作用比较少等优势。本研究也进一步验证了多肽类药物毒性低这一特性，实验结果表明HuBPP最小致死量大于20 mg/kg，无临床致死风险。
在长期毒性实验中，血液学测定结果各给药组血红细胞及血小板部分指标与溶媒对照组相比差异有统计学意义，凝血及电解质检测指标测定结果各用药组有部分指标与溶媒对照组差异有统计学意义。但这些测量值均在文献[15]报道正常值变化范围之内，分析认为这些指标均无毒理学意义，表明HuBPP对于红细胞、血小板、凝血及电解质均没有影响。血液生化测定结果显示，虽各给药组部分指标与溶媒对照组相比差异有统计学意义，但结合脏器系数及摄食量、麻醉质量判断，该差异是由饲料摄入过多引起，且变化范围在本实验室正常值变化范围之内。另外，高剂量组动物肝脏病理标本切片观察未见有肝脏损伤等现象出现，综合以上情况分析，认为该差异与HuBPP作用无关。病理结果均显示，多数大鼠光学显微镜下各受检组织和脏器组织结构清楚，实质细胞无明显变性、坏死，间质未见血管扩张、充血及炎细胞浸润等病变。个别大鼠出现的病变，程度低且发生率低，认为与HuBPP无直接关系。所以，HuBPP大鼠肌内注射1个月及恢复2周未产生与HuBPP相关的组织病理学改变，同时也未引起迟发性病理学改变。
综合病理检查的结果以及日常症状的观察及其停药后的转归情况，我们认为在本实验条件下，HuBPP对大鼠的相对安全剂量为4 mg/kg及其以下剂量。而本药物在更长给药时间实验条件下是否具有毒性反应，还有待进一步验证。
机体保护多肽对大鼠重复给药毒性研究
Study on the toxicity of the repeated administration of protective polypeptides in rats
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摘要:
目的检测机体保护多肽（HuBPP）对大鼠产生的毒性反应，为临床提供无毒性反应剂量，从而为临床更安全地用药以及不良反应的监控提供参考信息。 方法80只SD大鼠单次静脉和肌内注射给药以确认给药剂量。选择0.2 mg/kg、1 mg/kg和4 mg/kg为本次实验的低、中、高剂量，并设置溶媒对照组，每组30只大鼠，雌雄各半。连续肌内注射给药一个月，实验期间观察大鼠质量、摄食量等指标，给药末期和恢复期采血检测各临床指标，病理学检测各主要脏器毒性变化。 结果急性毒性实验表明，20 mg/kg给药剂量下，实验组与对照组相比各观察指标未发现明显改变。长期毒性实验结果表明，与对照组相比，各剂量组大鼠质量、摄食量、主要脏器指标均未发现明显毒性反应（P>0.05）。长期毒性实验给药结束后，高剂量组雌鼠MCHC高于溶媒对照组，MPV低于溶媒对照组（P < 0.01和P < 0.05）；中剂量对照组雌鼠TG高于溶媒对照组，Na+浓度低于溶媒对照组（P < 0.05）；雄鼠高、中剂量组活化部分凝血活酶时间显著低于溶媒对照组（P < 0.05），高剂量组Cl-浓度显著高于溶媒对照组（P < 0.05）。恢复期结束后高剂量组雄鼠红细胞体积分布宽度值低于溶媒对照组（P < 0.05），低剂量组雌鼠丙氨酸氨基转移酶、血糖、三酰甘油显著高于溶媒组（P < 0.05~P < 0.01），但均处于文献报道正常变化范围内；其他指标差异无统计学意义。 结论在本实验条件下，HuBPP对大鼠的相对安全剂量为4 mg/kg及其以下剂量。 Abstract:ObjectiveTo evaluate the toxic reaction of human body protection peptide(HuBPP) in rat, and determine non-toxic reaction dose for clinical application and providing the reference information in clinical safe medication and monitoring of adverse reactions. MethodsThe dosage of administration in 80 SD rats were confirmed by single intravenous and intramuscular injection.The dose of 0 mg/kg, 0.2 mg/kg, 1 mg/kg and 4 mg/kg were intramuscularly injected into the control group, low, medium high dose groups for 1 month, respectively(30 rats each group).The body weight and food intake in four groups were recorded during the test, the biochemical index at the end of drug administration and recovery period were detected, and the toxicity change of main organs was detected using histopathology. ResultsThe acute toxicity test showed that there was no significant change in the observed indicators between control group and experiment group.The long-term toxicity test showed that there was no statistical significance in toxicity reaction of body weight, food intake and main organ indicators between control group and experiment group(P>0.05).After the long-term poison test, the levels of MCHC and MPV in male rats of high-dose group were higher and lower than that in control group, respectively(P < 0.01 and P < 0.05);the levels of TG and Na+ in female rats of middle-dose group were higher and lower than that in control group, respectively(P < 0.05);the levels of APTT in male rats of high- and middle-dose group were significantly lower than that in control group(P < 0.05);the Cl- concentration in high-dose group was significantly higher than that in control group(P < 0.05).At the end of the recovery period, the values of RDW in male rats of high-dose group were lower than those in control group(P < 0.05), the levels of ALT, GLU, and TG in female rats of low-dose group were significantly higher than those in control group(P < 0.05 to P < 0.01).However, the parameters were within the normal range as reported in literature, and the significant difference of which was not found. ConclusionsUnder the condition of the test, the 4 mg/kg or less than 4 mg/kg of HuBPP is safe dose in rats. -
