病例组：来源于2017年3-9月昆明市第三人民医院连续收治的活动性肺结核汉族病人，要求长期居住于云南省，年龄≥18岁。严格按照肺结核诊断标准纳入：2次痰涂片诊断阳性，胸部X线摄片显示结核征象以及相应的临床表现等。对照组：来源于同期昆明市延安医院体检中心健康体检者，要求与病例组同民族、相同居住地，年龄相差≤3岁。且无结核病史，胸片正常、血清结核抗体阴性。排除标准：(1)高血压、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺癌等并发症；(2)肝炎病毒感染、艾滋病、肿瘤病人以及长时间使用激素类药物和器官移植等导致免疫功能低下者；(3)无家族遗传病史。纳入本次研究的病例组共计122例，其中男72例(59%)，女50例(41%)，年龄(39.0±1.7)岁；对照组共计101例，其中男55例(54.5%)，女46例(45.5%)，年龄(39.5±1.4)岁。2组年龄、性别均具有可比性。本研究经昆明市延安医院及昆明市第三人民医院医学伦理委员会审核批准，病人及其家属均签署知情同意书。

对2组人员进行静脉血采集工作，于早晨空腹状态抽取左臂静脉血5 mL，2% EDTA抗凝，-80 ℃保存。使用DNA试剂盒抽提静脉全血0.2 mL中的基因组DNA。

以基因组DNA为模板扩增NRAMP1基因D543N、INT4变异所在片段，引物设计参照文献[3]。D543N扩增引物为：上游5′-GCA TCT CCC CAA TTC ATG GT-3′，下游5′-AAC TGT CCC ACT CTA TCC TG-3′；INT4扩增引物为：上游5′-TCT CTG GCT GAA GGC TCT CC-3′，下游5′-TGT GCT ATC AGT TGA GCC TC-3′。PCR反应体系：反应总体积为25 μL，其中Tag多聚酶1 U，10×PCR buffer 2.5 μL，上、下游引物浓度各0.4 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L, DNA模板1 μL，无菌双蒸水14.5 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s(共35个循环)，72 ℃延伸7 min。扩增产物在15 g/L琼脂糖凝胶电泳15 min，参照DL-2000为标准相对分子质量。

D543N与INT4的扩增产物分别以限制性内切酶Apa Ⅰ、Ava Ⅱ消化，酶切反应体系总体积20 μL，反应条件见表 1。将酶切产物进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，1 mmol/L溴化乙啶(EB)染色后紫外灯下观察，进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析。

采用t检验、χ²检验和logistic回归分析。

本研究检测的NRAMP1基因多态性为：(1)外显密码子543(D543N位点)中非保守单一碱基替代，使天门冬氨酸(GAC)变为天门冬酰氨(AAC)，即外显子15的543位密码子为GAC或AAC，经AvaⅡ酶切后有4个片段，等位基因Allele 1(G) = 126 bp，79 bp与39 bp；Allele 2(A) = 201 bp与39 bp。(2)内含子4(INT4位点)的单个核苷酸改变，即第14位核苷酸为G或C，经ApaⅠ酶切后有3个片段，等位基因Allele 1(G) = 624 bp；Allele 2(C) = 455 bp与169 bp。

INT4位点野生纯合子(G/G)、杂合子(G/C)、突变纯合子(C/C)在病例组和对照组的分布频率分别为66.4%、32.0%、1.6%和86.1%、12.9%、1.0%，2组差异有统计学意义(χ²=12.0, P < 0.01)，其中病例组G/C基因型频率显著高于对照组，经logistic回归分析可知，杂合型(G/C)携带者肺结核的患病风险为野生纯合型(G/G)的3.22倍(95%CI:1.61~6.47)。而D543N位点野生纯合子(G/G)、杂合子(G/A)、突变纯合子(A/A)在病例组和对照组的分布频率分别为61.5%、36.9%、1.6%和70.3%、29.7%、0.0%，差异无统计学意义(χ²=2.77, P>0.05) (见表 2)。

