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银杏Ginkgo biloba L.为银杏科银杏属多年落叶乔木[1]。银杏酸是分布于银杏叶、果和外种皮中的生物活性物质，在外种皮中含量最高[2]。其为一系列弱极性化合物，包括白果新酸、白果酸、十七烷二烯银杏酸、氢化白果酸以及十七烷一烯银杏酸5种主要成分[3]，其中白果酸含量最高，也是目前对银杏烃基酚酸类化合物进行定量检测的主要指标[4]。银杏酸对多种肿瘤细胞有较强的抑制作用，可抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移及诱导肿瘤细胞凋亡[5-6]，有较好的研究价值及市场应用前景。银杏外种皮是银杏果实的最外层肉质皮，常被作为废弃物，以其为原料提取银杏酸，有助于资源的充分利用。然而，在外种皮开发利用及工艺研究过程中，还存在问题：银杏外种皮的开发利用工作还处在实验室的探索研究阶段，未进行工厂化大规模生产，落后于银杏叶的开发利用。因此，亟需一种适合工业化生产银杏酸的方法。目前，银杏酸常用的提取方法有有机溶剂浸提法、回流法、超声萃取法、超临界CO2萃取法等[7-10]，但这些提取方法存在溶剂毒性较大、耗时耗能、设备要求高、成本较高等缺点，尚不能满足生产需要。而采用碱提酸沉法提取银杏酸，操作简单方便，成本降低，无需加热，可以节约大量能耗，不失为大量提取银杏酸的首选工艺。本研究以碱提酸沉法提取银杏外种皮中银杏酸，通过正交试验确定最佳提取条件，为银杏外种皮开发及综合利用提供参考。
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FA2204B型电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司)，LC-20A型高效液相色谱仪[岛津企业管理(中国)有限公司]，IKA旋转蒸发仪(上海人和科学仪器有限公司)，XW-80A型微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)，L550型离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，Milli-Q Advantage A10型超纯水系统(密理博(中国)有限公司)，GR150A型粉碎机(合肥荣事达小家电有限公司)，DGG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)。
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银杏外种皮(购买于山东临沂药材市场，经蚌埠医学院中医药基础教研室李红梅老师鉴定为银杏科银杏属植物银杏的外种皮)，碳酸氢钠(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)，盐酸(分析纯，江苏彤晟化学试剂有限公司)，白果酸标准品(上海源叶生物科技有限公司，纯度>95%)，甲醇、乙腈(色谱纯，美国天地有限公司)，三氟乙酸(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)。
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取银杏外种皮粉末适量，加碳酸氢钠水溶液碱提，过滤取滤液，用盐酸调pH，酸沉，过滤取滤渣，干燥即得。
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取白果酸标准品，精密称定5.0 mg，色谱甲醇溶解配成9.6 mg/mL的白果酸对照品储备液，用色谱甲醇依次稀释2倍，得到系列浓度工作液，依次为4.8、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15 mg/mL。
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色谱柱：Waters Sun FireTM C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测器：岛津SPD-20a；波长310 nm；柱温30 ℃；流速1 mL/min；进样量20 μL；流动相为0.05%三氟乙酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0~30 min，75% B→90% B；30~35 min，90% B；35~45 min，90% B→75% B)。
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分别取“1.2.2 ”项下不同浓度的对照品工作液，按照“1.3色谱条件”进样分析，记录峰面积。
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分别取对照品溶液和供试品溶液20 μL，按照“1.3色谱条件”进行分析。
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精密称取已知含量的银杏外种皮粉末0.1 g 6份，分别加入精密称定的白果酸对照品，按照“1.2.1 ”项下方法处理，按“1.3色谱条件”测定6份混合后的峰面积，计算回收率。
