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淫羊藿对兔腰椎间盘退变模型软骨组织中BMP-2、BMP-4表达水平的影响

韩仲兵 张长春 叶雨辰 朱坤 许刚

引用本文:
Citation:

淫羊藿对兔腰椎间盘退变模型软骨组织中BMP-2、BMP-4表达水平的影响

    作者简介: 韩仲兵(1986-), 男, 主治医师.
    通讯作者: 张长春, zccanhui@sina.com
  • 基金项目:

    安徽省高校自然科学研究重点项目 KJ2011A204

  • 中图分类号: R681.5

Effect of epimedium on the expression levels of BMP-2 and BMP-4 in cartilage tissue of rabbit model with lumbar intervertebral disc degeneration

    Corresponding author: Chang-chun ZHANG, zccanhui@sina.com ;
  • CLC number: R681.5

  • 摘要: 目的探讨淫羊藿对兔腰椎间盘退变模型软骨组织骨形态发生蛋白(BMP)-2、BMP-4表达的影响。方法取30只新西兰大白兔,分为假手术组、模型组、淫羊藿组各10只,除假手术组外均建立腰椎间盘退变模型,淫羊藿组给予10 mg·kg-1·d-1淫羊藿药液灌胃,模型组给予同等剂量0.9%氯化钠溶液灌胃,90 d收集各组腰椎软骨终板标本,观察组织形态改变情况,采用免疫组织化学法测定凋亡因子fas受体表达,采用Western blotting检测软骨终板组织中BMP-2、BMP-4蛋白表达情况。结果模型组、淫羊藿组fas受体阳性率均高于假手术组(P < 0.01),淫羊藿组fas受体阳性率低于模型组(P < 0.01);模型组、淫羊藿组BMP-2蛋白表达水平低于假手术组(P < 0.01),淫羊藿组BMP-2蛋白表达水平高于模型组(P < 0.01),各组BMP-4蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论淫羊藿可上调兔腰椎间盘退变模型软骨组织BMP-2表达,促进成骨细胞增殖、分化,但对BMP-4的调控仍无实验依据。
  • 图 1  软骨终板组织鉴定

    图 2  软骨终板组织HE染色(A:假手术组; B:模型组; C:淫羊藿组)

    图 3  软骨终板组织免疫组织化学染色(A:假手术组; B:模型组; C:淫羊藿组)

    图 4  软骨终板组织BMP-2、BMP-4蛋白表达情况

    表 1  各组软骨终板组织Fas受体阳性率比较(x±s)

    分组 n fas受体阳性率/% F P MS组内
    假手术组 10 7.93±1.42
    模型组 10 45.50±5.04** 247.33 0.01 14.545
    淫羊藿组 10 31.21±4.03**##
    q检验:与假手术组比较**P < 0.01;与模型组比较##P < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 2  各组软骨终板组织BMP-2、BMP-4蛋白相对表达量(x±s)

    分组 n BMP-2 BMP-4
    假手术组 10 0.53±0.18 0.33±0.17
    模型组 10 0.14±0.14** 0.13±1.46
    淫羊藿组 10 0.44±0.13## 0.29±0.13
    F 18.20 0.16
    P < 0.01 >0.05
    MS组内 0.022 0.723
    q检验:与假手术组比较**P < 0.01;与模型组比较##P < 0.01
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-05-31
  • 录用日期:  2019-03-30
  • 刊出日期:  2019-07-15

淫羊藿对兔腰椎间盘退变模型软骨组织中BMP-2、BMP-4表达水平的影响

    通讯作者: 张长春, zccanhui@sina.com
    作者简介: 韩仲兵(1986-), 男, 主治医师
  • 蚌埠医学院第一附属医院 骨科, 安徽 蚌埠 233004
基金项目:  安徽省高校自然科学研究重点项目 KJ2011A204

摘要: 目的探讨淫羊藿对兔腰椎间盘退变模型软骨组织骨形态发生蛋白(BMP)-2、BMP-4表达的影响。方法取30只新西兰大白兔,分为假手术组、模型组、淫羊藿组各10只,除假手术组外均建立腰椎间盘退变模型,淫羊藿组给予10 mg·kg-1·d-1淫羊藿药液灌胃,模型组给予同等剂量0.9%氯化钠溶液灌胃,90 d收集各组腰椎软骨终板标本,观察组织形态改变情况,采用免疫组织化学法测定凋亡因子fas受体表达,采用Western blotting检测软骨终板组织中BMP-2、BMP-4蛋白表达情况。结果模型组、淫羊藿组fas受体阳性率均高于假手术组(P < 0.01),淫羊藿组fas受体阳性率低于模型组(P < 0.01);模型组、淫羊藿组BMP-2蛋白表达水平低于假手术组(P < 0.01),淫羊藿组BMP-2蛋白表达水平高于模型组(P < 0.01),各组BMP-4蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论淫羊藿可上调兔腰椎间盘退变模型软骨组织BMP-2表达,促进成骨细胞增殖、分化,但对BMP-4的调控仍无实验依据。

