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大剂量或长期使用皮质激素会造成激素性股骨头坏死，激素性股骨头坏死已经成为骨科临床中十分常见的疾病，严重危害病人的生命健康以及降低病人的生活质量[1]。激素性股骨头坏死的发病机制有多种学说，其中血管活性因子水平异常学说逐渐被认同。血管活性因子水平异常，导致股骨头部分血管新生较少，微循环降低，股骨头部位缺血缺氧，造成成骨细胞凋亡，引起股骨头坏死[2]。PI3K/Akt信号转导通路在血管的新生过程中起到重要的作用。PI3K/Akt通过激活激酶系统而逐渐磷酸化，从而激活通路调控细胞因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、一氧化氮(NO)，它们是机体中十分重要的血管活性因子，促进血管新生[3-4]。葛根素是从中药葛根中提取的有效活性成分，具有很强的促进血管新生的作用，有研究[5]表明葛根素骨科方面有药理作用，如治疗酒精性股骨头坏死效果显著。本研究以激素性股骨头坏死大鼠为研究对象，探究葛根素对激素性股骨头坏死的作用，并探究其对血清中的VEGF和NO水平的影响。现作报道。
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健康SD大鼠30只，雄性，体质量为220~240 g，动物购买自湖北省实验动物研究中心，合格证编号：SCXK(鄂)：2016-005。动物购买后先适应性喂养1周。
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葛根素(湖北巨胜科技有限公司，批号：20160806)，甲泼尼龙琥珀酸钠注射液(比利时Pfizer Manufacturing BeLgium NV公司，批号：A07056)，水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司，批号：Z10970030)，多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司，批号：Z13952214)，VEGF酶联免疫吸附检测试剂盒(武汉博士德)，NO检测试剂盒(南京建成生物工程有限公司，批号：20160825)，β-actin、Akt、p-Akt兔抗鼠多克隆抗体(南京建成生物工程有限公司，批号：20160827、20160924、20160711)。
DXA型双能X线密度测量仪(美国Lunar公司)，电泳仪(美国Biorad公司)，BS-1101酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)，石蜡切片机(德国徕卡公司)。
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选择健康的SD大鼠20只，臀肌注射甲泼尼龙琥珀酸钠注射液，剂量为21 mg/kg，每日于早上8点注射，连续注射3 d，复制激素性股骨头坏死大鼠模型。将复制的20只激素性股骨头坏死模型大鼠随机分为模型组和观察组，每组10只。另外取10只健康的SD大鼠作为对照组，每日于早上8点注射0.9%氯化钠溶液，连续注射3 d。
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观察组大鼠于在最后一次臀肌注射完甲泼尼龙琥珀酸钠注射液后腹腔注射葛根素注射液，注射剂量为200 mg/kg，每日于早上8点注射，连续给药8周。对照组和模型组大鼠于相同时间腹腔注射0.9%氯化钠溶液，连续给药8周。
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(1) 一般状态观察：对比3组大鼠模型复制前、模型复制后及给药8周后的一般状态，主要观察项目有活动程度、毛发色泽、活动姿态、精神状况等。(2)股骨头病理切片观察和骨密度检测：于给药8周后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，取各组大鼠的股骨头置于多聚甲醛溶液中固定，然后再经过乙醇梯度脱水石蜡包埋，切片，脱蜡，苏木精-伊红染色，封片，光学显微镜下观察。观察各组大鼠股骨头组织的病理形态。用骨密度测量仪检测各组大鼠股骨头区域的骨密度。(3)血清中VEGF和NO水平检测：于给药8周后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，离心，收集血清，用酶联免疫吸附法检测血清中的VEGF水平，用化学法检测血清中的NO水平。(4)股骨头中Akt和p-Akt蛋白表达水平检测：于给药8周后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，取股骨头，提取股骨头中总蛋白，检测总蛋白浓度，电泳分离总蛋白，转膜，封闭，洗膜，加β-actin兔抗鼠多克隆抗体、Akt兔抗鼠多克隆抗体、p-Akt兔抗鼠多克隆抗体，4 ℃过夜孵育，洗膜，二抗常温孵育2 h，洗膜，涂抹发光试剂，曝光，扫描，用Image J软件测定各条带的灰度值并进行分析。