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取同一银杏外种皮提取液，按照“1.3色谱条件”连续进样6次分析，测峰面积并计算相对标准偏差(RSD)。
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取同一份银杏外种皮提取液按照“1.3色谱条件”连续3 d，每天连续进样3次，测峰面积并计算RSD。
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按照“1.2.1 ”项下方法制备同一浓度银杏外种皮提取液6份，“1.3色谱条件”进样分析，测峰面积并计算RSD。
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取同一银杏外种皮提取液，分别于0、12、24、48、96、120 h按照“1.3色谱条件”进样分析，测峰面积并计算RSD。
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在碱液浓度3%，碱提时间1 h，酸沉pH 4，酸沉时间1 h条件下，选择料液比1:5、1:10、1:20、1:30进行单因素试验考察，以白果酸含量为指标，HPLC进样分析，记录峰面积，按照标准曲线方程求各料液比下白果酸含量。
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在料液比1:10，碱提时间1 h，酸沉pH 4，酸沉时间1 h条件下，选择碱液浓度1%、2%、3%、5%进行单因素试验考察。
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在料液比1:10，碱液浓度3%，酸沉pH 4，酸沉时间1 h条件下，选择碱提时间0.5、1、1.5、2 h进行单因素试验考察。
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在料液比1:10，碱液浓度3%，碱提时间1 h，酸沉时间1 h条件下，选择酸沉pH 2、3、4、5进行单因素试验考察。
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在料液比1:10，碱液浓度3%，碱提时间1 h，酸沉pH 4条件下，选择酸沉时间0.5、1、1.5、2 h进行单因素试验考察。
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根据单因素试验结果，选取3个因素3个水平进行L9(34)正交试验(见表 1)。
水平 A料液比/(m/v) B碱液浓度/(%) C碱提时间/h 1 1:5 1 0.5 2 1:10 2 1 3 1:20 3 1.5 表 1 正交试验因素水平
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采用方差分析。
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以峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)，得线性回归方程为Y=5E+6X+685 953，r=0.999 4(n=6)，结果表明银杏酸在0.15~4.8 mg/mL浓度范围内具有良好线性关系。
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待测组分峰形良好，白果酸对照品保留时间为26.8 min，分离度＞2，与其他峰可达到基线分离(见图 1)。
图 1 银杏外种皮中白果酸的HPLC分析
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该方法平均回收率为100.13%，RSD为1.61%，该方法准确度良好(见表 2)。
编号 称样量/g 含白果
酸量/mg加入
对照品量/mg测得量/
mg回收率/
%平均
回收率/%RSD/% 1 0.1475 1.9480 1.8125 3.7667 100.34 2 0.1371 1.9211 1.8125 3.6982 98.05 3 0.1519 1.9499 1.8125 3.7382 98.66 100.13 1.61 4 0.1864 1.9850 1.8125 3.8324 102.02 5 0.1628 1.9683 1.8125 3.8135 101.80 6 0.1392 1.9226 1.8125 3.7332 99.89 表 2 加样回收率结果
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计算该方法日内精密度，RSD为0.39%，该方法日内精密度良好。
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计算该方法日间精密度，RSD为1.17%，该方法日间精密度良好。
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测6份同一浓度提取液峰面积，计算RSD为1.45%，该方法重复性良好。
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记录不同时间进样的峰面积，计算RSD为1.52%，表明银杏酸在常温放置120 h内稳定性良好。