English Abstract

  • 腰椎间盘退变是骨科常见病,是指腰椎自然老化、退化的病理、生理过程,常表现为下腰痛、急性下肢神经根性疼痛[1],目前尚未完全明确腰椎间盘退变发生的机制,早期认为腰椎间盘突出硬膜腔直接压迫及刺激神经根是引起腰椎间盘退变的主要原因[2]。近年来发现,炎症因素、生长因子异常表达等均与椎间盘退变发生有关[3]。骨形态发生蛋白(BMPs)则为具刺激细胞生长作用的细胞因子,系一类诱导成骨形成的酸性多肽,属转化生长因子β(TGF-β)超家族成员,在骨组织形成过程中有关键调节作用,对椎间盘合成及代谢均有积极的调节作用。目前已发现超过40种BMPs亚成员均与骨质疏松性疾病发生有关,其中BMP-2、BMP-4均为临床研究热点[4-5]。淫羊藿则为小檗科植物大花淫羊藿、箭叶淫羊藿、心叶淫羊藿全草,主要化学成分为黄酮、淫羊藿苷、多糖等,属传统补肾壮阳、强筋健骨药物,可拮抗骨质疏松。有动物试验[6]证实,淫羊藿总黄酮可促进体外培养大鼠成骨细胞增殖及分化[6]。但对淫羊藿对腰椎间盘退变病人软骨组织BMPs的影响尚少见报道。本研究建立兔腰椎间盘退变模型,并分别予糖皮质激素、淫羊藿干预,并检测软骨组织BMP-2、BMP-4表达,探讨淫羊藿对腰椎间盘退变软骨组织骨形态发生蛋白的影响。

    • 新西兰大白兔30只,6月龄,雌雄不限,体质量2.0~2.5 kg,普通级,分笼饲养,标准喂养3周。

    • 淫羊藿标准品(中国药品生物制品检定所,纯度≥99%),3%戊巴比妥(上海试剂厂),BCA试剂盒(美国Applied Bio公司),HE染色试剂盒,Western blotting检测试剂盒(上海斯丹赛生物试剂公司),兔抗人fas多克隆抗体(美国Assay Designs公司);光学显微镜、倒置荧光显微镜(日本Olympus公司),凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司),EPPENDORF Centrifuge5804R高速冷冻离心机(德国EPPENDORF公司)。

    • 30只新西兰大白兔随机分为假手术组、模型组、淫羊藿组各10只。除假手术组外均建立腰椎间盘退变模型,参照文献[7],兔脊椎右侧剃毛,备皮20 cm×15 cm,清洁,耳缘静脉注射3%戊巴比妥1 mL/kg全身麻醉,左侧卧位,右侧腹膜入路,右腹直肌外侧缘作15 cm切口,剥离腹膜至腰椎横突前外侧,暴露L5~6横突,根部去除L5~6横突,显露L4~5、L5~6椎间盘,作深斜切口,皮下针刺入椎间盘与上下终板呈60°角,深度1.5 mm,术前、术后肌内注射庆大霉素80 000 U,笼中自由喂养,背部压1/10体质量重物,2 h/d,使之站立、饮食及跑动,术后4周复查腰椎X线片与MRI示手术处理节段椎间隙变窄,椎间盘区T2低信号,提示造模成功[8]。假手术组全麻后作皮肤切口后缝合。

    • 淫羊藿组造模后4周在麻醉下予淫羊藿10 mg·kg-1·d-1(动物-人等效剂量换算)灌胃,取100 mg淫羊藿粉末,加入100 mL 0.9%氯化钠溶液内,混合均匀,制备成1 mg/mL溶液;模型组以及假手术组给予同等剂量0.9%氯化钠溶液灌胃,连续90 d。

    • 90 d后采用空气栓塞法处死大白兔,切除椎板,摘除髓核,刮除上下软骨终板,0.9%氯化钠溶液冲洗表面血迹,快速置于液氮内降温冷冻,-80 ℃低温冰箱保存待测。将获取软骨终板组织解冻,甲醛溶液固定,脱钙4周,脱水、透明或石蜡包埋,4 μm厚度连续切片。

