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支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)常见于早产儿，属于慢性呼吸系统疾病。有数据统计，BPD在胎龄 < 28周的早产儿中的发病率超过50%，重度BPD患儿的病死率达到64%，存活的患儿神经系统发育障碍的发生率是正常新生儿的2~3倍，是一种严重影响早产儿生命健康的疾病[1-3]。至今BPD尚无特效治疗方法，虽然糖皮质激素对BPD的治疗有一定的效果，但是激素存在抑制患儿神经系统发育等不良反应，目前在临床上的应用存在较大争议。孟鲁司特钠(montelukast，MK)是一种半胱氨酰白三烯受体拮抗剂，属于非激素类抗炎药，对多种疾病具有抗炎、调节免疫的防护作用，且不良反应较少。目前，有研究[4-5]显示出MK治疗BPD的有效性和安全性，但其抑制BPD发展的确切机制尚不清楚。因此，本研究旨在探讨MK对BPD大鼠免疫因子的影响以及细胞因子水平的调节作用。
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随机选择SPF级健康SD大鼠60只，孕3周左右，体质量200~250 g，常规喂食、供水下常规饲养, 温度22~25 ℃，湿度50%~60%。所有实验动物购自重庆医科大学实验动物中心，并于SPF级实验动物中心完成饲养和实验操作。
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100%医用氧气，购自重庆朝阳气体有限公司。CY100型数字测氧仪，购自杭州立华仪器有限公司。有机玻璃氧箱，购自深圳市诚美有机玻璃制品有限公司。电热恒温水箱，购自天津市泰斯特仪器有限公司。细胞培养箱，购自美国Millipore公司。BMJ-B型包埋机，购自常州市中威电子仪器有限公司。
DMSO、0.25%胰酶购自Sigma公司。DMEM/F12培养基，购自美国Gibco公司。BCA蛋白检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。孟鲁司特钠颗粒(顺尔宁，杭州默沙东制药有限公司，国药准字J20140167，0.5 g:4 mg×7袋)。
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将60只孕3周左右自然分娩SD母鼠与新生大鼠分为3组，每组20只，分别为：MK处理BPD模型组(MK组)、BPD模型组(BPD组)、常氧饲养对照组(对照组)。MK组、BPD组饲养在95%的高氧环境中，其中MK组给予MK(腹腔注射，10 mg·kg-1·d-1)处理，BPD组给予等剂量0.9%氯化钠溶液处理。对照组亦给予等剂量0.9%氯化钠溶液处理，饲养在常氧环境中。
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实验15 d后，将大鼠用2%戊巴比妥钠0.3 mL/100 g腹腔内麻醉后，仰卧位置于密闭体描箱内，其呼吸借助一端与插管连接，另一端与体描箱外动物呼吸机的皮管连接。动物呼吸时一个传感器受动物气道内压力的变化，另一个传感器感受体描箱内压力的变化并通过放大器转化为电信号，经电脑处理后计算出所需肺功能的各项指标：吸气阻力(Ri)、呼气阻力(Re)、肺顺应性(Cl)、最大通气量(MVV)、每秒钟呼出容积占用力肺活量之比(FEV1/FVC%)[6]。
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流式细胞术法：肺损伤后不同时间点取肺组织置冰冷的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)中。采用200目尼龙网过滤法获取单细胞悬液，采用OptiPrep密度梯度离心法分离免疫细胞, 用含10%FBS的RMPI1640培养液重悬1×106/mL。M1、M2型检测采用CD68、CD86、CD163三色表面染色，采用CD68/SSC设门，确定巨噬细胞群体，进一步进行巨噬细胞亚群分析[7]。CD68+ CD86+CD163-为M1型巨噬细胞，CD68+CD86-CD163+为M2型巨噬细胞。采用CD3、CD8进行表面标记，IFN-γ/IL-4进行胞内染色分别检测Th1、Th2亚群。采用CD3/SSC设门，确定T淋巴细胞群体，进一步进行Th细胞亚群分析。CD3+CD8-、IFN-γ+细胞群体为Th1细胞；CD3+CD8-IL-4+细胞群体为Th2细胞。所有流式细胞术样本采用特异性抗体标记的同时均采用相应的同型对照抗体，来排除非特异染色, 用以设定阴性标准。
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取大鼠肺部组织，检测肺损伤局部干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-6等促炎因子和IL-4、IL-10、IL-13等抗炎因子在肺损伤部位的水平[8]。
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采用方差分析和q检验。
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大鼠Ri、Re水平BPD组高于MK组，MK组高于对照组(P＜0.05)，Cl、MVV、FEV1/FVC水平BPD组低于MK组，MK组低于对照组(P＜0.05)(见表 1)。
分组 n Ri/(cmH2O·L-1·S-1) Re/(cmH2O·L-1·S-1) Cl/(mL/ cmH2O) MVV/mL (FEV1/FVC)/% MK组 20 4.52±0.97 3.44±0.82 73.81±25.26 8.29±2.37 55.27±15.30 BPD组 20 7.21±1.36* 6.41±0.96* 54.22±13.19* 4.53±1.26* 42.51±12.99* 对照组 20 3.55±0.84*△ 2.94±0.77*△ 80.77±23.50*△ 9.77±2.52*△ 67.28±16.33*△ F — 61.71 96.54 8.33 32.30 13.75 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 1.165 18.176 454.765 4.518 223.166 q检验：与MK组比较*P＜0.05；与BPD组比较△P＜0.05 表 1 3组大鼠肺功能比较(x±s)
