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乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一。过去20年中国女性乳腺癌发病率呈现持续增长的趋势，预计到2030年，全球乳腺癌的发病人数和死亡人数将分别达到264万和170万[1-2]。化疗在降低乳腺癌转移率和死亡率方面发挥着至关重要的作用[3]。
紫杉醇(paclitaxel，PTX)是从红豆杉属植物提取的一种具有广谱、高效抗癌活性的二萜类化合物，能够有效抑制微管蛋白的解聚并保持其稳定，从而抑制癌细胞有丝分裂的进程，最终达到抑制肿瘤增殖的作用[4]。紫杉醇对乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等具有良好的治疗作用，是治疗复发和转移性乳腺癌的临床一线化疗药，但存在水溶性低，生物利用度较差，不良反应大等缺点[5]，同时，紫杉醇是P-糖蛋白(P-gp)底物，P-gp泵可将药物转运出细胞外从而导致肿瘤细胞耐药性的产生，也是导致乳腺癌紫杉醇化疗失败的主要原因[6]。
纳米载药系统在有效进行药物输送、提高药物靶向浓度、降低药物对正常组织的毒性和克服化疗药物耐药性等方面为化疗药物的发展提供了新的解决途径[7]。PEG-DSPE是聚乙二醇的磷脂衍生物，为两性高分子化合物，既含有亲水的聚乙二醇又含有疏水的脑磷脂，在水中的性质近似于表面活性剂，以胶束的形式存在[8]。当PEG-DSPE与脂质体混合时，其疏水端插入脂质体双分子膜，使PEG-DSPE亲油的羧基嵌入脂质体形成稳定的聚乙二醇保护层，避免了网状内皮系统对它的吞噬作用，延长了脂质体在血液中的循环时间[9]。
维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)在纳米药物系统的应用得到广泛研究。美国FDA早已批准TPGS作为一种安全的药用辅料，可广泛应用于药用处方中，在制剂中可作为增溶剂、吸收促进剂、乳化剂、增塑剂、致孔剂及固体分散体的载体等[10]。TPGS作为一种生物材料，具有良好的促进吸收作用和抗多重药耐药作用，增强细胞摄取和细胞毒性，具有良好的生物粘附性能，尤其是对ATP结合盒(ATP binding cattle，ABC)转运蛋白家族有较强的抑制作用[11]。TPGS作为一种非离子表面活性剂，不仅能够抑制ABC转运蛋白家族中的P-gp泵，其本身也是一种两亲性共聚物，具有较强的药物乳化能力，因此可将其应用于纳米混悬剂的辅助稳定剂[12]。
为了有效提高紫杉醇抗肿瘤效应，降低不良反应及提高逆转肿瘤多药耐药作用，本研究拟选用PEG-DSPE作为纳米载体，构建TPGS修饰的紫杉醇长循环胶束给药系统，考察该给药系统在体外的抗肿瘤效应及逆转多药耐药作用，为开发新型的抗癌药物给药系统提供参考依据。
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人乳腺癌细胞株MCF-7购自中国科学院细胞库；胎牛血清购自Hyclone公司；DMEM高糖培养基购自Hyclone公司；PEG2000-DSPE购买于艾韦特公司；紫杉醇粉剂购买于美仑生物公司；TPGS购买于阿拉丁生化公司；聚偏氟乙烯(PVDF膜)、ECL化学发光试剂盒购自美国Millipore公司；Transwell小室买于Corning公司；Annexin V & Dead Cell凋亡试剂盒购买于Muse公司。一抗Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、Caspase-3、β-actin、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)、多药耐药基因1(multidrug resistance 1，MDR1)及其编码产物P-gp购自Proteintech公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔、兔抗鼠二抗购自北京中山金桥有限公司。
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MCF-7紫杉醇耐药细胞株(MCF-7/PR)由本实验室构建保存，构建方案采用紫杉醇体外浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导MCF-7细胞产生耐药性，使其能在含有10 μmol/L浓度的紫杉醇培养液中稳定生长6个月以上以维持其耐药性[13]。所有细胞在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，每3~4d传代1次。所有实验均采用对数生长期细胞。
