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在临床解剖学实验中，通常需要把标本放入保存液中浸泡，以达到保存较长时间、固定蛋白质和脂肪等目的。传统保存液甲醛能使组织硬化且使组织固定均匀，对组织的穿透性强[1], 但易挥发，对实验人员的皮肤黏膜刺激极大，长期少量吸入可导致慢性中毒，出现呼吸道黏膜充血、皮肤刺激征、过敏性皮炎等[2]。选取一种具有防腐抗菌特点，对人体皮肤黏膜刺激性小，而且能够使标本长时间保持与标本死亡前相近的色泽、质地的改良保存液，对临床解剖学研究具有重要意义。本文就改良金银花配方标本保存液对兔标本保存效果作一探讨。
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蒸馏水，甲醛，95%乙醇，金银花200 g(购于蚌埠市丰原大药房中草药专柜)，新西兰兔20只(由蚌埠医学院实验动物中心提供，雌雄不限，体质量2.0~2.5 kg)，3%戊巴比妥钠，烧杯, 培养皿，凉肉汤，手术器械1套，天平，电磁炉，恒温水浴锅。
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将金银花洗净后干燥，取100g。用自来水1: 10浸没2 h，武火煮沸后，文火保持微沸30 min，取药汁，趁热抽滤; 药渣中加入6倍自来水，武火煮沸后，文火保持微沸20 min，取药汁，趁热抽滤; 合并2次滤液，80 ℃恒温水浴锅浓缩至1 g生药/毫升。冷却后倒入无水乙醇作提取剂，与药汁比例为2: 1，密闭4 ℃冷藏，48 h后经回流提取、过滤除渣后旋蒸，得到1 g生药/毫升的药汁100 mL，4 ℃储存备用[3]。
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对照组：1组为传统保存液，甲醛溶液38%，水62%，50 mL；2组为水加乙醇，乙醇38%，水62%，50 mL；3组为纯水，50 mL。实验组：改良标本保存液成分配比见表 1。对照组与观察组各组液体均平均分成5份，同时使用。
分组 甲醛 乙醇 金银花提取液 水 总量/mL 改1 38 5 5 52 50 改2 38 10 10 42 50 改3 38 15 15 32 50 改4 38 20 20 22 50 改5 38 25 25 12 50 改6 38 30 30 2 50 表 1 改良标本保存液成分配比(%)
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新鲜标本预处理：随机选取8只兔用3%戊巴比妥钠20 mL快速静脉推注，待兔死亡后取仰卧位固定，四肢处切开皮肤，钝性分离至肌层。分别于四肢取下肌肉，切割至小块并利用天平称量，保证每块标本质量为(0.40±0.02)g。
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取实验组及对照组1、2、3保存液各10 mL，与1 mL凉肉汤混合，于培养皿中培养记录，一旦发现霉菌立即停止记录，观察其防腐情况。
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取健康兔12只，体质量2.0~3.0 kg，随机分为4组，每组3只，实验组及对照1、2、3组均取0.1 mL，4组均滴入兔左右眼结膜囊内，并使眼睑被动闭合5 s，记录6、24、48、72 h至7 d家兔眼的局部反应情况。兔眼刺激实验评分标准见表 2，无刺激0~3分，轻度刺激4~8分，中度刺激9~12分，重度刺激13~16分[4-6]。
反应情况 评分 角膜混浊(以最致密部为准) 无混浊 0 散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见 1 半透明区易分辨，虹膜模糊不清 2 出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强看清 3 角膜不透明，由于混浊，虹膜无法辨认 4 虹膜 正常 0 皱褶明显加深，充血，肿胀，角膜周围有轻度充血，
瞳孔对光有轻微反应1 出血、血肉可见坏死，对光无反应(或出现其中一种) 2 结膜 充血：指眼睑结膜，球结膜部位 血管正常 0 血管充血呈鲜红色 1 血管充血呈深红色，血管不易分辨 2 弥漫性充血呈紫红色 3 水肿 无水肿 0 轻微水肿 1 明显水肿 2 水肿至眼睑半闭合 3 水肿至眼睑大于半闭合 4 分泌物 无分泌物 0 少量分泌物 1 分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着 2 分泌物使整个眼区潮湿或粘着 3 表 2 兔眼刺激实验的评分标准(分)
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对实验组和对照1组中的上下肢肌肉进行HE染色，镜下观察肌肉固定效果。
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采用q检验。
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实验组与对照1组可维持较长时间不产生霉菌，对照2组可维持较短时间不产生霉菌，对照3组迅速产生霉菌(见表 3)。对照3组在1周后即腐败变质，对照2组在6个月时产生霉菌变质，而实验组与对照1组保存效果一致，溶液颜色透明，肌肉色泽红润，无腐败变质发霉的现象(见图 1)。
