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糖尿病性心肌病(DCM)主要是由2型糖尿病引起的一种心肌功能障碍，属于糖尿病晚期并发症，由于它可引起病人的心脏结构和功能发生障碍，是导致糖尿病病人死亡的重要危险因素之一[1]。DCM发病机制尚未完全阐明。研究[2]显示，DCM的发生、发展涉及多种病理变化，如糖脂代谢紊乱、血管和微血管病变、炎症反应、心肌纤维化及氧化应激等。
熊果酸(UA)是一种存在于唇形科、冬青科等植物的叶、果实中的萜类化合物[3]。它是一种天然活性物质，毒性小，副作用低。目前已证实UA具有抑制肿瘤细胞增殖、保护肝脏损伤、抗菌消炎、延缓动脉粥样硬化形成等药理作用。UA通过降低胰岛素抵抗的敏感性，从而降低血糖[4-5]。UA在发挥降糖作用的同时，对肾病有一定的保护作用[6]。而UA在降糖过程中，对DCM的改善作用尚无报道。本研究模拟2型糖尿病大鼠心肌损伤模型，应用不同剂量UA干预，通过观察SD大鼠的一般体征，测定空腹血糖、随机血糖、心质量指数(HWI)、血清肌酸激酶(CK)和同工酶(CK-MB)活性，血清和心肌组织中晚期糖基化终产物(AGEs)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平，并直接观察心肌组织病理改变，考察UA对DCM心脏损伤的作用，研究其降糖、保护心肌损伤作用的相关机制。现作报道。
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选取SPF级SD雄性大鼠70只，体质量220~250 g，12~14周龄，购于北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：SCXK(京)2014-0004]。所有大鼠均于华北理工大学动物实验中心屏障实验室，以一笼5只进行饲养。
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70只SPF级雄性SD大鼠，室温25 ℃，普通饲料适应性喂养1周后随机分为2组：正常对照组(NC组)10只，造模组60只。NC组给予普通饲料喂养，造模组给予高糖高脂饲料(普通饲料73%、蔗糖10%、熟猪油15%以及胆固醇2%)喂养；自由进食以及饮水。造模组喂养4周后，尾静脉注射30 mg/kg链脲菌素(浓度为1.5%)1周。5周后所有SD大鼠尾静脉血测随机血糖，以3次随机血糖均值及糖耐量2 h血糖≥16.7 mmol/L视为造模成功。
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造模组60只中剔除不合标准的大鼠10只，将符合成模标准的大鼠50只，按随机数字表法分为模型对照组(MC组)、二甲双胍组(MFG组，100 mg/kg)、UA低剂量组(UA-L组，25 mg/kg)、UA中剂量组(UA-M组，50 mg/kg)和UA高剂量组(UA-H组，100 mg/kg) 5组，每组10只。按照上述设定剂量，药物用5 g/L羧甲基纤维素钠溶液溶解，现配现用。分组后，灌胃给予相应药物，MC组与NC组每天灌胃同容积5 g/L羧甲基纤维素钠溶液，给药6周。
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(1) 各组大鼠一般状态观察：观察各组大鼠活动情况、精神状态、大小便等。每周测定体质量1次，观察并记录进食量、饮水量，每周1次。(2)大鼠血清及心脏样本采集：给药6周后，SD大鼠禁食不禁水12 h，按照大鼠体质量，麻醉大鼠。腹主动脉取血，离心，吸取清液，用全自动生化分析仪迅速测定生化指标CK和CK-MB的活性；ELISA法测定血清中AGEs、SOD、MDA和TNF-α水平。摘取心脏后将心脏分为两部分，一部分心尖部位用多聚甲醛(40 g/L)固定，用于HE染色观察组织形态学变化。另一部分心脏立即放入-80 ℃冰箱，备用(ELISA法测定氧化应激指标SOD、MDA，AGEs和炎症因子TNF-α水平)。(3)大鼠HWI：测定心脏质量，HWI=心脏质量/体质量(mg/g)。(4)大鼠心脏组织HE染色病理观察：将心脏组织进行取材，梯度脱水(依次用50%、70%、80%、90%、95%及100%乙醇作用2.5、2.5、3、3、3、2 h)，透明，浸蜡，包埋，载玻片预清洗，切片和HE染色，光学显微镜下观察心肌组织的病理组织结构，并成像记录。
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采用方差分析和q检验。
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造模前，各组大鼠的各项指标均处于正常范围；造模后，造模组大鼠精神状态欠佳，毛色暗淡，反应不灵敏，活动量减少，大便稀薄，出现“多饮、多食且多尿”；连续给药UA 6周后各剂量组精神状态有所好转，活动量增加，毛色枯黄无光泽现象改善，其中UA-H组改善效果最为明显。
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与NC组比较，MC组大鼠血清CK以及CK-MB的活性明显上升(P < 0.01)；与MC组大鼠比较，UA给药组均可抑制糖尿病大鼠血清CK、CK-MB的活性，但仅UA-H组大鼠血清CK的活性低于MC组(P < 0.05)，其余各组与MC组差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 1)。
分组 CK CK-MB NC组 653.57±63.72 265.24±58.63 MC组 814.69±93.58** 416.59±64.68** MFG组 718.53±74.84# 362.13±72.25** UA-L组 804.52±81.73** △ 394.28±69.65** UA-M组 774.74±70.94* 381.14±93.59** UA-H组 701.81±62.35#□ 345.11±63.62* F 7.13 5.52 P < 0.01 < 0.01 MS组内 5 669.713 5 083.126 q检验：与NC组比较*P < 0.05，**P < 0.01；与MC组比较#P < 0.05；与MFG组比较△P < 0.05；与UA-L组比较□P < 0.05 表 1 各组大鼠CK和CK-MB水平比较(ni=10;x±s；U/L)