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大鼠Th1、Th1/ Th2水平BPD组高于MK组，MK组高于对照组(P＜0.05)，Th2水平BPD组低于MK组，MK组低于对照组(P＜0.05)(见表 2)。
分组 n Th1/% Th2/% Th1/ Th2 MK组 20 7.21±2.94 6.31±0.94 1.52±0.86 BPD组 20 12.57±4.06* 3.41±1.06* 4.33±2.70* 对照组 20 5.62±2.33*△ 7.51±1.49*△ 0.93±0.27*△ F — 26.04 63.07 24.44 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 10.185 1.409 2.701 q检验：与MK组比较*P＜0.05；与BPD组比较△P＜0.05 表 2 3组大鼠Th1、Th2细胞水平比较(x±s)
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大鼠IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6水平BPD组高于MK组，MK组高于对照组(P＜0.05)(见表 3)。
分组 n IFN-γ/(μg/L) TNF-α/(ng/mL) IL-1β/(pg/mL) IL-6/(pg/mL) MK组 20 52.19±7.26 3.18±1.07 137.42±9.55 184.31±27.68 BPD组 20 64.22±6.33* 7.44±2.46* 177.86±12.31* 238.69±43.15* 对照组 20 44.18±8.39*△ 1.31±0.29*△ 91.42±4.92*△ 137.42±27.66*△ F — 37.41 81.34 420.43 45.42 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 54.390 2.427 88.982 1131.060 q检验：与MK组比较*P＜0.05；与BPD组比较△P＜0.05 表 3 3组大鼠局部肺组织促炎因子相关细胞因子水平比较(x±s)
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大鼠IL-4、IL-10、IL-13水平BPD组高于MK组，MK组高于对照组(P＜0.05)(见表 4)。
分组 n IL-4/(pg/mL) IL-10/(ng/mL) IL-13/(ng/L) MK组 20 94.22±16.37 52.16±9.42 42.33±9.16 BPD组 20 115.67±15.23* 77.86±10.49* 63.47±12.29* 对照组 20 72.15±9.88*△ 38.44±5.29*△ 14.31±5.22*△ F — 47.55 105.96 139.16 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 199.181 75.587 87.399 q检验：与MK组比较*P＜0.05；与BPD组比较△P＜0.05 表 4 3组大鼠局部肺组织抗炎因子相关细胞因子水平比较(x±s)
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BPD是一种常见于早产儿的慢性肺部疾病[9]，临床上早产儿日龄超过28 d后仍然需要氧疗维持生命，且可能已发生肺部感染、肺动脉高压等并发症。大部分BPD患儿是在早产儿呼吸窘迫综合征治疗过程中发生。BPD严重危害早产儿的健康，重度BPD患儿超过一半会病死，存活的患儿会出现极高的再入院率和神经系统发育障碍[10]。有研究[11-12]认为，胎儿炎症反应综合征是导致BPD发生的重要原因，多种炎性细胞和炎性细胞因子在发病过程中起到重要的作用。这些异常的炎性因子会阻碍肺支气管发育的正常进程，延迟了肺泡微血管成熟时间，导致肺泡出现形成障碍。炎性细胞因子与抗炎性因子比例的失衡与BPD的发病密切相关。
BPD的治疗尚无确切方案，目前临床以糖皮质激素治疗为主。糖皮质激素虽然对BPD的治疗有一定的作用，但是尚未制定统一的治疗方案，给药的途径和剂量仍然处于探索的过程，而且激素具有抑制神经系统发育的严重不良反应，可能会增加脑瘫等严重伤残的发生率。因此，临床上使用糖皮质激素治疗BPD争议较大[13]。MK属于白三烯受体拮抗剂，研究已经证实该药物的抗炎、抗纤维化的作用，在哮喘、变应性鼻炎等呼吸道过敏性疾病的治疗中应用广泛。MK能够抑制白三烯的水平，而白三烯的升高可能与BPD的发生发展密切相关。VLIEGENTHART等[14]在早产儿BPD的治疗中使用了MK，明显提高了重症BPD患儿的生存率，同时患儿的机械通气时间也显著缩短。国外的研究[15]发现，使用MK治疗BPD，所取得的临床效果与使用糖皮质激素治疗相当，但患儿的不良反应明显减少。MK治疗BPD的机制尚未明确，多考虑与药物通过靶向抑制Ⅰ型半胱酰胺白三烯受体的作用相关，而针对免疫系统的平衡和相关因子调节作用的临床研究较少。
本次研究使用大鼠进行BPD造模，将刚出生的幼鼠进行高浓度氧环境下生长，以使大鼠发生BPD，同时使用MK进行治疗。本研究显示，BPD造模组大鼠Ri、Re水平高于MK组大鼠, 提示MK具有改善BPD大鼠肺部通气功能的作用。在免疫细胞平衡的研究中，BPD造模大鼠的Th1、Th1/ Th2水平最高，Th2水平最低。Th1细胞为CD4阳性细胞，主要分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，参与细胞免疫调节、介导免疫应答以及增强吞噬细胞的抗感染免疫作用。而Th2细胞具有抑制Th1细胞增殖，辅助B细胞活化的作用。3组大鼠Th1、Th2细胞水平的失衡变化在BPD造模组最为显著，MK组与对照组相比虽有一定程度的免疫失衡，但与BPD组相比则显著改善。对于相关细胞因子水平的研究发现，BPD组大鼠IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13水平均高于MK组大鼠，对照组大鼠上述指标水平均低于MK组和BPD组大鼠，提示BPD大鼠肺局部的抗炎因子和促炎因子水平均显著升高，这是体内炎症反应的结果。但是经过MK的治疗，体内的炎症因子均明显降低，提示药物对于Th1、Th2相关的细胞因子具有调节作用。
