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丹酚酸B抗大鼠脑缺血作用及机制研究

王晓娟 宋剑锋 王继芹

引用本文:
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丹酚酸B抗大鼠脑缺血作用及机制研究

    作者简介: 王晓娟(1990-), 女, 药师
    通讯作者: 王继芹, wjqshcn@163.com
  • 基金项目:

    上海市闵行区科委自然科学基金 2018MHZ054

    上海市闵行区中心医院青年基金资助项目 2016MHJC07

  • 中图分类号: R743.31

Effect and mechanism of salvianolic acid B on cerebral ischemia in rats

    Corresponding author: WANG Ji-qin, wjqshcn@163.com
  • CLC number: R743.31

  • 摘要: 目的观察丹酚酸B对缺血性脑卒中的保护作用及其机制。方法利用电凝法构建大脑中动脉栓塞模型,50只大鼠随机分为5组,空白对照组给予0.9%氯化钠注射液1 mL/kg;阳性对照组给予阿司匹林10 mg/kg;丹酚酸B低剂量组给予丹酚酸B 10 mg/kg;中剂量组给予丹酚酸B 20 mg/kg;高剂量组给予丹酚酸B 40 mg/kg,测量脑梗死面积、血栓重量,检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)。结果各组脑梗死面积及行为学评分差异均有统计学意义(P < 0.01和P < 0.05)。与空白对照组相比,不同剂量丹酚酸B脑梗死面积均明显缩小(P < 0.01)。5组血栓湿重及最大聚集率差异均有统计学意义(P < 0.01)。空白对照组血栓湿重均大于阳性对照组及丹酚酸B低、中、高剂量组(P < 0.01),最大聚集率高于阳性对照组及丹酚酸B中、高剂量组(P < 0.01)。5组PT间差异无统计学意义(P>0.05),TT、APTT、FIB差异有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)。结论丹酚酸B可通过抑制血小板聚集降低血栓形成,改善血液高凝状态,有效治疗缺血性脑卒中。
  • 表 1  注射用丹酚酸B抗大鼠脑缺血梗死面积与行为学评分比较(x±s)

    分组 n 脑梗面积/% 行为学评分/分
    空白对照组 10 38.4±2.95 2.30±0.66
    低剂量组 10 31.5±3.40** 1.93±0.73
    中剂量组 10 24.9±3.57** 1.75±0.64
    高剂量组 10 18.9±4.20** 1.64±0.67
    F 61.68 2.26
    P <0.01 <0.05
    MS组内 12.616 0.387
    q检验:与空白对照组比较**P<0.01
    下载: 导出CSV

    表 2  丹酚酸B对大鼠血栓形成的影响(x±s)

    分组 n 血栓湿重/mg PAGM /% 聚集抑制率/%
    空白对照组 10 42.7±8.12 37.4±6.05
    阳性对照组 10 21.2±3.31** 23.0±6.08** 38.4
    低剂量组 10 28.6±5.34** 33.0±7.05 11.7
    中剂量组 10 20.8±4.83** 30.3±4.31** 19.0
    高剂量组 10 21.4±4.24** 26.8±5.87** 28.4
    F 30.03 8.72
    P <0.01 <0.01
    MS组内 29.343 35.261
    q检验:与空白对照组比较**P<0.01
    下载: 导出CSV

    表 3  注射用丹酚酸B对大鼠凝血四项的影响(x±s)

    分组 n PT/s APTT/s TT/s FIB/(g/L)
    空白对照组 10 16.3±1.23 20.5±0.73 30.0±6.15 3.85±0.57
    阳性对照组 10 16.9±0.48 20.7±1.83 34.5±2.36* 3.90±0.35
    低剂量组 10 16.0±0.98 20.4±0.69 33.1±2.79 4.01±0.51
    中剂量组 10 16.2±1.02 21.1±1.14 32.3±4.65 3.35±0.62
    高剂量组 10 16.4±2.65 24.8±3.73** 35.7±4.67* 2.99±0.54**
    F 0.52 8.88 2.54 6.81
    P >0.05 <0.01 <0.05 <0.01
    MS组内 2.153 3.914 18.922 0.277
    q检验:与空白对照组比较*P < 0.05,**P<0.01
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-03-19
  • 录用日期:  2019-05-21
  • 刊出日期:  2019-06-15