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单因素试验结果表明，随着料液比增加，白果酸含量先增加后减少，1:10料液比下银杏外种皮中银杏酸含量较高。随着碱液浓度增大，银杏酸含量变化幅度平缓，考虑到生产成本，碱液浓度选择为3%。随着碱提时间增加，白果酸含量逐渐增加并达到平缓趋势，因此最佳碱提时间选择为1 h。不同酸沉pH对应的白果酸含量相差无几，为节约盐酸用量，选择酸沉pH为5作为最佳酸沉pH。随着酸沉时间延长，对应的白果酸含量增加趋势较小并保持平缓，因此最佳酸沉时间选择为1 h。
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根据正交试验极差值，影响因素由大到小顺序依次为B碱液浓度>A料液比>C碱提时间，不同因素内各水平对结果的影响强弱为：A2>A3>A1；B3>B2>B1；C2>C3>C1(见表 3)。根据正交试验方差分析结果，FC < 显著性检验F0.05(2, 2)=19.00 < FA < F0.01(2, 2)=99.00 < FB，料液比(P < 0.05)和碱液浓度(P < 0.01)对碱提酸沉法提取银杏外种皮中银杏酸具有显著影响(见表 4)。通过正交试验可以确定提取条件的优化组合为A2B3C2，即碱提酸沉法提取银杏外种皮中银杏酸最佳工艺条件为料液比1:10、碱液浓度3%、碱提时间1 h。
编号 A B C D(空白) 白果酸含量/(mg/g) 1 1 1 1 1 6.59 2 1 2 2 2 19.48 3 1 3 3 3 20.34 4 2 1 2 3 19.23 5 2 2 3 1 36.19 6 2 3 1 2 32.78 7 3 1 3 2 16.02 8 3 2 1 3 32.20 9 3 3 2 1 37.79 K1 15.47 13.95 23.86 26.86 K2 29.40 29.29 25.50 22.76 K3 28.67 30.30 24.18 23.92 R 13.93 16.36 1.64 4.10 表 3 L9(34)正交试验直观分析结果
方差来源 偏差平方和 自由度 均方 F P A 368.82 2 184.41 81.22 < 0.05 B 503.98 2 251.99 110.98 < 0.01 C 4.54 2 2.27 1.00 < 0.05 误差 4.54 2 F0.05(2, 2)=19.00；F0.01(2, 2)=99.00 表 4 L9(34)正交试验方差分析结果
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中国是银杏之乡，为了充分利用资源优势，人们对银杏资源研究逐渐深入，近年来研究表明，银杏外种皮中的有效部位银杏酸在抗菌[11]、抗炎、杀虫等方面具有很好的活性，也可抑制多种肿瘤的生长[12-13]，已应用于医学研究、生物农药和化妆品等方面。银杏外种皮中含有丰富的银杏酸，从中提取银杏酸，可充分利用资源优势，变废为宝，具有广阔的应用前景。利用银杏酸具有的酸性化学性质，本研究以银杏外种皮为原料，采用碱提酸沉法提取银杏酸，通过正交试验确定最佳提取条件。
在前期研究基础上，考察单因素时，选取料液比1:10，碳酸氢钠作为碱提溶剂，避免与酚羟基反应生成银杏酚而影响银杏酸的生成，随着料液比增加，白果酸含量先增加后减少，1:10料液比下银杏外种皮中银杏酸含量较高，可能是因为1:10时银杏酸达到饱和，碱液再增加，银杏外种皮中其他酸性物质析出，影响银杏酸反应析出。根据单因素试验结果，从生产成本和提取效率方面综合考虑，选取料液比1:10，碱液浓度3%，碱提时间1 h，酸沉pH 5，酸沉时间1 h进行正交试验。因正交试验的直观分析结果对试验的误差和各因素作用是否显著不能进行准确的估计，所以需要对正交试验的结果进行方差分析。通过单因素试验和正交试验，最终确定碱提酸沉法提取银杏外种皮中银杏酸的最佳工艺条件是料液比1:10，碱液浓度3%，碱提时间1 h，酸沉pH 5，酸沉时间1 h。
参考银杏酸含量测定的相关文献[14-16]，对色谱条件中的流动相比例进行了优化，分别考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%三氟乙酸水的和含0.1%三氟乙酸的乙腈-0.1%三氟乙酸水等流动相系统，另外考虑酸对色谱柱的影响，最终以乙腈-0.05%三氟乙酸水作流动相较佳。以银杏酸中含量最高的的白果酸为检测指标，采用HPLC测含量，根据方法学考察结果可知该方法专属性强，准确度精密度良好，稳定可行，重复性好，适合银杏酸含量的测定。
目前，提取银杏酸的方法主要包括有机溶剂浸提法、回流法、超声萃取法、超临界CO2萃取法，然而有机溶剂毒性较大，污染环境，成本较高，不适合工业化生产。回流法不适用于受热易破坏的成分，且溶剂消耗量大，操作繁琐，使用超声萃取法存在噪音污染等不足，由于操作的局限性，大量生产中较少被采用。超临界CO2萃取法是近年来发展起来的新提取工艺，但是对技术设备要求较高，一次性投资较大，工业化大规模使用还受到一定限制。而采用碱提酸沉法提取银杏外种皮中银杏酸，操作简单易行，省时节能，节约成本，提取效率较高，适合银杏外种皮中银杏酸的大量提取。
碱提酸沉法提取银杏外种皮中银杏酸的工艺研究