Key words:
- human body protection peptide /
- single dose /
- repeated dose /
- toxicity /
- rat
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表 1 肌内注射HuBPP 28 d重复给药对大鼠血液生化指标的影响(x±s)
分组 雌性，28 d(n=10) 雌性，恢复2周
(n=5)PDW/%雄性，恢复2周
(n=5)RDW/%MCHC/(g/L) MPV/fL 溶媒对照组 342.10±3.60 12.39±0.50 46.14±2.01 13.08±0.46 低剂量组 341.30±5.17 12.09±0.63 43.44±1.89 12.84±0.38 中剂量组 343.70±3.86 11.60±0.96 42.50±1.44 12.74±0.18 高剂量组 348.60±2.07**##▲ 11.14±1.09*# 42.54±2.15* 12.22±0.26*#▲ F 7.28 4.39 4.10 5.77 P < 0.01 < 0.01 < 0.05 < 0.01 MS组内 14.718 0.689 3.577 0.114 q检验：与溶媒对照组比较*P < 0.05，**P < 0.01；与低剂量组比较#P < 0.01，##P < 0.01；与中剂量组比较▲P < 0.05 
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表 2 肌内注射HuBPP 28 d重复给药对大鼠血清生化指标的影响(x±s)
分组 雌性，给药28 d
(n=10)TG/(mmol/L)雌性，恢复2周(n=5) 雄性，恢复2周(n=5)
ALB/(g/L)ALT/(U/L) GLU/(mmol/L) TG/(mmol/L) 溶媒对照组 0.29±0.10 40.80±4.21 7.76±1.30 0.55±0.19 37.88±1.23 低剂量组 0.40±0.15 50.60±3.58** 10.16±1.40* 1.03±0.24** 36.94±0.81 中剂量组 0.46±0.14* 45.80±3.27* 8.66±1.06 0.48±0.10## 36.00±0.92* 高剂量组 0.38±0.11 40.40±1.52## 6.90±1.08# 0.39±0.08## 35.46±1.12* F 3.09 10.62 6.50 14.85 5.32 P < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.016 10.886 1.485 0.028 1.068 q检验：与溶媒对照组比较*P < 0.05，**P < 0.01；与低剂量组比较#P < 0.01，##P < 0.01
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表 3 肌内注射HuBPP 28 d重复给药对大鼠凝血时间的影响(ni=10；x±s；s)
分组 给药1个月(雄) 给药1个月(雌) 恢复期(雄) 恢复期(雌) 溶媒对照组 18.69±1.28 17.27±1.10 19.22±0.95 17.88±0.35 低剂量组 18.92±1.89 17.18±0.76 18.38±1.55 18.34±0.97 中剂量组 16.71±1.14**## 17.61±1.16 16.76±1.80# 16.26±1.15## 高剂量组 16.31±1.18**## 17.38±1.16 18.82±1.90▲ 16.08±1.50## F 9.07 0.31 4.76 11.18 P < 0.01 >0.05 < 0.01 < 0.01 MS组内 1.976 1.120 2.446 1.159 q检验：与溶媒对照组比较**P < 0.01；与低剂量组比较#P < 0.01，##P < 0.01；与中剂量组比较▲P < 0.05
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表 4 肌内注射HuBPP 28 d重复给药对大鼠血清电解质的影响(x±s)
分组 雌鼠，给药28 d(n=10)
Na+/(mmol/L)雄鼠，给药28 d(n=10)
Cl-/(mmol/L)雌鼠，恢复2周(n=5)
Na+/(mmol/L)雄鼠，恢复2周(n=5)
Cl-/(mmol/L)溶媒对照组 138.57±0.76 107.07±1.05 138.76±1.07 107.92±1.51 低剂量组 138.56±1.20 107.17±0.97 139.08±0.79 107.50±0.78 中剂量组 136.98±1.57* 108.15±0.85 138.66±0.82 109.50±0.65 高剂量组 138.16±1.52 108.76±1.27**## 138.36±1.07 108.26±1.13 F 3.31 6.01 0.49 3.23 P <0.05 <0.01 >0.05 >0.05 MS组内 1.698 1.095 0.897 1.147 q检验：与溶媒对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01；与低剂量组比较##P < 0.01
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表 5 肌内注射HuBPP重复给药28 d对雌性大鼠脏器系数的影响(ni=10；x±s)
分组 心 肝 脾 肺 脑 溶媒对照组 0.348±0.034 2.623±0.229 0.195±0.028 0.479±0.046 0.737±0.105 低剂量组 0.380±0.034 2.679±0.170 0.201±0.026 0.480±0.037 0.785±0.043 低剂量组 0.380±0.034 2.679±0.170 0.201±0.026 0.480±0.037 0.785±0.043 中剂量组 0.375±0.026 2.809±0.181 0.197±0.027 0.477±0.030 0.804±0.067 高剂量组 0.370±0.029 2.766±0.206 0.201±0.030 0.454±0.057 0.768±0.093 F 2.08 1.80 0.12 0.81 1.24 P >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 MS组内 0.001 0.039 0.001 0.002 0.007
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表 6 肌内注射HuBPP重复给药28 d恢复2周对雌性大鼠脏器系数的影响(ni=5；x±s)
分组 心 肝 脾 肺 脑 溶媒对照组 0.351±0.047 2.415±0.122 0.192±0.039 0.422±0.050 0.656±0.142 低剂量组 0.343±0.034 3.108±0.209** 0.203±0.045 0.434±0.044 0.712±0.032 中剂量组 0.360±0.042 2.634±0.266## 0.218±0.034 0.464±0.063 0.721±0.055 高剂量组 0.337±0.039 2.362±0.114## 0.200±0.010 0.443±0.020 0.776±0.025 F 0.30 16.23 0.49 0.71 1.94 P >0.05 < 0.01 >0.05 >0.05 >0.05 MS组内 0.002 0.036 0.001 0.002 0.006 q检验：与溶媒对照组比较**P < 0.01；与低剂量组比较##P < 0.01
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图(2)表(6)
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