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采用薄膜分散法制备紫杉醇球状胶束，按处方称取一定量的PTX、TPGS、DSPE-PEG2000(TPGS与DSPE-PEG2000的摩尔比分别为1:10，药脂比为1:20，w/w)，置于圆底烧瓶中。加入适量的甲醇，超声并水浴使其充分溶解，将混合溶液在旋转蒸发仪上温度保持45 ℃左右，转速100 r/min，进行旋转蒸干。形成半透明薄膜后，随即加入PBS缓冲液对形成的脂膜进行水化，并在室温下孵育12 h，10 000 r/min离心10 min去除未包载的紫杉醇，沉淀收集在冻干瓶中并在-80 ℃下保存8 h以备后续冻干，在-55 ℃下减压下初步干冷冻干燥36 h获得紫杉醇胶束冻干粉末。将纳米颗粒溶液放置于400目碳包埋的铜网上，随后通过透射电镜检测其纳米颗粒的形态。将制备好的紫杉醇胶束冻干粉末，取适量稀释后，室温下放入粒径分析检测器中，检测粒径；同时另取稀释好的紫杉醇胶束溶液置于电位杯中，对Zeta电位进行测定。
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对数生长期细胞消化后离心，制成单细胞悬液接种于96孔板，培养过夜使细胞贴壁生长。按对细胞进行加药处理后继续培养24 h终止培养，吸出培养基，每孔加入200 μL 10%三氯乙酸(TCA)，4 ℃固定50 min，用双蒸水洗涤5次，室温下干燥；每孔加入100 μL 0.4% SRB染液染色30 min，用1%乙酸溶液洗涤5次后干燥，每孔加入150 μL 10 mmol/L Trisbase溶液，摇床上剧烈振荡15 min，待SRB染液充分溶解，酶标仪检测波长515 nm处的吸光度值。存活率=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)。
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调整细胞悬液浓度后接种于6孔板中，每孔加入2 mL培养基，按照实验分组进行加药处理，24 h后0.25%不含EDTA胰酶消化离心，收集全部细胞，用4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次；按照凋亡试剂盒说明书进行操作，避光孵育30 min，流式细胞仪进行凋亡检测。
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胰酶消化对数生长期细胞，制成单细胞悬液接种于6孔板，培养过夜细胞贴壁生长，当细胞密度达80%~90%时，10 μL无菌枪头使用相同力度在细胞板中间轻轻划出一道划痕，注意保持各组划出划痕的宽度基本一致，用PBS冲洗3次，再对细胞进行相关的加药处理，分别于加药后0、24 h在低倍镜下测量各组细胞任意3个部位的不同痕迹宽度。
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胰酶消化对数生长期细胞，用无血清培养基将每组的细胞调整到相同细胞密度。按照实验分组，每组各取100 μL加入Transwell小室的上室。Transwell小室底部预先加入60 μL已稀释的Matrigel基底膜基质胶，下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基，5%CO2、37 ℃培养箱中培养24 h。取出Transwell小室，用棉签小心擦去Transwell小室上室的培养基以及膜上部未穿过的细胞，4%多聚甲醛固定20 min，吉姆萨染液染色，拍照观察高倍镜下穿过的细胞数目。
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按对照组、紫杉醇组、紫杉醇胶束组处理细胞，消化细胞后用预冷PBS洗涤，每组加入80 μL蛋白裂解液充分混匀，冰上裂解30 min后4 ℃离心15 min吸取上清液；蛋白质二喹啉甲酸法(BCA法)进行定量分析；加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×，蛋白于95 ℃煮15 min，蛋白样品总量为25 μL，Marker上样量为5 μL，100 V、10%十二烷基硫酸钠聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)1.5 h；电泳结束后将蛋白转置甲醇活化后的PVDF膜，5%的脱脂奶粉溶于TBS-T中，将膜放入进行封闭2 h。孵育一抗，分别加入鼠抗人Bax、β-actin抗体，兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3、MRP、P-gp(工作浓度1:1 000)抗体，4 ℃孵育过夜，TBS-T缓冲液洗涤PVDF膜4次，每次8 min；HRP标记的羊抗兔、兔抗鼠二抗(1:5 000)37 ℃孵育2 h后洗膜，进行BIO-RAD成像系统拍照，Image J软件分析灰度结果，每组实验重复3次。