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与NC组相比，MC组大鼠血清和心脏组织中TNF-α、MDA和AGEs水平均明显提升(P < 0.01)，SOD水平均明显下降(P < 0.01)。给药6周后，与MC组相比，MFG组大鼠血清和心脏组织中TNF-α、MDA和AGEs水平明显下降，SOD水平明显提升(P < 0.01)。与MC组相比，UA-L组、UA-M组血清AGEs、MDA和TNF-α均明显降低(P < 0.01)，SOD水平均明显提高(P < 0.01)。与MFG组相比，UA-H组在降低2型糖尿病大鼠血清和心脏组织中TNF-α、MDA和AGEs水平以及提高SOD水平方面效果相当，差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 2、3)。
分组 AGEs/(ng /L) SOD/(U/L) MDA/(μmol /L) TNF-α/(ng/L) NC组 3.04±0.28 63.46±6.72 10.46±0.92 25.36±3.67 MC组 3.99±0.37** 41.36±6.34** 25.45±3.35** 43.86±4.93** MFG组 3.42±0.42## 58.56±5.63## 16.27±3.45**## 33.57±3.46**## UA-L组 4.12±0.35** △△ 39.93±7.21** △△ 24.16±4.27** △△ 41.67±4.79** △△ UA-M组 3.47±0.42##□□ 49.78±5.62**##△□□ 19.34±3.74**##□□ 37.56±4.21**##△□ UA-H组 3.36±0.34##□□ 56.55±5.47##□□▲ 17.17±2.58**##□□ 30.47±4.05*##□□▲▲ F 12.45 23.84 28.99 27.41 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.134 38.423 10.474 17.803 q检验：与NC组比较*P < 0.05，** P < 0.01；与MC组比较#P < 0.05, ##P < 0.01；与MFG组比较△P < 0.05, △△P < 0.01；与UA-L组比较□P < 0.05, □□P < 0.01;与UA-M组比较▲P < 0.05, ▲▲P < 0.01 表 2 各组大鼠血清中AGEs、SOD、MDA和TNF-α水平比较(ni=10；x±s)
分组 AGEs/(ng/L) SOD/(U/L) MDA/(μ mol/L) TNF-α/(ng/L) NC组 5.34±0.56 54.26±5.57 14.57±1.66 25.36±3.67 MC组 7.99±1.01** 34.72±5.24** 26.72±6.47** 43.86±4.93** MFG组 6.42±0.87*## 45.67±5.58**## 23.46±5.78** 33.57±3.46**## UA-L组 7.12±1.12**# 35.58±4.53**##△△ 27.53±6.21** 41.67±4.79** △△ UA-M组 6.47±0.83*## 38.46±4.76** △ 25.45±4.53** 37.56±4.21**##△□ UA-H组 6.36±0.79*## 43.43±4.99**##□□▲ 20.68±4.45* 30.47±4.05*##□□▲▲ F 10.04 20.74 8.95 27.41 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.778 26.283 26.152 17.803 q检验：与NC组比较*P < 0.05，**P < 0.01；与MC组比较#P < 0.05, ##P < 0.01；与MFG组比较△P < 0.05, △△P < 0.01；与UA-L组比较□P < 0.05, □□P < 0.01;与UA-M组比较▲P < 0.05, ▲▲P < 0.01 表 3 各组大鼠心脏组织AGEs、SOD、MDA和TNF-α水平比较(ni=10；x±s)
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各组大鼠HWI间差异无统计学意义(P>0.05)(见表 4)。
分组 HWI F P MS组内 NC组 2.72±0.32 MC组 2.86±0.31 MFG组 2.67±0.34 0.44 >0.05 0.115 UA-L组 2.79±0.40 UA-M组 2.83±0.28 UA-H组 2.75±0.37 表 4 各组大鼠HWI比较(ni=10；x±s；mg/g)
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与NC组比较，MC组大鼠心肌出现结构断裂、排列紊乱的现象，染色不均，形态不一；细胞肿胀、疏松，出现可见炎细胞浸润和成纤维细胞浸润。与MC组比较，UA药物干预后，心肌细胞体积不同程度减小，其中UA-H组心肌结构排列与MC组有明显差异：整齐、致密、结构清晰、细胞核呈卵圆形，心肌细胞的细胞核和线粒体结构完整，有轻微的炎性细胞浸润及组织形态结构改变。MFG组心肌结构较排列整齐致密，心肌细胞轻度肿胀，结构清晰、心肌细胞膜比较完整，有少量炎性细胞浸润及轻度成纤维细胞浸润(见图 1)。
图 1 HE染色示各组大鼠心肌组织形态学结构
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1972年，RUBLER等[7]首先提出了DCM的概念。通过对4例心力衰竭病人进行尸解，均为糖尿病肾小球硬化症的死亡病人，发现除糖尿病外并不存在其他因素导致的心力衰竭，所以称之为DCM。现代医学对DCM的概念进行重新定义，将存在糖尿病史、伴发心肌结构及功能变化，同时排除高血压、缺血性疾病以及其他可诱发心肌病变的疾病列为DCM的范畴[8]。对于DCM病人而言，其心肌结构发生了显著变化，诸如左心室室壁厚度及质量增加；接近正常的左心室出现明显地舒张末期容积；心肌细胞出现明显地脂肪沉积；心肌明显出现肥厚及纤维化特征。