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采用方差分析及q检验。
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模型复制前，各组大鼠状态均正常，活动活跃，毛发色泽光亮，有精神。给药后，模型组大鼠活动程度显著降低，毛发枯燥，精神萎靡；对照组大鼠一般状态与模型复制前相比没有变化；观察组大鼠活动程度显著提高，毛发有色泽，精神状态良好。
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各组大鼠股骨头病理切片结果显示，对照组大鼠骨小梁的宽度没有减小，骨小梁没有断裂的情况，骨小梁周围有成骨细胞和少量的破骨细胞存在，骨髓腔内存在有多种细胞且丰富，没有坏死区域出现；模型组大鼠的骨小梁宽度减小，骨小梁有严重的狭窄或断裂情况，骨髓腔内的细胞种类和数量减少，有坏死区域存在；观察组大鼠各种病理切片结果得到有效的改善，显著好于模型组(见图 1)。
图 1 各组大鼠股骨头病理观察结果
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模型组大鼠的骨密度显著小于对照组和观察组(P < 0.01)；观察组与对照组大鼠的股骨头骨密度差异无统计学意义(P>0.05)(见表 1)。
分组 n 骨密度 F P MS组内 对照组 10 0.23±0.01 模型组 10 0.16±0.01** 143.33 < 0.01 0.000 观察组 10 0.22±0.01*## q检验：与对照组比较*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较##P < 0.01 表 1 各组大鼠股骨头骨密度比较(x±s；g/cm3)
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模型组大鼠血清中的VEGF和NO水平低于对照组(P < 0.01)；观察组大鼠血清中的VEGF和NO水平高于模型组(P < 0.01)；观察组和对照组大鼠血清中的VEGF和NO水平显著无统计学意义(P>0.05)(见表 2)。
分组 n VEGF/(pg/mL) NO/(μmol/L) 对照组 10 33.45±5.43 14.68±2.65 模型组 10 18.73±4.82** 8.32±1.09** 观察组 10 32.57±6.34## 13.86±2.48## F — 22.01 25.00 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 30.971 4.787 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与模型组比较##P < 0.01 表 2 各组大鼠血清中VEGF和NO水平比较(x±s)
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3组大鼠股骨头中Akt蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；模型组大鼠股骨头中p-Akt蛋白表达水平显著高于对照组(P < 0.01)；观察组大鼠股骨头中p-Akt蛋白表达水平显著高于模型组(P < 0.01)(见表 3和图 2)。
分组 n Akt p-Akt 对照组 10 0.41±0.06 0.50±0.04 模型组 10 0.42±0.05 0.66±0.07** 观察组 10 0.41±0.07 0.89±0.06**## F — 0.09 114.16 P — >0.05 < 0.01 MS组内 — 0.004 0.003 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与模型组比较##P < 0.01 表 3 各组大鼠股骨头中Akt和p-Akt蛋白表达水平比较(x±s)
图 2 各组大鼠股骨头中Akt和p-Akt蛋白表达水平
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股骨头坏死是骨科中十分常见的疾病。目前关于激素性股骨坏死的发病机制有多种学说，有脂质代谢紊乱学说、骨髓间充质干细胞成脂分学说、血管活性因子水平异常学说、血管内凝血学说、细胞凋亡学说等[6]。其中血管活性因子水平异常学说认为，激素性股骨头坏死的病人因为长期或大剂量的使用糖皮质激素，导致病人股骨头部位调控血管生成的活性细胞因子的水平出现异常，致使股骨头部位血管生成受阻，供血、供养能力降低，微循环降低，股骨头部位缺血缺氧，造成成骨细胞凋亡，引起股骨头坏死[7]。该学说得到了较多学者的认同。基于该学说，需要采取有效的手段，升高促坏死部位促血管生成的细胞活性因子的水平，促进血管再生，重建供血和血液循环，促进坏死部位新骨生成。葛根素是中药葛根中提取的有效活性成分，具有促进血管新生的药理作用，以及促进骨骼生长的作用。高培国等[8]研究发现葛根素过氧化氢损伤的血管内皮细胞具有保护作用，抑制细胞凋亡，抑制Caspase-3蛋白水平。邓华菲等[9]研究发现葛根素人脐静脉内皮细胞具有促进增殖的作用。王昌等[10]研究发现葛根素具有促进Wistar新生小鼠颅盖骨成骨细胞增殖和分化的作用；孙玉敏等[11]研究发现葛根素对老年骨质疏松病人的成骨细胞具有增殖和分化的作用。