    • (1) 软骨终板组织鉴定:软骨终板组织细胞0.25%胰蛋白酶消化,以1×105个/毫升密度接种于多聚赖氨酸玻片,行细胞爬片处理,切片4%多聚甲醛固定,甲苯胺蓝染色,中性树胶封片,镜下观察染色情况;取细胞爬片,0.25% TritonX-100穿透细胞膜,1%胎牛血清封闭,抗荧光衰灭片剂封片,倒置显微镜下观察细胞荧光表达情况。(2)组织形态观察:切片行HE染色,二甲苯脱蜡2次×10 min,无水乙醇冲洗2 min,梯度乙醇脱水,自来水冲洗2 min,HE染色15 min,自来水冲洗1 min,乙醇分化20 s,自来水冲洗5 min,伊红染色20 s,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,干燥,中性树胶封片,显微镜下(×200)观察新骨形成、胶原纤维生成及骨塑状况。

    • 采用SABC免疫组织化学法,切片脱蜡,水化,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗5 min,阻断内源性过氧化物,PBS冲洗3次,抗原修复,室温冷却,加入正常山羊血清封闭0.5 h,加兔抗人fas多克隆抗体,4 ℃过夜,PBS冲洗2次×3 min,滴生物素标记羊抗兔IgG抗体,室温孵育0.5 h,PBS冲洗3次×3 min,滴加ABC复合剂,37 ℃孵育0.5 h,PBS冲洗3次×3 min,DAB染色,自来水冲洗5 min,梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察fas受体表达情况,随机取10个高倍视野,观察阳性细胞数,计算阳性细胞率。

    • 取各实验组大白兔,获取软骨终板组织并修剪至所需大小,置于2 mL匀浆器中并将组织块剪碎。加入200 μL RIPA裂解液于匀浆器中进行匀浆,置入冰盒中孵育30 min后,4 ℃高速离心(12 000 r/min, 10 min);取匀浆上清液,移至新的EP管中。根据BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度。

    • 取制胶装置并组装,注意防止漏液。提前准备分离胶,待分离胶灌注凝固后,再配浓缩胶并灌注。插入梳子,灌压浓缩胶,避免产生气泡。解冻蛋白样品,上样,静置10 min后将电泳槽盖子盖好并接通电源,设定电压80 V,30 min。制备电泳液及转膜液。电泳结束,卸下玻璃板。将凝胶切成适当大小,放入装有转印缓冲液的平皿中。剪好的膜放入甲醇中浸泡15 min,用去离子水处理后备用。制备转膜“三明治”,依照3层滤纸—PVDF膜—胶—3层滤纸的顺序放置。连接转模转置,设置电流260 mA,转膜150 min。转模结束后取膜,置于装有封闭液的培养皿中,置于摇床上低速摇晃1 h。封闭完成后,室温下浸入1×TBST中漂洗3次,每次10 min;加一抗稀释液与摇床上缓慢摇晃孵育1 h后置于4 ℃冰箱过夜。倒弃一抗工作液,TBST漂洗后将PVDF膜正面朝上置于装有二抗稀释液培养皿中,室温下于摇床上孵育80 min。孵育结束,将PVDF膜取出,置于1×TBST中漂洗3次,加入显影剂,显影、曝光,拍照。

    • 采用方差分析和q检验。

    • 甲苯胺蓝染色,倒置显微镜下见染色后细胞核及细胞骨架颜色较深,细胞核周围分布深紫色异染颗粒,细胞骨架部分呈均匀蓝色,可鉴定此细胞为软骨终板细胞(见图 1A);免疫荧光染色,倒置显微镜下见不同波段光的激发下,细胞骨架部分呈绿色荧光,细胞核部分未见绿色荧光标记(见图 1B),可鉴定此细胞为软骨终板细胞。

      图  1  软骨终板组织鉴定

    • 假手术组软骨终板组织结构完整,表面光滑,排列规律,软骨细胞饱满,呈圆形或椭圆形,柱状排列,软骨基质着色均匀;模型组软骨表面粗糙,局部缺损,组织结构不完整,软骨细胞分布不均,排列紊乱,部分区见软骨细胞克隆增生,呈簇状分布,软骨基质着色浅,不规律,潮线扭曲,不完整;淫羊藿组软骨细胞尚完整,细胞排列尚规律,细胞凋亡少,软骨基质染色较均匀,潮线尚且完整(见图 2)。

      图  2  软骨终板组织HE染色(A:假手术组; B:模型组; C:淫羊藿组)

    • 模型组、淫羊藿组fas受体阳性率显著高于假手术组(P < 0.01),淫羊藿组fas受体阳性率显著低于模型组(P < 0.01)(见表 1图 3)。

      分组 n fas受体阳性率/% F P MS组内
      假手术组 10 7.93±1.42
      模型组 10 45.50±5.04** 247.33 0.01 14.545
      淫羊藿组 10 31.21±4.03**##
      q检验:与假手术组比较**P < 0.01;与模型组比较##P < 0.01

      表 1  各组软骨终板组织Fas受体阳性率比较(x±s)

      图  3  软骨终板组织免疫组织化学染色(A:假手术组; B:模型组; C:淫羊藿组)