大量研究[9-10]表明, CK、CK-MB是实验室检测心肌损伤的重要标志物。CK及CK-MB在心肌中含量最多[11-12]，且研究证实心肌细胞受到损伤时，原本在正常血清中含量极微的CK，快释放到血液中，导致血清中含量升高[13]。以往的实验[14]证实，高血糖能够影响心肌能量代谢从而造成脂肪堆积、葡萄糖代谢途径的减弱，脂肪、组织蛋白质的氨基基团和还原糖的醛基相互作用，生成的化合物被称为AGEs。AGEs与受体结合后，参与机体氧化应激和炎症反应，促进机体的MDA过剩，抑制SOD酶的活性，推动炎症因子的释放最终导致心肌功能的破坏[15]。
本研究表明，UA具有降低2型糖尿病大鼠血清CK和CK-MB活性的作用；降低2型糖尿病大鼠血清和心肌组织AGEs、MDA、TNF-α水平和提高SOD水平作用；经长期给药可改善2型糖尿病大鼠心肌组织损伤的病理状态。UA对2型糖尿病大鼠心肌损伤具有保护作用，其机制可能与其降低大鼠血糖、降低AGEs和炎症因子TNF-α水平及改善其氧化应激有关。
熊果酸对2型糖尿病大鼠心肌保护作用研究
Study of protective effect of ursolic acid on myocardial injury of type 2 diabetic rats
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摘要:
目的观察熊果酸对2型糖尿病大鼠心肌保护作用。 方法构建2型糖尿病大鼠模型，成模大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、熊果酸低剂量组、熊果酸中剂量组、熊果酸高剂量组和二甲双胍对照组，各组灌胃给予相应药物。给药期间观察各组SD大鼠精神状态、饮食量、尿量等。末次给药麻醉后腹主动脉采血后分离心脏并称质量，计算心质量指数；用全自动生化分析仪测定肌酸激酶（CK）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）的活性；ELISA法检测血清和心肌组织中晚期糖基化终产物（AGEs）、肿瘤坏死因子（TNF）-α、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的水平；心脏组织常规石蜡包埋，HE染色，光镜下观察组织形态学变化。 结果熊果酸高剂量组大鼠血清CK的活性低于模型对照组（P < 0.05）；熊果酸高剂量组降低2型糖尿病大鼠血清和心脏组织中TNF-α、MDA和AGEs水平以及提高SOD水平效果与二甲双胍组相当，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论熊果酸对2型糖尿病大鼠心肌损伤具有保护作用，其机制可能与其降低大鼠血糖、降低AGEs和炎症因子TNF-α水平及改善其氧化应激有关。 Abstract:ObjectiveTo observe the effects of ursolic acid on cardiomyopathy of type 2 diabetic rats. MethodsThe SD rat model with type 2 diabetes mellitus was randomly divided into the control group, model group, low dose of ursolic acid group, middle dose of ursolic acid group, high dose of ursolic acid group and metformin group.Each group was treated with intragastric administration using corresponding drugs, and the mental state, diet quantity and urine volume of SD rat in each group were observed during administration.The blood of abdominal aorta was collected after final administration and anesthesia, the heart was harvested and weighed, and the heart weight index was calculated.The activities of creatine kinase(CK) and creatine kinase isoenzyme(CK-MB)were determined by automatic biochemical analyzer.The serum levels of AGEs, TNF-α, SOD and MDA in myocardium tissue were detected using ELISA.The heart tissue was embedded in paraffin, stained using HE, and the change of issue morphology was observed under the light microscope. ResultsThe activity of serum CK in high dose of ursolic acid group was lower than that in control group(P < 0.05).The high dose of ursolic acid could decrease the levels of TNF-α, MDA and AGEs, and increase the level of SOD in serum and heart tissues in type 2 diabetic rats, the effect of which was similar to that of metformin, and the difference of the effect between high dose of ursolic acid and metformin was not statistically significant(P>0.05). ConclusionsUrsolic acid has protective effect on myocardial injury in rats with type 2 diabetes mellitus, and the mechanism of which may be related to reduce the levels of AGEs and TNF-α, and improve the oxidative stress of rats. -