目前对于激素性股骨头坏死研究的动物模型主要采用兔，但兔和人的基因相似程度低于鼠与人的基因相似程度，并且大鼠的股骨头具有和人相似的解剖结构，其股骨头的生物力学更接近于人[12]，因此，本研究中使用大鼠作为模型复制对象，采用国内外常用的大肠埃希菌内毒素结合甲泼尼龙来复制激素性股骨头坏死，从本研究的一般状态观察、病理切片、股骨头骨密度测量等结果看，模型复制成功。
病理切片可以准确地观察股骨头的病理状态和药物治疗效果，病理检查结果在临床是多种疾病诊断的黄金标准。激素性股骨头坏死病人的股骨头的形态结构会出现严重的改变，骨密度同时亦会显著降低[13]。股骨头的骨密度是临床上评价股骨头坏死及治疗效果的常用的方法。本研究中经过葛根素处理的激素性股骨头坏死模型大鼠股骨头的骨密度亦均得到有效的改善，这说明通过病理检查和骨密度评价发现，葛根素改善坏死的股骨头解剖学形态，对激素性股骨头坏死大鼠模型有显著的治疗作用。
PI3K/Akt信号转导通路在血管的新生过程中起着十分重要的作用。PI3K可以调节细胞新陈代谢、增殖和凋亡，是重要的信号传递信使，PI3K可以参与Akt依赖性信号通路的活化。Akt是PIP3的中心下游效应因子，PIP3能逐渐磷酸化AKT蛋白，活化后的Akt可磷酸化多种蛋白，磷酸化的Akt可以调节多种活性因子如VEGF和NO，从而发挥其介导参与细胞生长、发育和血管调节作用的生物学效应[14]。VEGF是目前已知促进血管新生作用最强的血管活性因子，在机体的生长发育以及创伤恢复的过程中促进血管内皮细胞增殖，促进血管新生的作用[15]。NO是L-精氨酸和氧在NO合酶的催化作用下合成的小分子活性气体，其具有调节血管内皮细胞增殖和骨髓内皮祖细胞增殖等作用促进血管新生[16]。另外有研究[17]表明NO参与VEGF促进血管内皮细胞增殖信号转导过程，促进血管新生。在本研究中，经过葛根素处理的激素性股骨头坏死大鼠血清中VEGF和NO水平增加，这说明葛根素对激素性股骨头坏死模型大鼠的治疗作用机制可能为通过升高血清中促进血管新生活性因子(如VEGF和NO)水平的升高，进而促进血管新生，重建供血和血液循环，促进坏死部位新骨生成。
葛根素对激素性股骨头坏死大鼠骨组织及PI3K/Akt信号转导通路的影响
Effect of puerarin on the bone tissue and PI3K/Akt signal transduction pathway in rats with femoral head osteonecrosis induced by hormone
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摘要:
目的探究葛根素对激素性股骨头坏死大鼠骨组织及PI3K/Akt信号转导通路的影响。 方法将大鼠分为对照组、模型组和观察组，用臀肌注射甲泼尼龙琥珀酸钠方法复制激素性股骨头坏死大鼠模型。模型复制后观察组大鼠腹腔注射葛根素注射液。比较各组大鼠一般状态、股骨头病理切片和股骨头骨密度、血清血管内皮生长因子（VEGF）和一氧化氮（NO）水平、股骨头中Akt和p-Akt蛋白表达水平。 结果观察组大鼠给药后活动程度显著提高，毛发有色泽，精神状态良好。模型组大鼠血清中的VEGF和NO水平低于对照组（P < 0.01）；观察组大鼠血清中的VEGF和NO水平高于模型组（P < 0.01）。3组大鼠股骨头中Akt蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）；模型组大鼠股骨头中p-Akt蛋白表达水平显著高于对照组（P < 0.01）；观察组大鼠股骨头中p-Akt蛋白表达水平显著高于模型组（P < 0.01）。 结论葛根素对激素性股骨头坏死模型大鼠有治疗作用，其作用机制可能为升高血清中促进血管新生活性因子水平的升高，进而促进血管新生，重建供血和血液循环，促进坏死部位新骨生成。 Abstract:ObjectiveTo explore the effects of puerarin on the bone tissue and PI3K/Akt signal transduction pathway in rats with femoral head osteonecrosis induced by hormone. MethodsThe rats were divided into the control group, model group and observation group.The model of femoral head osteonecrosis induced by hormone was established by intramuscular injection of methylprednisolone sodium succinate.The observation group was established by intraperitoneal