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不动杆菌属(Acinetobacter spp.)细菌广泛存在于自然界的条件致病菌[1]，目前已正式命名62个菌种(http://www.bacterio.net/acinetobacter.html)。依据细菌生化特征的商品化全自动菌种鉴定系统是临床上鉴定不动杆菌菌种的常用方法。通常醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、Acinetobacter nosocomialis和Acinetobacter pittii通过鉴定技术很难区分，因而合称为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体(ACB复合体)。后来陆续有其他不动杆菌也被纳入其中，包括Acinetobacter seifertii(曾称为近13TU型)、Acinetobacter lactucae(曾称为NB14型)以及不动杆菌基因型介于1~3之间的菌种等。因此，该复合物内菌种间遗传上密切相关、表型上难以区分[2]。
虽然ACB复合体各成员菌种表型相近，但流行病学特征却有很大不同。鲍曼不动杆菌是医院与社区获得性感染的最常见病原体之一；而A.pittii和A.nosocomialis、A.calcoaceticus等主要从土壤、水中分离出来，其是否导致临床感染仍不清楚；A. seifertii、A.lactucae和不动杆菌基因型介于1~3之间的菌种也有从临床标本中分离出[3-5]。由于ACB复合体成员异质性明显，不同的临床意义也容易引起临床误导，因此，准确鉴定ACB复合体各菌种具有科研和临床价值[6]。
除了以生化反应为基础的商品化鉴定系统，还有以下鉴定策略，如：仅存在于鲍曼不动杆菌的碳青霉烯酶基因blaOXA-51-like，用于对鲍曼不动杆菌的鉴定[7-8]；16S rRNA基因高度保守、普遍存在、高稳定性等特性，其序列具有的细菌属、种的特征，使得其一度在系统发育学研究中成为细菌鉴定和分类的“金标准”[9]；gyrB基因编码DNA回旋酶的B亚单位蛋白(GyrB)，是惟一能诱导DNA负超螺旋的拓扑异构酶。因细菌GyrB具有种属特异性[10-11]，gyrB基因可作为ACB复合体的基因鉴定的基因序列[12-14]。本文拟采用以上不同菌种鉴定方法对20株ACB复合体进行菌种鉴定，以期确定最有效的菌种鉴定方法。
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收集蚌埠医学院第一附属医院自2012年2月至2013年4月自痰液、血液、手术及伤口分泌物、尿液等各种标本中无重复分离的ACB复合体20株。
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金黄色葡萄球菌ATCC29213、嗜麦芽窄食单胞菌ATCC17666、大肠埃希菌ATCC25933、鲍曼不动杆菌ATCC19606，由我院微生物实验室提供。醋酸钙不动杆菌ATCC23055，购于上海复祥生物科技有限公司。
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VITEK 2 Compact微生物鉴定/药敏系统、VITKE比浊仪(法国生物梅里埃公司)；梯度PCR仪(TGradient型：Biometra公司)；GIS凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司)；SmartSpecTM紫外分光光度计(Bio RAD)；PCR引物(见表 1)、DNA Marker、5×TBE(上海生工生物工程有限公司)；PCR扩增试剂盒(天根生化科技有限公司)；琼脂糖、EB(加拿大Ferments公司)。
目的基因 引物序列(5′-3′) 退火温度/℃ 产物大小/bp 备注 OXA-51 F:TAA TGC TTT GAT CGG CCT TG 53.0 353 [15] R:TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG 菌种特异性 gyrB基因* A.pittii D16:GAT AAC AGC TAT AAA GTT TCA GGT GGT 51.0 194 [16] D8:CAA AAA CGT ACA GTT GTA CCA CTG C A.calcoaceticus D14:GAC AAC AGT TAT AAG GTT TCA GGT G 47.2 428 [16] D19:CCG CTA TCT GTA TCC GCA GT A.baumanni Sp2F:GTT CCT GAT CCG AAA TTC TCG 54.0 490 [16] Sp4R:AAC GGA GCT TGT CAG GGT TA A.baumannii和 Sp4F:CAC GCC GTA AGA GTG CAT TA 55.0 294 [16] A.nosocomialis Sp4R:AAC GGA GCT TGT CAG GGT TA 16S rRNA F:AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 54.9 1400 [12] R:GGT TAC CTT GTT ACG ACT T *注：菌种特异性gyrB基因：引物Sp2F/Sp4R扩增产物为A.baumannii所特有；引物Sp4F/sp4R扩增产物仅在A.baumannii及A.nosocomialis为阳性；引物D14/D19特异性扩增A.calcoacelicus的gyrB基因；引物D16/D8特异性扩增GS 3的gyrB基因。 表 1 引物合成序列表
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取-80 ℃冻存菌株，以三分区法血平板接种，CO2培养箱培养12~24 h。挑选单个菌落，0.45%无菌氯化钠溶液调配1.0麦氏管浊度(Mcfarland)菌液。以VITEK 2 Compact微生物鉴定/药敏系统进行菌种鉴定。
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刮取新鲜菌落于150 μL无菌双蒸水，混匀后煮沸10 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，留取含有粗提取细菌总DNA的上清液，SmartSpecTM紫外分光光度计检测并调节提取DNA的吸光度A260/280比值为1.8~2.0。