分组 7 d 30 d 3个月 6个月 9个月 实验组 - - - - - 对照1组 - - - - - 对照2组 - + 对照3组 + 注：-为未发现可见霉菌，+为有可见霉菌生成 表 3 保存液细菌培养结果
图 1 实验组和对照1~3组细菌培养情况
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对照1组重度刺激、对照2组中度刺激，而实验组只有轻度刺激，4组间差异有统计学意义(P < 0.01)(见表 4)。
分组 n 评分 F P MS组内 实验组 6 7.00±0.82 对照1组
对照2组6
613.30±0.94
9.67±0.94180.21 < 0.01 0.665 对照3组 6 1.67±0.47 表 4 兔眼刺激实验的评分(x±s；分)
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实验组肌肉组织色泽红润，质地柔软，弹性佳，肌纤维保存完好，无臭味，未见污染灶，组织无溶解。镜下肌纤维条索完整，细胞结构清晰，高倍镜下可见横纹，与对照1组肌肉固定效果相似(见图 2)。
图 2 组织固定效果
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中药在我国有着悠久历史，中草药的种类超过5 000种，常用的有700~800种，有抗菌作用的超过300种，其中常见的有金银花、黄芩、黄连、野菊花、大青叶、连翘等。金银花具有较强的抗炎、抗菌、抗氧化等活性[7]，富含有机酸、挥发油、黄酮类等成分，有机酸类被认为是抗菌防腐的主要活性物质，包括绿原酸、异绿原酸、咖啡酸以及木樨草素苷等，对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、肺炎双球菌等致病菌有较强的抑制作用[8]。在解剖学中，乙醇能加快固定，添加一定量的乙醇避免了短时间内保存不佳而导致腐烂的后果，但在使用中要将标本完全浸没。本实验将金银花提取液和乙醇混合，按照不同浓度设组，在传统保存液优化方面取得显著的效果。实验过程中，采用3组对照实验，且每组设置5个相同样本，尽量避免实验误差。
结果发现，实验组对标本的抑菌效果与对照1组相同，较对照2组更为优越，提示实验组具有良好的抗菌效果；在刺激性方面，实验组较对照1组、对照2组刺激性小，提示实验组有效降低了保存液的刺激程度；而单纯用乙醇溶液，虽然也具有一定的保存效果，但与实验组，相差甚远。
综上，采用金银花改良保存液，可以减轻传统保存液的刺鼻气味，提升其抗菌能力，改善对标本的物理损伤。此次实验中，因时间及条件所限，研究的溶液量及标本量均较少，是否能广泛推广及应用后效果如何尚需继续研究。另外，改良组所设的5种浓度类型，在本次试验中并未发现明显差异，尚需对改良保存液的最佳配比进一步研究。
改良金银花配方标本保存液对兔标本的固定效果
Fixation effect of modified Chinese medicine specimen preservation solution in rabbit specimens
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摘要:
目的观察改良金银花配方标本保存液对兔标本组织清晰度、色泽、抗菌等方面保存的效果。 方法用金银花提取液与甲醛、乙醇、水按比例配置的改良液与传统保存液甲醛以及乙醇做对比实验，从其组织结构清晰程度、组织肌肉色泽、防腐抗菌效果以及刺激性等方面，对比观察其固定效果。 结果改良标本保存液与传统甲醛防腐抗菌效果相当，但改良液具有使标本保持色泽不变、组织结构层次分明且刺激性小等优点。 结论改良标本保存液具有良好的标本固定效果，适用于展示标本。 Abstract:ObjectiveTo observe the effects of modified Chinese medicine specimen preservation solution on tissue clarity, color and antibacterial activity of rabbit specimens. MethodsThe fixed effects of the modified solution mixed with honeysuckle extract, formaldehyde, ethanol and water, and traditional formaldehyde and ethanol were tested.The tissue structure clarity, tissue muscle color, anticorrosion and antibacterial effect and irritation of specimens after fixation with two methods were observed and compared. ResultsThe effects of two specimen preservation solutions were similar, and the advantages of the modified solution in keeping the color of the specimen, maintaining the tissue structure and having little irritation were distinct. ConclusionsThe modified specimen preservation solution has a good fixation effect, and can be used to display specimens. -