injection with puerarin in model rat.The general state, pathological change and bone mineral density of femoral head, serum levels of vascular endothelial growth factor(VEGF) and nitric oxide(NO), and levels of Akt and p-Akt protein in femoral head among three groups were compared. ResultsThe activity of the rats in observation group increased significantly after administration, and the hair color and spirit were good.The serum levels of VEGF and NO in model group were less than those in control group and observation group(P < 0.01).The differences of the expression levels of Akt protein in femoral head among three groups were not statistically significant(P>0.05), and the expression level of p-Akt protein in model group was significantly higher and lower than that in control group and observation group, respectively(P < 0.01). ConclusionsPuerarin plays a therapeutic effect on the femoral head necrosis, and the mechanism of which may be related to increase the level of angiogenic activity factor, form the angiogenesis, reconstruct the blood supply and circulation, and promote the formation of new bone at the necrotic site. -
Key words:
- puerarin /
- femoral head osteonecrosis /
- hormone-induced /
- PI3K/Akt /
- vascular endothelial growth factor /
- nitric oxide
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表 1 各组大鼠股骨头骨密度比较(x±s；g/cm3)
分组 n 骨密度 F P MS组内 对照组 10 0.23±0.01 模型组 10 0.16±0.01** 143.33 < 0.01 0.000 观察组 10 0.22±0.01*## q检验：与对照组比较*P < 0.05，**P < 0.01；与模型组比较##P < 0.01 
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表 2 各组大鼠血清中VEGF和NO水平比较(x±s)
分组 n VEGF/(pg/mL) NO/(μmol/L) 对照组 10 33.45±5.43 14.68±2.65 模型组 10 18.73±4.82** 8.32±1.09** 观察组 10 32.57±6.34## 13.86±2.48## F — 22.01 25.00 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 30.971 4.787 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与模型组比较##P < 0.01
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表 3 各组大鼠股骨头中Akt和p-Akt蛋白表达水平比较(x±s)
分组 n Akt p-Akt 对照组 10 0.41±0.06 0.50±0.04 模型组 10 0.42±0.05 0.66±0.07** 观察组 10 0.41±0.07 0.89±0.06**## F — 0.09 114.16 P — >0.05 < 0.01 MS组内 — 0.004 0.003 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与模型组比较##P < 0.01
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