Study on the extraction process of ginkgolic acid from seed coat of Ginkgo biloba using alkaline extraction and acid precipitation
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摘要:
目的优化银杏外种皮的有效部位总银杏酸的提取工艺。 方法采用碱提酸沉法提取银杏外种皮中银杏酸，通过单因素试验和正交试验，以白果酸含量为指标，采用高效液相色谱法测其含量，考察料液比、碱液浓度、碱提时间、酸沉pH、酸沉时间对提取工艺的影响。 结果银杏酸的最佳提取工艺条件为料液比1：5，碱液浓度3%，碱提时间1 h，酸沉pH 5，酸沉时间1 h。 结论经优选的碱提酸沉法提取银杏酸工艺，操作简单，稳定易行，提取效果好，重复性好，适合大量提取银杏外种皮中银杏酸。 Abstract:ObjectiveTo optimize the extraction process of ginkgolic acid from the seedcoat of Ginkgo biloba L. MethodsThe ginkgolic acid was extracted from the seedcoat of Ginkgo biloba using alkaline extraction and acid precipitation.The single factor test and orthogonal experiment were applied.The content of ginkgolic acid was set as parameter, and determined using high performance liquid chromatography.The effects of solid-liquid ratio, alkali concentration, alkali extraction time, acid precipitation pH and acid precipitation time on extraction process were investigated. ResultsThe ratio of solid to liquid for 1:5, alkali concentration for 3%, alkali extraction time for 1 h were the optimum extraction conditions. ConclusionsThe optimized extraction process of ginkgolic acid using alkaline extraction and acid precipitation is simple, stable, easy to operate, and has good extraction repeatability, and suitable to extract ginkgolic acid from the seedcoat of Ginkgo biloba. -
表 2 加样回收率结果
编号 称样量/g 含白果
酸量/mg加入
对照品量/mg测得量/
mg回收率/
%平均
回收率/%RSD/% 1 0.1475 1.9480 1.8125 3.7667 100.34 2 0.1371 1.9211 1.8125 3.6982 98.05 3 0.1519 1.9499 1.8125 3.7382 98.66 100.13 1.61 4 0.1864 1.9850 1.8125 3.8324 102.02 5 0.1628 1.9683 1.8125 3.8135 101.80 6 0.1392 1.9226 1.8125 3.7332 99.89 
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表 3 L9(34)正交试验直观分析结果
编号 A B C D(空白) 白果酸含量/(mg/g) 1 1 1 1 1 6.59 2 1 2 2 2 19.48 3 1 3 3 3 20.34 4 2 1 2 3 19.23 5 2 2 3 1 36.19 6 2 3 1 2 32.78 7 3 1 3 2 16.02 8 3 2 1 3 32.20 9 3 3 2 1 37.79 K1 15.47 13.95 23.86 26.86 K2 29.40 29.29 25.50 22.76 K3 28.67 30.30 24.18 23.92 R 13.93 16.36 1.64 4.10
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表 4 L9(34)正交试验方差分析结果
方差来源 偏差平方和 自由度 均方 F P A 368.82 2 184.41 81.22 < 0.05 B 503.98 2 251.99 110.98 < 0.01 C 4.54 2 2.27 1.00 < 0.05 误差 4.54 2 F0.05(2, 2)=19.00；F0.01(2, 2)=99.00
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