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腰椎间盘退变是骨科常见病,是指腰椎自然老化、退化的病理、生理过程,常表现为下腰痛、急性下肢神经根性疼痛[1],目前尚未完全明确腰椎间盘退变发生的机制,早期认为腰椎间盘突出硬膜腔直接压迫及刺激神经根是引起腰椎间盘退变的主要原因[2]。近年来发现,炎症因素、生长因子异常表达等均与椎间盘退变发生有关[3]。骨形态发生蛋白(BMPs)则为具刺激细胞生长作用的细胞因子,系一类诱导成骨形成的酸性多肽,属转化生长因子β(TGF-β)超家族成员,在骨组织形成过程中有关键调节作用,对椎间盘合成及代谢均有积极的调节作用。目前已发现超过40种BMPs亚成员均与骨质疏松性疾病发生有关,其中BMP-2、BMP-4均为临床研究热点[4-5]。淫羊藿则为小檗科植物大花淫羊藿、箭叶淫羊藿、心叶淫羊藿全草,主要化学成分为黄酮、淫羊藿苷、多糖等,属传统补肾壮阳、强筋健骨药物,可拮抗骨质疏松。有动物试验[6]证实,淫羊藿总黄酮可促进体外培养大鼠成骨细胞增殖及分化[6]。但对淫羊藿对腰椎间盘退变病人软骨组织BMPs的影响尚少见报道。本研究建立兔腰椎间盘退变模型,并分别予糖皮质激素、淫羊藿干预,并检测软骨组织BMP-2、BMP-4表达,探讨淫羊藿对腰椎间盘退变软骨组织骨形态发生蛋白的影响。
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甲苯胺蓝染色,倒置显微镜下见染色后细胞核及细胞骨架颜色较深,细胞核周围分布深紫色异染颗粒,细胞骨架部分呈均匀蓝色,可鉴定此细胞为软骨终板细胞(见图 1A);免疫荧光染色,倒置显微镜下见不同波段光的激发下,细胞骨架部分呈绿色荧光,细胞核部分未见绿色荧光标记(见图 1B),可鉴定此细胞为软骨终板细胞。
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假手术组软骨终板组织结构完整,表面光滑,排列规律,软骨细胞饱满,呈圆形或椭圆形,柱状排列,软骨基质着色均匀;模型组软骨表面粗糙,局部缺损,组织结构不完整,软骨细胞分布不均,排列紊乱,部分区见软骨细胞克隆增生,呈簇状分布,软骨基质着色浅,不规律,潮线扭曲,不完整;淫羊藿组软骨细胞尚完整,细胞排列尚规律,细胞凋亡少,软骨基质染色较均匀,潮线尚且完整(见图 2)。
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模型组、淫羊藿组fas受体阳性率显著高于假手术组(P < 0.01),淫羊藿组fas受体阳性率显著低于模型组(P < 0.01)(见表 1、图 3)。
分组 n fas受体阳性率/% F P MS组内 假手术组 10 7.93±1.42 模型组 10 45.50±5.04** 247.33 0.01 14.545 淫羊藿组 10 31.21±4.03**## q检验:与假手术组比较**P < 0.01;与模型组比较##P < 0.01 表 1 各组软骨终板组织Fas受体阳性率比较(x±s)
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模型组BMP-2水平显著低于假手术组(P < 0.01),淫羊藿组BMP-2显著高于模型组(P < 0.01)(见表 2、图 4)。
分组 n BMP-2 BMP-4 假手术组 10 0.53±0.18 0.33±0.17 模型组 10 0.14±0.14** 0.13±1.46 淫羊藿组 10 0.44±0.13## 0.29±0.13 F — 18.20 0.16 P — < 0.01 >0.05 MS组内 — 0.022 0.723 q检验:与假手术组比较**P < 0.01;与模型组比较##P < 0.01 表 2 各组软骨终板组织BMP-2、BMP-4蛋白相对表达量(x±s)
淫羊藿对兔腰椎间盘退变模型软骨组织中BMP-2、BMP-4表达水平的影响
Effect of epimedium on the expression levels of BMP-2 and BMP-4 in cartilage tissue of rabbit model with lumbar intervertebral disc degeneration
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摘要:
目的探讨淫羊藿对兔腰椎间盘退变模型软骨组织骨形态发生蛋白(BMP)-2、BMP-4表达的影响。 方法取30只新西兰大白兔,分为假手术组、模型组、淫羊藿组各10只,除假手术组外均建立腰椎间盘退变模型,淫羊藿组给予10 mg·kg-1·d-1淫羊藿药液灌胃,模型组给予同等剂量0.9%氯化钠溶液灌胃,90 d收集各组腰椎软骨终板标本,观察组织形态改变情况,采用免疫组织化学法测定凋亡因子fas受体表达,采用Western blotting检测软骨终板组织中BMP-2、BMP-4蛋白表达情况。 结果模型组、淫羊藿组fas受体阳性率均高于假手术组(P < 0.01),淫羊藿组fas受体阳性率低于模型组(P < 0.01);模型组、淫羊藿组BMP-2蛋白表达水平低于假手术组(P < 0.01),淫羊藿组BMP-2蛋白表达水平高于模型组(P < 0.01),各组BMP-4蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。 结论淫羊藿可上调兔腰椎间盘退变模型软骨组织BMP-2表达,促进成骨细胞增殖、分化,但对BMP-4的调控仍无实验依据。 Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of epimedium on the expression levels of bone morphogenetic protein -2(BMP-2) and -4(BMP-4) in cartilage tissue of rabbit model with lumbar intervertebral disc degeneration. MethodsThirty New Zealand white rabbits were divided into the sham operation group, model group and epimedium group (10 rabbits each group), and the lumbar intervertebral disc degeneration rabbit models in other two groups were established except for the sham operation group.The epimedium group and model group were treated with intragastric administration of 10 mg·kg-1·d-1 epimedium solution and same volume of 0.9% sodium chloride injection, respectively.The lumbar cartilage endplate specimens were harvested from each group after 90 d of treatment, and the morphological change of tissue was observed.The expression levels of apoptosis factor fas receptor, and BMP-2 and BMP-4 protein in cartilage endplate were determined using immunohistochemistry and Western blotting, respectively. ResultsThe positive rates of fas receptor in model group and epimedium group were higher than that in sham operation group (P < 0.01), and the positive rate of fas receptor in epimedium group was lower than that in model group (P < 0.01).The expression levels of BMP-2 and BMP-4 protein in model group and epimedium group were lower than those in sham operation group (P < 0.01), the expression level of BMP-2 protein in epimedium group was higher than that in model group (P < 0.01), and there was no statistical significance in the expression level of BMP-4 among three groups (P>0.05). ConclusionsEpimedium can up-regulate the expression level of BMP-2 in cartilage tissue of rabbit model with lumbar intervertebral disc degeneration, promote the proliferation and differentiation of osteoblast, but there is no experimental basis for regulating BMP-4. -
表 1 各组软骨终板组织Fas受体阳性率比较(x±s)
分组 n fas受体阳性率/% F P MS组内 假手术组 10 7.93±1.42 模型组 10 45.50±5.04** 247.33 0.01 14.545 淫羊藿组 10 31.21±4.03**## q检验:与假手术组比较**P < 0.01;与模型组比较##P < 0.01 表 2 各组软骨终板组织BMP-2、BMP-4蛋白相对表达量(x±s)
分组 n BMP-2 BMP-4 假手术组 10 0.53±0.18 0.33±0.17 模型组 10 0.14±0.14** 0.13±1.46 淫羊藿组 10 0.44±0.13## 0.29±0.13 F — 18.20 0.16 P — < 0.01 >0.05 MS组内 — 0.022 0.723 q检验:与假手术组比较**P < 0.01;与模型组比较##P < 0.01 -