Key words:
- formaldehyde /
- ethanol /
- honeysuckle /
- specimen /
- rabbit
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表 1 改良标本保存液成分配比(%)
分组 甲醛 乙醇 金银花提取液 水 总量/mL 改1 38 5 5 52 50 改2 38 10 10 42 50 改3 38 15 15 32 50 改4 38 20 20 22 50 改5 38 25 25 12 50 改6 38 30 30 2 50 
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表 2 兔眼刺激实验的评分标准(分)
反应情况 评分 角膜混浊(以最致密部为准) 无混浊 0 散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见 1 半透明区易分辨，虹膜模糊不清 2 出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强看清 3 角膜不透明，由于混浊，虹膜无法辨认 4 虹膜 正常 0 皱褶明显加深，充血，肿胀，角膜周围有轻度充血，
瞳孔对光有轻微反应1 出血、血肉可见坏死，对光无反应(或出现其中一种) 2 结膜 充血：指眼睑结膜，球结膜部位 血管正常 0 血管充血呈鲜红色 1 血管充血呈深红色，血管不易分辨 2 弥漫性充血呈紫红色 3 水肿 无水肿 0 轻微水肿 1 明显水肿 2 水肿至眼睑半闭合 3 水肿至眼睑大于半闭合 4 分泌物 无分泌物 0 少量分泌物 1 分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着 2 分泌物使整个眼区潮湿或粘着 3
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表 3 保存液细菌培养结果
分组 7 d 30 d 3个月 6个月 9个月 实验组 - - - - - 对照1组 - - - - - 对照2组 - + 对照3组 + 注：-为未发现可见霉菌，+为有可见霉菌生成
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表 4 兔眼刺激实验的评分(x±s；分)
分组 n 评分 F P MS组内 实验组 6 7.00±0.82 对照1组
对照2组6
613.30±0.94
9.67±0.94180.21 < 0.01 0.665 对照3组 6 1.67±0.47
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[1] 王子健, 杨静波, 李光谱, 等.低浓度甲醛对多肽和蛋白化学修饰的质谱研究[J].分析化学, 2016, 8(44):1193. [2] 沙宗阁, 徐照, 邹杰, 等.新型环保标本保存液的试制与应用研究[J].四川解剖学杂志, 2018, 26(2):135. doi: 10.3969/j.issn.1005-1457.2018.02.051 [3] 苟微, 管冬元, 方肇勤, 等.小檗碱等7味中药有效成分药性的检测[J].时珍国医国药, 2011, 22(11):2717. doi: 10.3969/j.issn.1008-0805.2011.11.065 [4] 詹亚护, 罗媚, 龙大宏.改良标本保存液在尸体标本中的应用[J].解剖学研究, 2008, 30(5):398. [5] 刘仰斌, 盛瑶环, 李启华, 等.改良人体标本保存液配方的效果[J].中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11(23):4625. doi: 10.3321/j.issn:1673-8225.2007.23.052 [6] 刘彦群, 刘凯, 何静.壳聚糖家兔眼刺激试验[J].徐州医学院学报, 2002, 22(3):201. doi: 10.3969/j.issn.1000-2065.2002.03.006 [7] 袁媛, 吴芹, 石京山, 等.丹参及其主要成分保肝作用的研究进展[J].中国中药杂志, 2015, 40(4):588. [8] 王晔, 张辉华, 胡民强.中草药及其提取物在食品防腐中的应用研究进展[J].佛山科学技术学院学报(自然科学版), 2015, 33(1):5. doi: 10.3969/j.issn.1008-0171.2015.01.002 -
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