Key words:
- type 2 diabetes mellitus /
- diabetic myocardial injury /
- ursolic acid
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表 1 各组大鼠CK和CK-MB水平比较(ni=10;x±s；U/L)
分组 CK CK-MB NC组 653.57±63.72 265.24±58.63 MC组 814.69±93.58** 416.59±64.68** MFG组 718.53±74.84# 362.13±72.25** UA-L组 804.52±81.73** △ 394.28±69.65** UA-M组 774.74±70.94* 381.14±93.59** UA-H组 701.81±62.35#□ 345.11±63.62* F 7.13 5.52 P < 0.01 < 0.01 MS组内 5 669.713 5 083.126 q检验：与NC组比较*P < 0.05，**P < 0.01；与MC组比较#P < 0.05；与MFG组比较△P < 0.05；与UA-L组比较□P < 0.05 
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表 2 各组大鼠血清中AGEs、SOD、MDA和TNF-α水平比较(ni=10；x±s)
分组 AGEs/(ng /L) SOD/(U/L) MDA/(μmol /L) TNF-α/(ng/L) NC组 3.04±0.28 63.46±6.72 10.46±0.92 25.36±3.67 MC组 3.99±0.37** 41.36±6.34** 25.45±3.35** 43.86±4.93** MFG组 3.42±0.42## 58.56±5.63## 16.27±3.45**## 33.57±3.46**## UA-L组 4.12±0.35** △△ 39.93±7.21** △△ 24.16±4.27** △△ 41.67±4.79** △△ UA-M组 3.47±0.42##□□ 49.78±5.62**##△□□ 19.34±3.74**##□□ 37.56±4.21**##△□ UA-H组 3.36±0.34##□□ 56.55±5.47##□□▲ 17.17±2.58**##□□ 30.47±4.05*##□□▲▲ F 12.45 23.84 28.99 27.41 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.134 38.423 10.474 17.803 q检验：与NC组比较*P < 0.05，** P < 0.01；与MC组比较#P < 0.05, ##P < 0.01；与MFG组比较△P < 0.05, △△P < 0.01；与UA-L组比较□P < 0.05, □□P < 0.01;与UA-M组比较▲P < 0.05, ▲▲P < 0.01
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表 3 各组大鼠心脏组织AGEs、SOD、MDA和TNF-α水平比较(ni=10；x±s)
分组 AGEs/(ng/L) SOD/(U/L) MDA/(μ mol/L) TNF-α/(ng/L) NC组 5.34±0.56 54.26±5.57 14.57±1.66 25.36±3.67 MC组 7.99±1.01** 34.72±5.24** 26.72±6.47** 43.86±4.93** MFG组 6.42±0.87*## 45.67±5.58**## 23.46±5.78** 33.57±3.46**## UA-L组 7.12±1.12**# 35.58±4.53**##△△ 27.53±6.21** 41.67±4.79** △△ UA-M组 6.47±0.83*## 38.46±4.76** △ 25.45±4.53** 37.56±4.21**##△□ UA-H组 6.36±0.79*## 43.43±4.99**##□□▲ 20.68±4.45* 30.47±4.05*##□□▲▲ F 10.04 20.74 8.95 27.41 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.778 26.283 26.152 17.803 q检验：与NC组比较*P < 0.05，**P < 0.01；与MC组比较#P < 0.05, ##P < 0.01；与MFG组比较△P < 0.05, △△P < 0.01；与UA-L组比较□P < 0.05, □□P < 0.01;与UA-M组比较▲P < 0.05, ▲▲P < 0.01
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表 4 各组大鼠HWI比较(ni=10；x±s；mg/g)
分组 HWI F P MS组内 NC组 2.72±0.32 MC组 2.86±0.31 MFG组 2.67±0.34 0.44 >0.05 0.115 UA-L组 2.79±0.40 UA-M组 2.83±0.28 UA-H组 2.75±0.37
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