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采用方差分析和q检验。
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采用“薄膜分散法”制备了紫杉醇长循环胶束纳米粒，游离的紫杉醇在PBS中溶解度差，而经搭载的紫杉醇胶束在PBS中溶解性较好，分散较均匀(见图 1A)。紫杉醇胶束经负染后在电镜下观察呈圆球形，粒径30~40 nm，PCS分析水合粒径也在30 nm左右，与电镜结果一致(见图 1B、1C)。紫杉醇胶束电位为-5.4 mV，利用紫外分光光度计测得紫杉醇在胶束系统中的载药量为25.37%(见图 1D)。
图 1 紫杉醇长循环胶束形貌、粒径和电位图
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各浓度紫杉醇胶束组细胞存活率均低于紫杉醇组和对照组(P＜0.01)(P＜0.01)(见表 1)。
分组 0.1 μmol/L 0.5μmol/L 1μmol/L 对照组 101.44±1.86 102.21±1.31 100.68±1.99 紫杉醇组 91.09±3.74 80.94±8.72 67.52±3.73 紫杉醇胶束组 76.57±0.72** 70.30±5.70** 55.41±4.49** F 78.121 21.547 183.120 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 5.997 36.753 12.682 q检验:与对照组、紫杉醇组比较**P＜0.01 表 1 紫杉醇及紫杉醇胶束对乳腺癌耐药细胞存活率的影响(ni=3;x±s; %)
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采用流式分析实验对紫杉醇和紫杉醇胶束(1 μmol/L)对MCF-7/PR凋亡的影响进行了研究，与紫杉醇组比较，紫杉醇胶束组诱导乳腺癌耐药细胞株的凋亡能力更强(P＜0.01) (见图 2、表 2)。
图 2 紫杉醇和紫杉醇胶束处理乳腺癌耐药细胞（MCF-7/PR）后细胞凋亡率
分组 n 早期凋亡率 对照组 3 1.24±0.57 紫杉醇组 3 1.96±0.25 紫杉醇胶束组 3 2.93±1.36** F — 11.67 P — ＜0.01 MS组内 — 0.180 q检验:与对照组、紫杉醇组比较**P＜0.01 表 2 紫杉醇组与紫杉醇胶束组乳腺癌耐药细胞的凋亡率比较(x±s；%)
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采用划痕实验和Transwell实验研究了紫杉醇以及紫杉醇胶束组对乳腺癌耐药细胞侵袭及迁移能力的影响。划痕实验结果表明，与对照组相比，紫杉醇组的迁移率明显下降，而紫杉醇胶束组的迁移率下降更为明显(见图 3)。Transwell实验结果表明，相对于对照组和紫杉醇组，紫杉醇胶束组细胞的侵袭数目和迁移率均明显降低(P＜0.01)(见表 3)。
图 3 紫杉醇和紫杉醇胶束处理乳腺癌耐药细胞MCF-7/PR对其迁移和侵袭影响
分组 n 侵袭细胞数/个 迁移率/% 对照组 3 162±6.11 74.46±2.11 紫杉醇组 3 127±4.36 42.92±0.46 紫杉醇胶束组 3 97±1.53** 19.80±0.56** F — 162.449 1357.43 P — ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 19.556 1.664 q检验:与对照组、紫杉醇组比较**P＜0.01 表 3 紫杉醇及紫杉醇胶束对乳腺癌耐药细胞侵袭和迁移的影响(x±s)
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采用蛋白质印迹实验研究紫杉醇及紫杉醇胶束对乳腺癌耐药细胞凋亡蛋白和耐药相关蛋白的影响。与对照组和紫杉醇组比较，而紫杉醇胶束组Bcl-2的表达量明显减少，Caspase-3以及Bax的表达明显增加(P＜0.01)。化疗后肿瘤细胞产生的MDR常导致化疗失败。MDR与P-gp和MRP高表达相关。相对于对照组和紫杉醇组，紫杉醇胶束组能够明显抑制P-gp和MRP的表达水平(P＜0.01)(见图 4、表 4)。
图 4 紫杉醇和紫杉醇胶束处理MCF-7/PR后对凋亡相关蛋白和耐药蛋白表达的影响