    • 模型组BMP-2水平显著低于假手术组(P < 0.01),淫羊藿组BMP-2显著高于模型组(P < 0.01)(见表 2图 4)。

      分组 n BMP-2 BMP-4
      假手术组 10 0.53±0.18 0.33±0.17
      模型组 10 0.14±0.14** 0.13±1.46
      淫羊藿组 10 0.44±0.13## 0.29±0.13
      F 18.20 0.16
      P < 0.01 >0.05
      MS组内 0.022 0.723
      q检验:与假手术组比较**P < 0.01;与模型组比较##P < 0.01

      表 2  各组软骨终板组织BMP-2、BMP-4蛋白相对表达量(x±s)

      图  4  软骨终板组织BMP-2、BMP-4蛋白表达情况

    • 椎间盘退变为慢性、复杂性生理过程,目前尚未明确其退变的分子生物学机制,早期认为椎间盘退变是机械损伤、年龄、炎症介质、营养障碍、基因等多因素共同作用的结果[9-10]。纤维环损伤激发局部炎症反应,促进大量生长因子释放,作用于椎间盘细胞,导致信号转导,促进椎间盘细胞分化、增殖及细胞外基质合成。CHURCH等[11]发现,TGF-β、BMPs等促软骨形成因素在椎间盘退变中有重要作用。成骨细胞分化是骨发生及骨形成的前提条件,其在分化过程中受BMPs、结缔组织生长因子等影响。BMP-2为TGF-β家族成员之一,正常生理条件下,骨组织BMP-2含量丰富,在骨形成时可诱导非分化间叶细胞有丝分裂,增成骨细胞活性,促进胶原蛋白合成,诱导成骨细胞显型表达。周慧芳等[12]通过体外试验证实,BMP-2有较强促成骨细胞分化作用,可诱导体外成骨形成,促进成骨细胞增殖分化。BMP-4属BMPs,其成熟肽由100余个氨基酸序列组成,氨基酸序列与BMP-2同源性超过90%[13]。XU等[14]发现,BMP-4可促进髓核细胞蛋白多糖分泌,修复腰椎间盘退变,但本次实验表明,BMP-4对于腰椎间盘修复方面的作用还有待进一步实验。

      本研究发现,兔腰椎间盘退变模型组BMP-2表达均低于假手术组,表明其在腰椎间盘退变中均有一定的作用,但BMP-4在腰椎间盘退变中是否有作用,本次实验未能提供有意义的统计学数据。fas受体则属肿瘤坏死因子超家族成员,为跨膜蛋白,含80个氨基酸死亡结构域,可与抗fas抗体或fas配体结合,诱导细胞凋亡[15]。张雁儒等[16]发现骨质疏松大鼠模型fas受体阳性率较高,该观点认为fas高表达与骨细胞凋亡存在密切联系。但对腰椎间盘退变终板组织细胞fas表达及细胞凋亡与终板组织改变的关系尚未见报道。本研究建立兔腰椎间盘退变模型,发现模型组fas受体阳性率明显高于假手术组,表明fas可能介导腰椎间盘退变过程,与成骨细胞凋亡存在一定的联系。

      淫羊藿主要成分为黄酮类化合物,包含淫羊藿苷、朝藿苷、宝藿苷等,性温,味辛,有其补肾壮阳,健骨益精之效。现代药理学研究发现,淫羊藿具备类性激素样作用,可促进骨髓细胞DNA合成,诱导破骨细胞凋亡,促进成骨细胞增殖。此外,淫羊藿可调节体内环境微量元素平衡,促进骨生成,同时强化肠黏膜对钙离子的吸收作用,强化骨力学特性,改善骨基质分子结构。CAI等[17]在体外培养SD大鼠细胞培养液内添加淫羊藿,结果发现20~60 mg·kg-1·d-1淫羊藿均可提高成骨细胞活性促进成骨细胞Ⅰ型胶原表达。也有学者[18]发现,淫羊藿可抑制破骨细胞分化,减少骨炎性因子分泌,预防骨组织形态结构改变。本研究中,淫羊藿组腰椎间盘退变模型给予10 mg·kg-1·d-1淫羊藿药液灌胃90 d后发现,软骨终板组织BMP-2表达明显增加,而fas受体阳性率降低,且终板软骨组织形态学明显改善,细胞凋亡减少,成骨细胞增加,表明淫羊藿可通过上调BMP-2蛋白表达,启动成骨相关基因表达,加快骨组织蛋白质合成,促进骨生成。

      综上所述,淫羊藿可上调兔腰椎间盘退变模型软骨组织BMP-2蛋白表达,降低软骨组织fas受体阳性率,推测其可能通过调节转化生长因子β表达,影响成骨细胞分化及增殖过程,促进腰椎间盘退变修复,但BMP-4是否有上述作用,还需进一步的实验探索。

参考文献 (18)

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