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川芎嗪又称四甲基吡嗪，存在于川芎、当归等中药材中，具有理气、化瘀、活血的功效，临床上用于心脑血管、呼吸系统等疾病的治疗，适用于冠心病、脉管炎、心绞痛、脑血栓、缺血性脑血管病等[1-3]。建立血浆中川芎嗪的检测方法，对深入研究川芎嗪在生物体内的作用及作用机制具有重要意义。
目前，川芎嗪的分析方法主要包括高效液相色谱法[4-6]和色谱质谱联用法[7-8]，其中液相色谱质谱联用法虽然检测灵敏度高，但设备昂贵、检测成本较高，高效液相色谱法一般使用紫外检测器或二极管阵列检测器，检测成本较低，但检测灵敏度较色谱质谱联用法低。为了提高高效液相色谱法的检测灵敏度，通常使用固相萃取技术对样品进行浓缩、净化[9-10]。纳米纤维固相萃取技术是一种以电纺纳米纤维为吸附材料的固相萃取技术[11]，与传统的固相萃取技术相比，纳米纤维作为吸附剂具有更大的比表面积，能更有效地吸附目标物，因此，少量的纳米纤维就能达到很好的吸附效果，同时具有样品量、洗脱剂用量和有机溶剂用量少等优势。目前纳米纤维固相萃取技术已经在食品中有害物质检测、环境中有害物质检测、生物样品中生物标志物以及药物检测等分析领域中成功应用[12-20]。生物样品一般样品量较少，使用纳米纤维固相萃取技术，将有效提高目标物的提取效率，同时能有效提高目标物的浓缩倍数，提高检测灵敏度。本研究建立基于纳米纤维固相萃取技术的人血浆中川芎嗪的高效液相色谱检测方法。现作报道。
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LC-20AD高效液相色谱仪(包括LC-20AD泵，SPD-M20A二极管阵列检测器，CTO-10ASVP柱温箱)(日本，岛津)，JEM-2010透射电子显微镜(日本，Jeol)，AB265-S分析天平(瑞士，METTLER TOLEDO)，Master-S15UVF纯水系统(上海和泰仪器有限公司)，XH-C涡旋混合器(白塔新宝仪器厂)，A-6纳米纤维固相萃取仪(苏州东奇生物科技有限公司)，PCAX型复合阴离子交换纳米纤维固相萃取柱(苏州东奇生物科技有限公司，纳米纤维直径200~300 nm)。
盐酸川芎嗪(纯度83.4%，化学对照品，批号110817-201608，中国食品药品检定研究院)，空白人血浆(健康成人，安庆市立医院)，氨水(分析纯，上海阿拉丁生化科技有限公司)，磷酸(分析纯，上海联试化工试剂有限公司)，冰乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。
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电子显微镜观察纳米纤维固相萃取柱中的纳米纤维，纤维直径为200~300 nm，纤维表面略粗糙(见图 1)。
图 1 电子显微镜下观察纳米纤维
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按照参考文献方法[4-6]和预实验，确定色谱条件为：岛津ODS-2色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相甲醇1%冰醋酸水溶液(45:55，V/V)；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长295 nm；进样量20 μL。
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取适量盐酸川芎嗪对照品，甲醇溶解，配制成1 mg/mL标准储备液，于4 ℃保存。以甲醇逐级稀释标准储备液，得到实验所需浓度的系列标准溶液。
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人血浆中的其他成分如蛋白质、盐等浓度较高，会影响纳米纤维固相萃取柱的提取效率，同时样品pH值也影响纳米纤维固相萃取柱的提取效率。本实验分别选取5%氨水、1%氨水、0.5%氨水、0.1%氨水、去离子水和0.5%磷酸水溶液，在控制其他条件不变的基础上，考察pH值以及不同浓度氨水对川芎嗪提取效率的影响。结果表明酸性环境不利于川芎嗪的提取，同时，随着氨水浓度的提高，芎嗪的提取效率升高，因此本实验选择1%氨水作为样品稀释液。
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提高样品溶液的稀释倍数可以减少杂质浓度，降低杂质对川芎嗪提取效率的影响，在控制其他条件不变的基础上，本实验观察样品溶液稀释1、2、3、4、5倍后对回收率的影响。结果表明稀释倍数为3倍时，提取效率较稀释倍数为2倍和1倍的高，稀释倍数大于3倍后，提取效率趋于稳定，但较大的稀释倍数会增加过柱时间，降低样品处理效率，因此本实验选择使用样品稀释液把血浆样品稀释3倍。
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选择适当淋洗溶液可减少洗脱液中杂质，一方面能净化色谱图，去除杂质干扰，一方面能防止血浆中的蛋白质污染色谱柱，延长色谱柱寿命。本实验分别采用200 μL去离子水、5%甲醇水溶液、10%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液进行淋洗。结果表明随着甲醇浓度的提高，目标物的回收率逐渐降低，色谱图中目标物附近均无干扰，因此选择200 μL去离子水对PCAX型纳米纤维固相萃取柱进行淋洗。
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川芎嗪易溶于有机溶剂，且流动相使用的有机相为甲醇，故考虑以甲醇为洗脱液。由于样品在进行固相萃取前，需用氨水稀释，可能由于碱性环境能促进川芎嗪与纳米纤维的相互作用，相反酸性环境可能会破环川芎嗪与纳米纤维之间的作用。本实验考察50 μL 5%乙酸水溶液甲醇(5:95)、1%乙酸水溶液甲醇(5:95)、0.5%乙酸水溶液甲醇(5:95)、95%甲醇、甲醇等洗脱液的洗脱效果。结果表明不同浓度的乙酸甲醇溶液与甲醇的洗脱效果相当，因此本实验使用甲醇作为洗脱液。
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取适量人血浆置于离心管中，加入氨水，涡旋2 min后待处理。甲醇活化PCAX型纳米纤维固相萃取柱后，用200 μL甲醇冲洗，然后将处理后的血浆溶液上样，待所有血浆溶液通过后，用200 μL去离子水冲洗，再用50 μL洗脱液洗脱，收集洗脱液，进行高效液相色谱分析。
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准确量取0.5 mL空白血浆，加入川芎嗪标准溶液，使血浆中川芎嗪的浓度分别为0.01、0.05、0.10、1.00、2.00 μg/mL，按1.2.5方法进行处理。以标准血浆中川芎嗪浓度为横坐标(X)，以川芎嗪的峰面积为纵坐标(Y)，得血浆中川芎嗪标准曲线。