分组 n MRP P-gp Caspase-3 Bax Bcl-2 对照组 3 1.00±0.002 1.00±0.008 1.00±0.005 1.00±0.008 1.00±0.001 紫杉醇组 3 0.97±0.005 0.95±0.015 1.18±0.012 1.13±0.006 0.85±0.004 紫杉醇胶束组 3 0.79±0.005** 0.81±0.008** 1.33±0.010** 1.38±0.048** 0.79±0.011** F — 2107.01 256.28 902.97 139.20 704.85 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 0.000 0.000 0.000 0.001 0.000 q检验：与对照组、紫杉醇组比较**P＜0.01 表 4 紫杉醇和紫杉醇胶束处理乳腺癌耐药细胞后对凋亡相关蛋白和耐药蛋白表达的影响(x±s)
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肿瘤的多药耐药是导致传统化疗失败的重要原因，与过度表达药物外排泵、细胞凋亡机制的缺陷、突变的分子靶点、肿瘤的微环境、缺氧及胞外低pH等机制有关。利用纳米颗粒容易进入细胞的特点，纳米颗粒作为运载体有效逆转肿瘤的多药耐药。为了探索克服肿瘤耐药的有效治疗方式，本课题选用紫杉醇为模型药物，设计了一种对肿瘤微环境响应的基于TPGS修饰的PEG-DSPE胶束系统，研究了其在逆转乳腺癌多药耐药性方面的能力。
PEG-DSPE纳米胶束是体内可降解并经FDA批准的可用于人体的药物载体材料，这种两亲性共聚物能在水介质中形成具有疏水性内核与亲水性外壳的超分子聚集体，疏水性内核包载药物，提高难溶性药物的溶解度，同时可避免药物降解；而PEG亲水性外壳有助于纳米胶束在血液中的长时间循环，因此PEG-DSPE纳米胶束常用于难溶性药物的增溶载体。
TPGS由维生素E琥珀酸酯的羧基与聚乙二醇1000(PEG1000)的羟基酯化而成，是由美国FDA批准的生物安全性高的高分子聚合物。TPGS具有两亲性结构，由亲油性的烷基尾(维生素E)和亲水性的极性头(PEG)组成，具有良好的生物相容性和理化性质。基于TPGS的抗肿瘤药物纳米制剂具有药物包封率高、体内循环时间长、口服生物利用度高等优点。更为重要的是，TPGS还是一种高效的P-gp抑制剂，能与P-gp非转运活性位点结合，影响细胞膜的流动性，从而导致P-gp构象发生改变。
细胞凋亡基因过表达凋亡抑制蛋白和膜蛋白介导的药物外排是产生肿瘤多药耐药最为重要的机制。细胞凋亡是由一系列信号分子精密调控的程序性死亡过程，信号传导过程可以分为两条基本途径：外源性的凋亡主要依赖于位于细胞膜表面连接的死亡受体激活Caspase信号通路，而内源性凋亡主要是由Caspase依赖性和非依赖于Caspase的通路激活线粒体内在通路。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2族中重要的抑制凋亡和促进凋亡蛋白。本研究发现，紫杉醇胶束组能够更加有效地诱导细胞凋亡，上调Caspase-3、Bax的表达，而Bcl-2的表达下降，这一结果可能会促使肿瘤耐药细胞内线粒体膜通透性增加，线粒体发生膨胀，引起下游Caspase-3的激活，导致细胞凋亡。
P-gp是一种相对分子质量为170 000的跨膜糖蛋白，高度表达于耐药肿瘤细胞膜上，可能量依赖性地将药物泵出细胞，并减少药物转运进入细胞，使细胞内药物的蓄积减少，从而产生耐药性。MRP具有像P-gp一样的外排抗肿瘤药物的能力，与ATP结合并水解ATP之后将胞质内的抗肿瘤药物外排出细胞，从而降低肿瘤细胞内的药物浓度，降低药效。因此，提高化疗药物的有效浓度仍然是目前克服肿瘤耐药的主要可行方法。本实验利用TPGS修饰的PEG-DSPE胶束搭载紫杉醇，可以有效预防药物分子被外排泵识别，并且在细胞内释放药物。蛋白印迹实验证明PEG2000-DSPE-TPGS-PTX相对于紫杉醇更有效地减低P-gp和MRP的蛋白表达水平。
根据课题前期预实验确定了PTX药物浓度梯度，在所选药物浓度梯度范围内进行体外细胞实验，乳腺癌紫杉醇耐药细胞株的生长抑制情况存在较明显的差异性，且浓度选择均小于IC50，避免了细胞大量死亡而干扰相关实验指标的检测，便于观察对比各组间差异。
另外，乳腺癌病人化疗过程中, 多西紫杉醇血药浓度-时间曲线下面积(AUC)与疗效及不良反应相关[14]。根据相关研究数据, 中国病人应用多西紫杉醇AUC值的正常范围可考虑为1.0~3.0 μmol·h-1·L-1。根据AUC正常范围值调整紫杉醇用量有望减少不良反应的发生[15]。因此，课题实验紫杉醇浓度选择为1μmol/L，可更加合理地指导紫杉醇的临床应用。