丹酚酸B抗大鼠脑缺血作用及机制研究

    通讯作者: 王继芹, wjqshcn@163.com
    作者简介: 王晓娟(1990-), 女, 药师
  • 1. 上海市闵行区中心医院/复旦大学附属闵行医院 药剂科, 上海 201199
  • 2. 上海市闵行区中心医院/复旦大学附属闵行医院 急诊科, 上海 201199
基金项目:  上海市闵行区科委自然科学基金 2018MHZ054上海市闵行区中心医院青年基金资助项目 2016MHJC07

摘要: 目的观察丹酚酸B对缺血性脑卒中的保护作用及其机制。方法利用电凝法构建大脑中动脉栓塞模型,50只大鼠随机分为5组,空白对照组给予0.9%氯化钠注射液1 mL/kg;阳性对照组给予阿司匹林10 mg/kg;丹酚酸B低剂量组给予丹酚酸B 10 mg/kg;中剂量组给予丹酚酸B 20 mg/kg;高剂量组给予丹酚酸B 40 mg/kg,测量脑梗死面积、血栓重量,检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)。结果各组脑梗死面积及行为学评分差异均有统计学意义(P < 0.01和P < 0.05)。与空白对照组相比,不同剂量丹酚酸B脑梗死面积均明显缩小(P < 0.01)。5组血栓湿重及最大聚集率差异均有统计学意义(P < 0.01)。空白对照组血栓湿重均大于阳性对照组及丹酚酸B低、中、高剂量组(P < 0.01),最大聚集率高于阳性对照组及丹酚酸B中、高剂量组(P < 0.01)。5组PT间差异无统计学意义(P>0.05),TT、APTT、FIB差异有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)。结论丹酚酸B可通过抑制血小板聚集降低血栓形成,改善血液高凝状态,有效治疗缺血性脑卒中。

English Abstract

  • 随着中国人口的老龄化,缺血性脑卒中的发病率逐年上升,给社会和家庭造成巨大的经济负担[1]。然而对缺血性脑卒中的有效治疗依然维持在较低水平,临床指南推荐的静脉溶栓治疗虽然疗效确切,但由于治疗时间窗狭窄,溶栓率极低[2-3]。丹酚酸B是药用植物丹参中提取的含量最多的水溶性成分,有活血化瘀的功效,具有抗血小板聚集、改善血流动力学的药理活性,研究[4-5]发现其具有治疗缺血性脑卒中的作用,然而机制并不明确。本研究采用电凝法建立大脑中动脉栓塞模型,探究丹酚酸B治疗缺血性脑卒中的作用及量效关系,并研究其作用机制,为临床用于治疗缺血性脑卒中提供依据。

    • 注射用丹酚酸B原料药,国药集团广东环球制药有限公司;0.9%氯化钠注射液,山东华鲁制药有限公司;甲醛,国药集团化学试剂有限公司;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC),生工生物工程(上海)股份有限公司;注射用精氨酸阿司匹林,瑞阳制药有限公司;肝素钠,上海圆创生物科技有限公司;ADP,Solarbio公司。

    • SD-78双极电凝器,上海医疗器械高技术公司;XTS-4A手术显微镜,江苏镇江中天光学仪器有限责任公司;颅骨钻,韩国精密仪器厂;聚乙烯管,法国Biotrol公司;血小板聚集仪,北京赛科希德科技发展有限公司;血凝仪,西班牙Werfen公司。

    • SD大鼠,SPF级,雄性,体质量160~200 g,购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。所有实验动物根据《中华人民共和国实验动物管理条例》规定,全部得到了应有的人文关怀和照顾,不存在虐待动物情况。动物购回后在本单位动物房适应性饲养3 d,大鼠饲料喂养,自由饮水,光线12 h明暗自动转换,室内温度(20±2)℃。丹酚酸B抗大鼠脑缺血量效关系实验中,50只大鼠随机分为5组,即空白对照组给予0.9%氯化钠注射液1 mL/kg;阳性对照组给予阿司匹林10 mg/kg;丹酚酸B低剂量组给予丹酚酸B 10 mg/kg,中剂量组给予丹酚酸B 20 mg/kg,高剂量组给予丹酚酸B 40 mg/kg。给药10 min后进行手术或股动脉取血。