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精确量取0.5 mL空白血浆，分别加入含0.1、0.4、1.0 μg川芎嗪的标准溶液50 μL，按1.2.5方法进行处理，每个样品平行5次，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。
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在1.2.2色谱条件下进行分析，川芎嗪的保留时间为12.55 min，未见明显干扰物质(见图 2)。该条件下人血浆中川芎嗪的标准曲线方程为：Y=36 576*X+2 335，r=0.998，在0.01~2.00 μg/mL范围内有良好线性关系。该方法的检出限(S/N>3)为0.003 μg/mL，回收率为94.88%~103.11%，RSD为2.6%~4.3%(见表 1)。
图 2 人血浆中川芎嗉的高效液相色谱图
加标量/μg 回收率/% RSD/% 0.1 103.11±3.29 3.2 0.4 94.88±2.51 2.6 1.0 98.19±4.22 4.3 表 1 人血浆中川芎嗪的加标回收率与精密度(n=5)
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在药物的药理学和药代学研究中，常常需要检测血浆中药物的浓度，而动物实验中，可获取的生物样品的量比较少，尤其是血浆样品。本文使用纳米纤维作为固相萃取法的吸附材料，凭借纳米纤维的高效吸附和脱附性能，血浆样品仅需0.5 mL，经过碱化稀释后，即可进行固相萃取处理，免去蛋白沉淀以及有机溶剂萃取，大大提高样品处理的效率，减少因蛋白沉淀和有机溶剂萃取时所造成的误差。由于纳米纤维具有较高的吸附性能，因此填装量只有10 mg左右，有效减少柱床体积，洗脱液用量只需50 μL即可满足洗脱需求，洗脱液不需要进一步氮吹浓缩，即可达到浓缩效果。纳米纤维直径只有300 nm左右，使得纳米纤维固相萃取柱中的纤维间隙较小，虽然这使得样品的过柱阻力较大，但能有效阻挡溶液中的颗粒物，洗脱液不需要进行过滤便可直接进色谱检测。
本研究建立的方法，使用1%氨水稀释血浆样品，经PCAX型复合阴离子交换纳米纤维固相萃取柱萃取血浆中的川芎嗪，然后用200 μL去离子水冲洗，再用50 μL洗脱液洗脱，最后进行高效液相色谱分析，大大减少了样品前处理的步骤，提高样品前处理的效率，同时降低血浆样品的需要量，减少有机溶剂的使用，有效提高检测灵敏度，可满足药理学和药代学等研究中川芎嗪血药浓度测定的要求。
纳米纤维固相萃取高效液相色谱法测定人血浆中川芎嗪含量
Determination of ligustrazine in human plasma using nanofiber-packed solid-phase extraction-high performance liquid chromatography
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摘要:
目的建立纳米纤维固相萃取高效液相色谱法检测人血浆中川芎嗪含量。 方法样品经1%氨水稀释3倍，用活化后的PCAX型复合阴离子交换纳米纤维固相萃取柱净化富集，用去离子水淋洗，以50 μL甲醇洗脱，取20 μL进样检测。以甲醇1%冰醋酸水溶液（45：55，V/V）为流动相在岛津ODS-2色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）上进行分离，流速1.0 mL/min，检测波长295 nm。 结果该方法的线性范围为0.01~2.00 μg/mL，检出限为0.003 μg/mL，回收率为94.88%~103.11%，相对标准偏差为2.6%~4.3%。 结论该方法操作简单，具有样品需要量少、灵敏度高等优点，可用于人血浆中川芎嗪的含量测定。 Abstract:ObjectiveTo establish a nanofiber-packed solid-phase extraction-high performance liquid chromatography to determine the serum level of ligustrazine. MethodsThe sample was diluted by 1% ammonia solution for 3 times, purified and enriched with activated PCAX composite anion exchange nanofiber solid-phase extraction column, eluted with deionized water, eluted with 50 μL methanol, and 20 μL sample was detected.The methanol-1% acetic acid solution(45:55, V/V) was used as mobile phase for separation on Shimazu ODS-2 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm) with flow rate for 1.0 mL/min and detection wavelength for 295 nm. ResultsThe linear range of this method was from 0.01 to 2.00 μg/mL, the detection limit was 0.003 μg/mL, the recovery rate was from 94.88% to 103.11%, and the relative standard deviations was from 2.6% to 4.3%. ConclusionsThe method has the advantages of simple operation, low sample requirement and high sensitivity, and can be used to determine the content of ligustrazine in human plasma. -
Key words:
- ligustrazine /
- high performance liquid chromatography /
- nanofiber /
- solid-phase extraction /
- plasma
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表 1 人血浆中川芎嗪的加标回收率与精密度(n=5)
加标量/μg 回收率/% RSD/% 0.1 103.11±3.29 3.2 0.4 94.88±2.51 2.6 1.0 98.19±4.22 4.3 
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