[1] 林曦, 叶君健.骨形态发生蛋白2对退变椎间盘组织学和Ⅰ, Ⅱ型胶原的影响[J].中国组织工程研究, 2013, 17(43):7501. doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.43.001 [2] 雷涛, 权正学, 张圆, 等.联合应用BMP-2及细胞分化抑制因子1基因延缓兔腰椎间盘退变的动物实验研究[J].中国修复重建外科杂志, 2017, 31(1):73. [3] 张景, 张水花, 沈思, 等.T1ρ成像技术监测淫羊藿治疗早期兔膝软骨退变[J].实用放射学杂志, 2016, 32(10):1609. doi: 10.3969/j.issn.1002-1671.2016.10.033 [4] DÄ-AZ PU, HEIN GJ, BELOTTI EM, et al.BMP2, 4 and 6 and BMPR1B are altered from early stages of bovine cystic ovarian disease development[J].Reproduction, 2016, 152(4):333. doi: 10.1530/REP-15-0315 [5] 周栩, 权正学, 罗小辑, 等.Id1基因在BMP-2维持椎间盘细胞软骨特性中的作用[J].第三军医大学学报, 2015, 37(20):2011. [6] 孟祥玉, 巴穆登, 艾尔肯·阿木冬.两种方法建立兔腰椎间盘退变模型[J].中国组织工程研究, 2017, 21(4):564. [7] 魏文元, 武永利, 李春, 等.四逆汤饼灸对兔膝关节退变模型血清中IL-1、IL-6和TNF-α水平的影响[J].辽宁中医杂志, 2017, 44(3):615. [8] XUE L, JIANG Y, HAN T, et al.Comparative proteomic and metabolomic analysis reveal the antiosteoporotic molecular mechanism of icariin from Epimedium brevicornu maxim[J].J Ethnopharmacol, 2016, 4(192):370. [9] 尹宏, 钱卫庆.淫羊藿对骨质疏松型骨折局部骨形成蛋白mRNA表达的影响[J].中国骨质疏松杂志, 2012, 18(8):717. doi: 10.3969/j.issn.1006-7108.2012.08.009 [10] 杨丽, 朱晓峰, 王攀攀, 等.淫羊藿水提取物对大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化的影响及其机制[J].中草药, 2013, 44(22):3182. [11] CHURCH RH, KRISHNAKUMAR A, URBANEK A, et al.Gremlin1 preferentially binds to bone morphogenetic protein-2(BMP-2) and BMP-4 over BMP-7[J].Biochem J, 2015, 466(1):55. doi: 10.1042/BJ20140771 [12] 周慧芳, 史念珂, 雪原, 等.淫羊藿甙促进成骨细胞增殖与分化的作用及其机制[J].中华骨科杂志, 2013, 33(6):664. doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-2352.2013.06.011 [13] 李晶, 宋敏, 罗晓, 等.淫羊藿总黄酮对去势大鼠骨组织BMP-2和OPGmRNA表达的影响[J].中华中医药杂志, 2015, 30(7):2529. [14] XU YQ, LI ZZ, YUAN L, et al.Variation of epimedins A-C and icariin in ten representative populations of Epimedium brevicornu Maxim and implications for utilization[J].Chem Biodivers, 2013, 10(4):711. doi: 10.1002/cbdv.201100424 [15] 徐无忌, 杨康, 刘思华.六味地黄丸对椎间盘体外退变模型椎间盘细胞外基质组分的影响[J].中国组织工程研究, 2017, 21(16):2495. doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.007 [16] 张雁儒, 张辉, 卡卡, 等.骨形态发生蛋白质-4转染骨髓间充质干细胞复合双层聚乳酸羟基乙酸共聚物支架修复兔膝关节软骨缺损[J].解剖学杂志, 2016, 39(6):667. doi: 10.3969/j.issn.1001-1633.2016.06.006 [17] CAI M, LI G, TAO K, et al.Maohuoside A acts in a BMP-dependent manner during osteogenesis[J].Phytother Res, 2013, 27(8):1179. doi: 10.1002/ptr.4840 [18] INDRAN IR, LIANG RL, MIN TE, et al.Preclinical studies and clinical evaluation of compounds from the genus Epimedium for osteoporosis and bone health[J].Pharmacol Ther, 2016, 162:188. doi: 10.1016/j.pharmthera.2016.01.015