    • 大脑中动脉栓塞手术(MCAO,电凝法):实验方法参考改进的LONGA等[7]方法。用15%的水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉,左侧卧位固定在手术台,左侧颞顶部及面部剃毛,用75%乙醇消毒后在左眼和左耳之间切开皮肤,钝性分离颞肌和咬肌,暴露颞骨翼板,于手术显微镜下,在颞骨和颞鳞骨结合靠近口侧1 mm处用颅骨钻研磨出2 mm×2 mm的骨窗,撬开颅骨。此时,透过硬脑膜即可见大脑中动脉。用双极电凝镊在嗅束内1 mm至大脑下静脉之间处烧灼,将血流彻底阻断后止血,依次缝合颞肌和皮肤,然后给药。待大鼠苏醒后,放回笼中继续饲养24 h。

      在体血栓的制备:术前准备6 cm长的4号手术丝线若干,称量单根丝线的重量。准备长约10 cm的硅胶管,管内放置一根长6 cm的4号手术丝线,硅胶管两端连接8 cm长的聚乙烯塑料管,结扎固定后向管内充满50 u/mL肝素盐水,备用。大鼠称重后用15%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉,尾静脉注射给药,给药体积为1 mL/kg,10 min后开始手术,大鼠仰卧位固定于鼠板上,牵出舌头。颈部剃毛,用75%乙醇消毒,纵向剪开颈部皮肤,分离右侧颈总动脉和左侧颈外静脉,将备制好的聚乙烯管一端先插入左侧颈外静脉,另一端插入右侧颈总动脉,打开动脉夹,血液从右侧颈总动脉流经管道返回左侧颈外静脉。开放15 min后阻断血流,迅速取出丝线称重,总重量减去丝线干重量即是血栓湿重。

    • 大鼠腹腔注射麻醉,断头取脑,去除嗅球、小脑和脑干,-20 ℃冰箱中速冻20 min左右;将冰冻好的大脑等分切成7片;将脑切片置于0.5%的TTC染液中进行染色(40 ℃避光温孵10 min),染色后的脑片梗死区呈白色,非梗死区呈玫瑰红色;染色完成后将脑片移到10%的甲醛溶液中,避光保存24 h,拍照后用图像分析软件(Image J,版本:1.4.3.67)测量。

    • 采用LONGA标准,0分:无神经损伤症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:向对侧转圈;3分:向对侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失[6]

    • 大鼠尾静脉注射药物10 min后,股动脉取血,抗凝(3.8%柠檬酸三钠:全血=1:9),800 r/min离心10 min,在此转速得到的血浆是富含血小板血浆(PRP),吸出PRP后,剩余血液3 000 r/min离心10 min,此时转速得到的血浆是贫血小板血浆(PPP)。吸取200 μL PPP加入血小板聚集仪测量管,设定该测量管的透光率为100%。测量时将200 μL PRP加入含有磁力搅拌棒和ADP诱导剂的测量管,放入此前已经定标的通道进行检测,由于加入ADP后会引起血小板聚集而使光的通透性发生改变,据此原理测量PAGM。血小板聚集抑制率=(对照组PAGM-治疗组PAGM)/对照组PAGM×100%

    • 大鼠尾静脉注射药物10 min后,股动脉取血,至于枸橼酸钠抗凝管中摇匀,通过血凝仪,凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)。

    • 采用方差分析和q检验。

    • 各组脑梗死面积及行为学评分差异均有统计学意义(P < 0.01和P < 0.05)。与空白对照组相比,不同剂量丹酚酸B脑梗死面积均明显缩小(P<0.01)(见表 1)。

      分组 n 脑梗面积/% 行为学评分/分
      空白对照组 10 38.4±2.95 2.30±0.66
      低剂量组 10 31.5±3.40** 1.93±0.73
      中剂量组 10 24.9±3.57** 1.75±0.64
      高剂量组 10 18.9±4.20** 1.64±0.67
      F 61.68 2.26
      P <0.01 <0.05
      MS组内 12.616 0.387
      q检验:与空白对照组比较**P<0.01

      表 1  注射用丹酚酸B抗大鼠脑缺血梗死面积与行为学评分比较(x±s)

    • 5组血栓湿重及PAGM差异均有统计学意义(P<0.01)。空白对照组血栓湿重均大于阳性对照组及丹酚酸B低、中、高剂量组(P<0.01),PAGM高于阳性对照组及丹酚酸B中、高剂量组(P<0.01)(见表 2)。

      分组 n 血栓湿重/mg PAGM /% 聚集抑制率/%
      空白对照组 10 42.7±8.12 37.4±6.05
      阳性对照组 10 21.2±3.31** 23.0±6.08** 38.4
      低剂量组 10 28.6±5.34** 33.0±7.05 11.7
      中剂量组 10 20.8±4.83** 30.3±4.31** 19.0
      高剂量组 10 21.4±4.24** 26.8±5.87** 28.4
      F 30.03 8.72
      P <0.01 <0.01
      MS组内 29.343 35.261
      q检验:与空白对照组比较**P<0.01

      表 2  丹酚酸B对大鼠血栓形成的影响(x±s)

    • 5组PT间差异无统计学意义(P>0.05),TT、APTT、FIB差异有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01),丹酚酸B高剂量组APTT、TT、FIB均高于空白对照组(P<0.05~P<0.01)(见表 3)。

      分组 n PT/s APTT/s TT/s FIB/(g/L)
      空白对照组 10 16.3±1.23 20.5±0.73 30.0±6.15 3.85±0.57
      阳性对照组 10 16.9±0.48 20.7±1.83 34.5±2.36* 3.90±0.35
      低剂量组 10 16.0±0.98 20.4±0.69 33.1±2.79 4.01±0.51
      中剂量组 10 16.2±1.02 21.1±1.14 32.3±4.65 3.35±0.62
      高剂量组 10 16.4±2.65 24.8±3.73** 35.7±4.67* 2.99±0.54**
      F 0.52 8.88 2.54 6.81
      P >0.05 <0.01 <0.05 <0.01
      MS组内 2.153 3.914 18.922 0.277
      q检验:与空白对照组比较*P < 0.05,**P<0.01

      表 3  注射用丹酚酸B对大鼠凝血四项的影响(x±s)

    • 丹参为唇形科植物,其根和根茎作为中药,有活血祛瘀的功效[4]。丹酚酸B是从丹参中提取的含量最多的水溶性成分,具有较强的抗脑损伤的作用[5, 7]。本研究发现,丹酚酸B具有很好的抗大鼠脑缺血的功效,并呈现良好的量效关系,提示丹酚酸B可有效的减少脑梗死面积,改善脑缺血后神经功能的恢复。

      缺血性脑卒中的发生和病理生理变化与机体凝血-纤溶系统密切相关[8-9]。研究[10]表明,血液的高凝状态是脑卒中发生的危险因素之一。脑血栓的形成有三大条件,包括内皮细胞的损伤、血液流变学异常以及血液的高凝状态[11-12]。脑血栓形成后又会加重这些变化,形成恶性循环[13-14]。因此, 改善血凝状态能够预防和治疗脑缺血。目前针对凝血-纤溶系统的药物包括组织型纤溶酶原激活物、阿司匹林等。然而由于治疗时间窗短,组织型纤溶酶原激活物的应用率不足20%[3]

      本研究用聚氯乙烯管在大动脉和大静脉之间形成短路,聚氯乙烯管中间的丝线属于异物,当血液从动脉流向静脉后,可导致血小板附着、聚集形成血栓。此实验很好的模拟在体血栓形成的过程,探究丹酚酸B抗血小板功能。研究[10]表明,丹酚酸B减轻血栓重量,能抑制血栓形成。

      血栓形成过程中,血小板具有重要的作用,其激活包括三个阶段,即黏附反应、释放反应和聚集反应。血栓形成初期,血小板首先黏附在内皮细胞损伤后外露的胶原表面。黏附后血小板被激活,释放出ADP、5-HT等物质,引起血流中血小板的聚集,进而启动内源性或外源性凝血途径,最终凝血酶促进纤维蛋白原转变为纤维蛋白,将血小板固定于血管壁表面,形成血栓[11]

      本研究结果显示,丹酚酸B能够有效抑制血小板的聚集,高剂量丹酚酸B能够改善血液的高凝状态,防止血栓形成。

参考文献 (15)

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