PCR Master MIX(2×)12.5 μL、上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL, 模板DNA 1.0 μL, 无核酸酶水8.5 μL构成反应体系，94 ℃预变性3 min、94 ℃变性30 s、退火30 s(OXA-51 53 ℃、GS3 gyrB 51 ℃、A.calcoaceticus gyrB 47.2 ℃，A.baumanni gyrB 54 ℃，A.baumannii和GS13TU gyrB 55 ℃、16S rRNA 54.9 ℃)、72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min。
PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳，GIS凝胶成像系统读取结果，拍摄并记录结果。PCR扩增的16S rDNA产物经琼脂糖凝胶电泳初步检测后，由上海生工生物工程技术公司进行纯化和序列测定。所得片段序列运用在线序列比对BLASTn与GenBank上的基因序列进行比对分析。
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OXA-51为Ab的标志基因，以Ab标准株做参照，在20株ACB复合体中，16株阳性表达(即16株Ab)，其余种属未能确定。其检测结果见图 1。20株ACB复合体经16S rRNA扩增，获得特异性条带(见图 2)。扩增产物经测序，在NCBI数据库中对测序结果进行BLAST比对分析，其结果为Ab 16株，A.calcoacelicus 3株，及1株不明确基因型不动杆菌。20株ACB复合体中PCR扩增Sp4F/Sp4R阳性率为85%，Sp2F/Sp4R阳性率为80%，即16株为Abs；1株为GS 13TU(16S rRNA基因分析未确定基因型的菌株)(见图 3~5)；3株表达D14/D19，即为A.calcoacelicus(见图 6)。D16/D8未检测出阳性菌株。
图 1 OXA-51扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
图 2 16SrRNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
图 3 A.baumannii gyrB基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳
图 4 A.nosocomialis gyrB基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
图 5 A.baumannii、A.nosocomialis gyrB基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
图 6 A.calcoacelicus gyrB基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
Sp2F/Sp4R、Sp4F/Sp4R均以鲍曼不动杆菌标准株做参照；D14/D19以醋酸钙不动杆菌标准株做参照。
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不动杆菌属革兰染色阴性、非发酵、专性需氧、无动力、氧化酶阴性球杆菌的生化特性，全自动化分析仪器很容易鉴定到属。在菌株为A.baumannii时，根据表型差别鉴定菌种的自动化系统具有一定优势，但是A.nosocomialis、A.pittii和A.calcoacelicus的生化特性与A.baumannii很相似，当菌株为三者中的任意一种时全自动化分析仪器只能将其鉴定为ACB复合体[17]。A.baumannii在医院内爆发是世界范围的的一个主要问题[18]，ACB复合体的其他菌种很少涉及流行，因此对其研究较少[11]；而散发的ACB复合体并不被认为是一个严重的公共卫生问题，因此对它们的了解较少[19]。
blaOXA-51作为鉴定A.baumannii的的基因标志物，本研究20株ACB复合体中，检测结果示16株阳性表达OXA-51，阳性率为80%。即初步判断20株ACB中16株为A.baumannii。但是OXA-51仅存在于A.baumannii中，只可作为鉴定A.baumannii的标志物，无法鉴定其他菌种。
本研究20株ACB复合体中A.baumannii 16株，A.calcoacelicus3株，及1株不明确基因型的不动杆菌。16S rRNA基因序列曾作为细菌鉴定和分类“金标准”，但是由于16S rRNA基因缺乏足够的多态性，其无法用以鉴定所有的不动杆菌[13]，本实验支持此观点。
以上研究结果显示，全自动细菌鉴定及药敏分析系统在菌种鉴定方面虽然存在便捷、快速、鉴定范围广等优点，但在菌种鉴定准确度方面仍存在明显的缺陷，对于表型相似的菌种(如ACB复合体的各菌种)无法达到准确鉴定的效果，需辅以分子生物学基因分型方法。OXA-51在对A.baumannii的鉴定上准确度达100%，并未发现其他基因型不动杆菌表达OXA-51；近年不断有研究示gyrB基因在亲缘关系较近的细菌的鉴定上优于16S rRNA基因，本次试验结果与上述结论相一致，并且由于gyrB基因分析方法简便、可靠性高，可用于微生物实验室作为ACB复合体各菌种快速鉴定的方法。
目前鉴定技术发展如质谱、NGS等，虽然代表了鉴定技术的方向，但存在设备要求高、费用昂贵、需要更多探索和完善，本文涉及的相对传统的鉴定方法技术成熟, 容易实施, 临床关联性好。ACB复合体异质性高，其流行病学及临床致病性特点，从科研及临床角度需要更清晰鉴别。本研究中组合其中1-2种鉴定方法可以实现准确鉴定。gyrB基因在高度亲缘菌种鉴定中优于其他鉴定方法。
对一组醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体细菌的基因型鉴定
Study on genotyping in clinical Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex
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摘要:
目的 探讨鉴定醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体各菌种的有效方法。 方法 运用全自动细菌鉴定系统联合分子生物学方法，经聚合酶链式反应（PCR）扩增鲍曼不动杆菌特异表达的D类碳青霉烯酶基因OXA-51、16S rRNA及醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体各菌种特异表达的gyrB基因，以准确鉴定醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体各菌种种属。 结果 20株醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体经全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定均与原始种属相一致；经分子生物学方法鉴定结果为Acinetobacter baumannii 16株，Acinetobacter calcoaceticus 3株，Acinetobacter nosocomialis 1株。 结论 全自动菌种鉴定系统辅以分子生物学基因分型方法可较为准确地鉴定醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体各个菌种。gyrB基因作为到种鉴定标志物对于高度亲缘性菌种的鉴定价值更大。 -
关键词:
- 醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体 /
- 基因分型鉴定 /
- OXA-51基因 /
- gyrB基因 /
- 16S rRNA基因
Abstract:Objective To investigate the effective methods for identification of all the genotypes of Acinetobacter speciese, including Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii (ACB) complex. Methods For all ACB complex strains, bacterial identification was carried out using automatic bacteria identification system.Additionally, for more accurate discrimination between ACB complex species, Molecular Biology methods has been combined? with, all ACB complex strains were further subjected to polymerase chain reaction (PCR) amplification to detect the A.baumannii-specific expression of the class D carbapenemase gene OXA-51, 16S rRNA gene and ACB complex gyrB genes, which specifically expressed in each species. Results Totally all 20 ACB complex strains were identified as ACB complex by automatic bacteria identification system; which were identified by the method in Molecular Biology by PCR, of them 3 A.calcoaceticus strains and 1 A.nosocomialis strain were detected in ACB complex, together with 16 Acinetobacter baumannii strains. Conclusions The combination of automatic bacteria identification system and Molecular Biology methods can provide more accurate genospecies identification in ACB complex.gyrB gene might be a more effective marker in the identification of highly phylogenetic related species. -
表 1 引物合成序列表
目的基因 引物序列(5′-3′) 退火温度/℃ 产物大小/bp 备注 OXA-51 F:TAA TGC TTT GAT CGG CCT TG 53.0 353 [15] R:TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG 菌种特异性 gyrB基因* A.pittii D16:GAT AAC AGC TAT AAA GTT TCA GGT GGT 51.0 194 [16] D8:CAA AAA CGT ACA GTT GTA CCA CTG C A.calcoaceticus D14:GAC AAC AGT TAT AAG GTT TCA GGT G 47.2 428 [16] D19:CCG CTA TCT GTA TCC GCA GT A.baumanni Sp2F:GTT CCT GAT CCG AAA TTC TCG 54.0 490 [16] Sp4R:AAC GGA GCT TGT CAG GGT TA A.baumannii和 Sp4F:CAC GCC GTA AGA GTG CAT TA 55.0 294 [16] A.nosocomialis Sp4R:AAC GGA GCT TGT CAG GGT TA 16S rRNA F:AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 54.9 1400 [12] R:GGT TAC CTT GTT ACG ACT T *注：菌种特异性gyrB基因：引物Sp2F/Sp4R扩增产物为A.baumannii所特有；引物Sp4F/sp4R扩增产物仅在A.baumannii及A.nosocomialis为阳性；引物D14/D19特异性扩增A.calcoacelicus的gyrB基因；引物D16/D8特异性扩增GS 3的gyrB基因。 
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图(6)表(1)
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