综上所述，TPGS修饰的紫杉醇长循环胶束给药系统，可有效在体外发挥抗肿瘤效应及逆转多药耐药作用，可以为开发新型的抗癌药物给药系统提供一定的参考依据。
紫杉醇长循环纳米胶束的制备及其对乳腺癌多药耐药的研究
Preparation of paclitaxel long-circulating nanomicelles and their multidrug resistance to breast cancer
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摘要:
目的制备紫杉醇长循环胶束TPGS-PEG2000-DSPE-PTX，探讨紫杉醇胶束对乳腺癌MCF-7紫杉醇耐药细胞（MCF-7/PR）增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。 方法采用薄膜分散法制备负载紫杉醇的TPGS-PEG2000-DSPE-PTX胶束，对载药胶束进行形貌、粒径、电位等表征分析；采用磺酰罗丹明B染色法、Annexin V/PI染色法以及划痕和transwell实验检测紫杉醇胶束对乳腺癌耐药细胞株增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。 结果成功构建了紫杉醇载药胶束，透射电镜可见载药胶束成圆球形，粒径30~40 nm，Zeta电位为-5.4 mV，紫外分光光度计检测并计算载药量为25.37%。与对照组和紫杉醇组比较，紫杉醇胶束组有效抑制耐药细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，上调caspase3和Bax的蛋白表达水平（P < 0.01），下调Bcl-2、P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白的表达水平（P < 0.01）。 结论成功构建TPGS修饰的紫杉醇长循环胶束给药系统，可有效在体外发挥抗肿瘤效应及逆转多药耐药作，为开发新型的抗癌药物给药系统提供了参考依据。 Abstract:ObjectiveTo prepare paclitaxel long-circulating micelle TPGS-PEG2000-DSPE-PTX and investigate the effects of paclitaxel micelles on proliferation, apoptosis, migration and invasion of paclitaxel-resistant cells (MCF-7/PR) in breast cancer. MethodsThe paclitaxel-loaded TPGS-PEG2000-DSPE-PTX micelles were prepared by membrane dispersion method.The morphology, particle size and potential of the drug-loaded micelles were characterized..The sulfonyl rhodamine B method, flow cytometry and migration were performed.Sulfonylrhodamine B staining, Annexin V/PI staining, scratch and transwell assays were used to detect the effects of paclitaxel micelles on proliferation, apoptosis, migration, and invasion of paclitaxel resistant cell lines. ResultsPaclitaxel-loaded micelles were successfully constructed.The results of transmission electron microscopy showed that the drug-loaded micelles became spherical, with a particle size of 30-40 nm and a zeta potential of -5.4 mV.The UV spectrophotometer detected and calculated the drug loading amount to 25.37%.Compared with the control group and the paclitaxel group, the TPGS-PEG2000-DSPE-PTX