综上所述，MK具有调节BPD大鼠Th1、Th2细胞平衡，降低相关细胞因子水平的作用，但是其具体作用机制仍需要进一步深入研究。
孟鲁司特钠对支气管肺发育不良大鼠Th1Th2细胞平衡及其相关细胞因子水平的调节作用
Regulating effects of montelukast sodium on Th1Th2 cells balance and related cytokines levels in rats with bronchopulmonary dysplasia
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摘要:
目的观察孟鲁司特钠（MK）对支气管肺发育不良（BPD）大鼠Th1Th2细胞平衡及其相关细胞因子水平的调节作用。 方法随机选择SPF级健康SD孕3周左右，体质量在200~250 g孕鼠60只进行实验，将60只孕3周左右自然分娩SD母鼠与新生大鼠分为3组，每组20只，分别为：MK处理BPD模型组（MK组）、BPD模型组（BPD组）、常氧饲养对照组（对照组）。MK组、BPD组饲养在95%的高氧环境中，其中MK组给予MK（腹腔注射，10 mg·kg-1·d-1）处理，BPD组给予等剂量0.9%氯化钠溶液处理。对照组亦给予等剂量0.9%氯化钠溶液处理，饲养在常氧环境中。比较3组大鼠的肺功能、肺损伤局部巨噬细胞亚群和Th细胞功能亚群、肺损伤局部促炎和抗炎细胞因子水平。 结果大鼠Ri、Re、Th1、Th1/Th2、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13水平BPD组高于MK组，MK组高于对照组（P < 0.05）；Cl、MVV、FEV1/FVC、Th2水平BPD组低于MK组，MK组低于对照组（P < 0.05）。 结论MK具有调节支气管肺发育不良大鼠Th1、Th2细胞平衡，降低相关细胞因子水平，改善肺功能的作用。 Abstract:ObjectiveTo observe the regulating effects of montelukast sodium (MK) on the balance of Th1Th2 cells and levels of related cytokines in rats with bronchopulmonary dysplasia (BPD). MethodsSixty healthy SPF SD rats, 3 weeks of gestation and weighing 200-250g, were randomly selected for the experiment, and 60 natural born SD rats and newborn rats were divided into the BPD model treated with MK group (MK group), BPD model group (BPD group) and normoxia feeding control group (control group) (20 rats in each group), respectively.The MK group and BPD group were fed in 95% hyperoxia environment, the MK group was intraperitoneally injected with 10mg·kg-1·d-1 of MK, and the BPD group was injected with the same volume of 0.9% sodium chloride solution.The control group was injected with the same volume of 0.9% sodium chloride solution, and fed in the normoxic environment.The lung function, macrophage subsets, Th cell subsets and levels of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines were compared among three groups. ResultsThe levels of Ri, Re, Th1, Th1/Th2, IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-4, IL-10 and IL-13 in BPD group were higher than those in MK group and those in MK group were higher than those in control group (P < 0.05).The levels of Cl, MVV, FEV1/FVC, Th2 in BPD group were lower than those in MK group, and those in MK group were lower than those in control group (P < 0.05). ConclusionsMK can regulate the balance of Th1Th2 cells, and reduce the levels of related cytokines in rats with BPD. -
Key words:
- montelukast sodium /
- bronchopulmonary dysplasia /
- Th cells functional subgroup /
- rat
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表 1 3组大鼠肺功能比较(x±s)
分组 n Ri/(cmH2O·L-1·S-1) