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黑素瘤是一种潜在的可治愈的疾病，但是约有20%的人疾病进展超过了手术可清除的阶段，导致需要后续的综合治疗[1]。目前恶性黑素瘤的临床常用治疗手段有手术治疗、放射治疗、化学治疗、免疫治疗以及靶向治疗等，这些常规治疗方法对一部分病人是非常有效的，但其有限的适应证、禁忌证以及伴随的不良反应限制了其临床使用，且临床上经常观察到一些病人对以上常规治疗的敏感性较差[1]。因此, 如何提高恶性黑素瘤的总体疗效，研究新的低毒、高效的治疗方式，仍然是临床及基础研究者们长期研究的课题。
肿瘤电刺激疗法是将电工技术应用于肿瘤治疗的一种创新性物理治疗手段。参数不同、性质各异的各类电刺激已被广泛用于肿瘤治疗, 并且取得了良好的效果[2-4]。电刺激疗法在治疗皮肤肿瘤领域也有所应用，以其非热生物效应在肿瘤治疗中展现出了良好的发展前景[5]。姜黄素及其类似物被认为是治疗黑素瘤的最有开发潜力的药物之一。姜黄素的抗癌作用是其抗血管生成、促凋亡和免疫调节特性的结果。在分子和细胞水平，姜黄素可以钝化上皮-间充质转变并影响涉及黑素瘤起始和进展的许多重要的靶标(例如Bcl2、MAPKs、p21和一些microRNA)。然而，姜黄素具有口服生物利用度低、代谢时间短和容易被机体清除等特点，限制了其治疗肿瘤有效性的发挥[6]。新的类似物和新的给药途径是目前姜黄素治疗黑素瘤重点关注的方面。本实验就脉冲电刺激和姜黄素对黑素瘤的影响作一探讨。
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复苏B16-F10细胞株，并以1×105/cm2的密度接种于25 cm2的培养瓶中，加入新鲜的含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的RPMI 1640完全培养基，置于37 ℃、含50 mL/L CO2的恒温培养箱中自然生长。每天进行1次换液，每2~3 d进行1次传代。
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取对数期贴壁生长B16-F10黑素瘤细胞, 经0.25%胰蛋白酶消化后制成悬浮液，采用血细胞计数板经台盼蓝染色法统计活细胞数量，再予以1 000 r/min离心5 min后去上清液，磷酸缓冲液调整细胞密度为5×106/mL。于纯系、清洁级、6~8周、雄性C57/BL6小鼠足背部皮下接种小鼠黑素瘤细胞50 μL。以各组肿瘤体积平均值(cm3)为纵坐标，以时间(d)为横坐标，绘制各组小鼠足体积(接种侧)增长曲线。
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小鼠经脱臼处死后取出肿瘤组织，放入4%多聚甲醛中固定24 h，将肿瘤组织切成1 cm3大小的组织块继续固定48 h。经40%蔗糖脱水后，冰冻切片机上切成10 μm的切片备用。HE染色步骤按照试剂盒(碧云天生物技术研究所)说明书进行。
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将同期建模的移植瘤模型小鼠40只随机均分为对照组、电刺激组、姜黄素组、联合组，每组各10只。在刺激前各组小鼠均依据小鼠不同的体质量，按0.1 mL/10 g使用戊巴比妥钠溶液腹腔内注射麻醉。电刺激组设定电脉冲脉宽5 ms，频率20 Hz，刺激电压20 V/cm，连续接受7 d电刺激(30 min/d)；对照组电刺激频率设为0Hz。姜黄素组将姜黄素干粉按100 mg/100 μL制成液体制剂，0.22 μm滤膜除菌，-20 ℃保存，有效期2周，每只小鼠每次给予0.1 mL。联合组将电刺激与姜黄素治疗结合，操作方法为将注射器针头垂直从正上方插入瘤体，保留部分在瘤体外部，并接上电刺激器刺激电极的正极，电刺激器刺激电极的负极放置在瘤体基底部(接近足背的瘤体)；操作时，注射姜黄素和脉冲电刺激交替进行，先注射0.01~0.02mL姜黄素后进行电刺激，然后再注射部分姜黄素，再进行电刺激，尽可能保证不同层面均有给药。
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将小鼠足放入足体积测量器，每日观察，记录小鼠皮下肿瘤生长情况。如观察到小鼠足背部皮下生长出最短径为0.5~0.8 cm的蓝黑色结节，即小鼠移植瘤模型建立成功。
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TUNEL凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，试验步骤按照说明书进行。凋亡细胞的数量通过计数每张切片3个视野(20 μm×20 μm)，每个瘤体选取6张切片，共计数4个来自不同小鼠的瘤体。
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采用方差分析和q检验。
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B16-F10细胞接种小鼠足背部皮下后，14 d左右开始有肉眼可见的肿瘤的生长，随后足体积随肿瘤的生长而增加(见图 1)。皮下瘤稳定生长，接种局部无红肿(见图 2)。瘤细胞接种后20 d时，足背黑素瘤HE染色，表皮下有大量的黑素瘤细胞的生长，真皮层和皮下组织不能辨别(见图 3)。
图 1 足体积变化
图 2 瘤细胞接种20d
图 3 HE染色结果
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除对照组和姜黄素组比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其余组间差异均有统计学意义(P < 0.05)，且联合组肿瘤体积增长速度最小，其次电刺激组, 对照组与姜黄素组肿瘤体积增长速度相当(见表 1)。
分组 n 肿瘤体积增长速度/cm3 F P MS组内 对照组 10 2.12±0.14* 41.66 < 0.01 0.033 联合组 10 1.33±0.19 电刺激组 10 1.75 ±0.21*△ 姜黄素组 10 2.11±0.18*▲ q检验：与联合组比较*P < 0.05；与对照组比较△P < 0.05；与电刺激组比较▲P < 0.05 表 1 肿瘤体积增长速度比较(x±s)
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TUNEL染色切片光镜下观察，可见对照组黑素瘤细胞凋亡细胞较少，散在分布；电刺激组凋亡细胞较对照组增多；联合组瘤实质细胞密集度降低，部分存在核固缩、碎裂的形态改变，可见大量凋亡细胞(见图 4)。不同治疗组凋亡细胞数量差异有统计学意义(P < 0.01)(见表 2)。
图 4 不同治疗组细胞凋亡的情况
分组 凋亡细胞数 F P MS组内 对照组 10.50±2.65 110.25 < 0.01 260.46 电刺激组 59.25±11.79* 联合组 189.50 ±29.81*△ 姜黄素组 9.75±2.75 q检验：与对照组比较*P < 0.05；与电刺激组比较△P < 0.05 表 2 不同处理组细胞凋亡数量比较(ni=4；x±s)
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黑素瘤在早期阶段可以通过手术切除，但大多数情况下会发展到侵入性阶段，且多药耐药性的发展导致黑素瘤对常规的治疗方法无明显反应。因此，需要新的治疗方法来克服传统疗法的局限性。本研究改良了原有的小鼠皮肤黑素瘤模型，建立了小鼠足背皮肤黑素瘤模型，并利用脉冲电刺激联合姜黄素对小鼠皮肤黑素瘤进行治疗，取得了较好的效果。
常规的皮肤黑素瘤模型是将瘤细胞注射到小鼠背部皮下[7]，肉眼不能直观观察到瘤体的形态，且瘤体体积测量需要将动物处死取出瘤体进行观察比较，不利于动态长时间地观察瘤体的生长，也不符合节约动物的原则。另有研究[8]将黑素瘤细胞注射到足底，利于疼痛的测量，比如机械痛敏和热痛敏的测量。黑素瘤易转移到腿部，可能是由于足底皮肤皮下组织疏松，血管、淋巴丰富等原因。为了克服以上缺点，我们尝试将瘤细胞接种到小鼠足背皮下，结果显示瘤体可顺利生长，并且因为足背毛发较少可进行直观的观察，利用常见的足体积测量方法，可动态长时间地观察瘤体自然的生长情况，以及各种干预措施对于瘤体生长的影响，不需要处死动物而取出瘤体。
研究[6]证明脉冲电刺激和姜黄素各自可以抑制黑素瘤的生长，并且诱导肿瘤细胞凋亡。姜黄素是一种具有生物活性的多酚类天然化合物，是姜黄中的有效成分，具有多种药理作用。姜黄素的抗肿瘤作用具有多效性和途径多样性，姜黄素可以抑制线粒体途径和细胞核因子NF-κB活化，上调Fas基因表达，激活Caspase-3蛋白酶；同时可使抗凋亡蛋白Mcl-1下调，促凋亡蛋白Bax、Bak、γ-H2AX蛋白上调，从而抑制黑素瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。
脉冲电刺激使肿瘤细胞的细胞膜发生不可逆性电击穿，同时激发机体的抗血管和淋巴管效应、免疫效应，破坏肿瘤的生存条件，从而有效杀伤肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡，使瘤组织缩小甚至消失[9]。电刺激疗法另一优点是电刺激能够促进药物的抗肿瘤作用，通过影响细胞膜的电场分布来改变细胞膜的通透性和流动性，从而使细胞膜对药物的通透性增加，药物则可以更加容易地通过细胞膜进入到细胞内部或到达肿瘤的深处，从而提高药物抗肿瘤的效果和速率[10]，所以电刺激联合药物疗法是一种有效的治疗皮肤肿瘤的手段。本文结果也显示单独局部给予姜黄素没有效果，而结合脉冲电刺激后，对肿瘤的抑制效果优于单纯的给药治疗。
脉冲电刺激联合姜黄素对小鼠足背皮肤黑素瘤的影响
Effect of pulsed electric stimulation combined with curcumin on melanoma of foot back skin in mice
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摘要:
目的观察脉冲电刺激联合姜黄素对小鼠足背皮肤黑素瘤的影响。 方法将B16-F10小鼠黑素瘤细胞注射到C57/BL6小鼠足背皮下，制备足背黑素瘤模型；脉冲电刺激、姜黄素独立或联合处理黑素瘤，并观察其对肿瘤大小生长情况及对肿瘤细胞凋亡的影响。 结果脉冲电刺激独立或联合姜黄素具有抑制黑素瘤瘤体增大的作用（P < 0.01），联合疗法更加有效（P < 0.05），且联合治疗组肿瘤细胞凋亡的数量增加（P < 0.05）。 结论足背黑素瘤模型便于观察肿瘤形态和测量体积，具有一定优势；脉冲电刺激联合姜黄素可以通过引起细胞凋亡而抑制黑素瘤的生长，是一种有效的治疗黑素瘤的手段。 Abstract:Objective To observe the effects of pulsed electric stimulation combined with curcumin on melanoma of foot back skin in mice. Methods The B16-F10 mouse melanoma cells were subcutaneously injected into the C57/BL6 mouse dorsal foot to establish the dorsal melanoma model.The melanoma was treated with pulsed electric stimulation combined with curcumin, and the tumor size, growth and apoptosis were observed. Results The pulsed electric stimulation or combined with curcumin could inhibit the tumor growth of melanoma(P < 0.01), and the combined therapy was more effective(P < 0.05).The number of apoptotic cells increased after combined therapy(P < 0.05). Conclusions The model of dorsal foot melanoma is easy to observe the morphology and measure the volume of the tumor.The pulsed electric stimulation combined with curcumin can inhibit the growth of melanoma by inducing apoptosis, which is an effective treatment method for melanoma. -
Key words:
- melanoma /
- pulsed electric stimulation /
- curcumin /
- apoptosis
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表 1 肿瘤体积增长速度比较(x±s)
分组 n 肿瘤体积增长速度/cm3 F P MS组内 对照组 10 2.12±0.14* 41.66 < 0.01 0.033 联合组 10 1.33±0.19 电刺激组 10 1.75 ±0.21*△ 姜黄素组 10 2.11±0.18*▲ q检验：与联合组比较*P < 0.05；与对照组比较△P < 0.05；与电刺激组比较▲P < 0.05 
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表 2 不同处理组细胞凋亡数量比较(ni=4；x±s)
分组 凋亡细胞数 F P MS组内 对照组 10.50±2.65 110.25 < 0.01 260.46 电刺激组 59.25±11.79* 联合组 189.50 ±29.81*△ 姜黄素组 9.75±2.75 q检验：与对照组比较*P < 0.05；与电刺激组比较△P < 0.05
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图(4)表(2)
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