结核病的发病由宿主、致病菌、环境三者间的相关性失衡引起^[4]，其中宿主的遗传易感性在肺结核发病过程中起到了关键作用^[5]。结核病候选基因分为人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)基因及非HLA基因两类，NRAMP1基因属于后者^[6]。NRAMP1基因位于人类染色体2q35，编码550个氨基酸，主要分布于巨噬细胞膜的吞噬小体上^[7]。巨噬细胞吞噬细菌后将产生活性氧和氮的中间产物(NO^2-、NO^3-等)杀灭细菌, 同时细菌则自身合成超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等活性氧清除系统(以Fe²⁺等金属离子为辅助因子)得以生存^[8]。NRAMP1基因则通过将这些金属离子运出吞噬小体使细菌无法合成防御酶系, 从而使细胞抗菌^[9]。

NRAMP1基因外显密码子543(D543N)及内含子4(INT4)是目前报道较多的2个多态性位点。早在1998年，BELLAMY等^[10]对西非人群NRAMP1基因的多态性展开研究，发现INT4、D543N多态性与结核感染呈明显相关。YUAN等^[11]对近20年来国内外NRAMP1基因与结核易感性的相关研究进行Meta分析，结果显示在所有基因模型中，D543N多态性与肺结核均无相关性；而在隐性模型中，INT4多态性则显著增加了肺结核的发病风险；进一步对种族因素进行分层发现，D543N多态性增加了美洲人群患结核的风险；而INT4多态性则增加非洲人群结核的患病风险。邵凌云等^[3]的研究显示D543N、INT4多态性均与结核显著相关，二者的协同作用导致我国汉族人群对结核的易感性。而WU等^[12]对我国人群的研究显示，D543N、INT4基因型分布在肺结核病人与健康对照组间无显著差异。上述结果提示NRAMP1基因对结核的易感性受种族、地理环境等因素的影响，不同遗传背景使得基因型频率分布的差异较大。

我们在本次研究中发现，痰涂片阳性的肺结核病人和健康人群相比，INT4多态性组成差异具有统计学意义(χ²=12.0, P < 0.05)。经logistic单因素分析后显示，其杂合型(G/C)携带者患肺结核的风险为野生纯合型(G/G)的3.22倍，提示INT4位点基因多态性可能是云南汉族人群肺结核的易感因素。分析其可能机制为，位于内含子的基因多态性将引起mRNA的错误剪接，导致合成蛋白不完整或无活性^[13]。INT4含有外显子4a，可引入外显子5的终止密码子。在巨噬细胞系中，有或无外显子4a转录物的比例为1: 5，任何引起剪接受体位点消除的突变体均会在转录中改变这一比例，从而改变NRAMP1蛋白的功能(如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4β的上调，肿瘤杀伤活性等)^[14]。此外，不带电荷的天门冬酰胺替代负电荷的天门冬氨酸也会影响NRAMP1蛋白的功能^[13]，但D543N多态性组成差异则不显著(χ²=2.77, P>0.05)，提示D543N位点基因多态性可能与云南汉族人群肺结核的发生无显著相关。这与既往NRAMP1多态性导致的结核易感是由多个位点变异联合作用的观点有所差异，可能与不同的样本量、纳入标准及技术操作有关^[15]。

本研究首次对云南地区汉族人群NRAMP1基因与肺结核的相关性进行探究，在地域上具有一定代表性。在对象纳入方面，2组(病例/对照)对象年龄、性别相匹配，可比性好；鉴于隐性感染者对结核的易感性与健康人群差别不大，因此选取一般健康人群作为对照亦可取得较理想的研究效果。本研究提示NRAMP1基因INT4位点多态性可能影响云南汉族人群对肺结核的易感性，其可能作用机制为内含子的基因多态性引起mRNA的错误剪接导致合成蛋白不完整或无活性。本研究为不同地域人群D543N、INT4多态性组成与结核易感性之间的关系提供了一定理论依据，为探究NRAMP1基因在结核病发生发展过程中的作用机制提供了理论参考。今后如果能对肺结核易感人群开展基因筛查并及早采取预防措施，将有望为结核病防治提供新思路，为结核病疫苗研发设计和新药物的发现提供新靶点。