group effectively inhibited the proliferation, migration and invasion of drug-resistant cells, induced apoptosis, up-regulated the protein expression levels of caspase3 and Bax(P < 0.01), and down-regulated Bcl-2, P-gp and MRP protein expression levels(P < 0.01). ConclusionsThe successful construction of TPGS modified paclitaxel long-circulating micelle delivery system can effectively exert anti-tumor effect and reverse multi-drug resistance in vitro, and provide a reference for the development of a new anti-cancer drug delivery system. -
Key words:
- breast neoplasms /
- nano drug-loaded /
- spherical micelle /
- paclitaxel
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表 1 紫杉醇及紫杉醇胶束对乳腺癌耐药细胞存活率的影响(ni=3;x±s; %)
分组 0.1 μmol/L 0.5μmol/L 1μmol/L 对照组 101.44±1.86 102.21±1.31 100.68±1.99 紫杉醇组 91.09±3.74 80.94±8.72 67.52±3.73 紫杉醇胶束组 76.57±0.72** 70.30±5.70** 55.41±4.49** F 78.121 21.547 183.120 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 5.997 36.753 12.682 q检验:与对照组、紫杉醇组比较**P＜0.01 
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表 2 紫杉醇组与紫杉醇胶束组乳腺癌耐药细胞的凋亡率比较(x±s；%)
分组 n 早期凋亡率 对照组 3 1.24±0.57 紫杉醇组 3 1.96±0.25 紫杉醇胶束组 3 2.93±1.36** F — 11.67 P — ＜0.01 MS组内 — 0.180 q检验:与对照组、紫杉醇组比较**P＜0.01
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表 3 紫杉醇及紫杉醇胶束对乳腺癌耐药细胞侵袭和迁移的影响(x±s)
分组 n 侵袭细胞数/个 迁移率/% 对照组 3 162±6.11 74.46±2.11 紫杉醇组 3 127±4.36 42.92±0.46 紫杉醇胶束组 3 97±1.53** 19.80±0.56** F — 162.449 1357.43 P — ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 19.556 1.664 q检验:与对照组、紫杉醇组比较**P＜0.01
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表 4 紫杉醇和紫杉醇胶束处理乳腺癌耐药细胞后对凋亡相关蛋白和耐药蛋白表达的影响(x±s)
分组 n MRP P-gp Caspase-3 Bax Bcl-2 对照组 3 1.00±0.002 1.00±0.008 1.00±0.005 1.00±0.008 1.00±0.001 紫杉醇组 3 0.97±0.005 0.95±0.015 1.18±0.012 1.13±0.006 0.85±0.004 紫杉醇胶束组 3 0.79±0.005** 0.81±0.008** 1.33±0.010** 1.38±0.048** 0.79±0.011** F — 2107.01 256.28 902.97 139.20 704.85 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 0.000 0.000 0.000 0.001 0.000 q检验：与对照组、紫杉醇组比较**P＜0.01
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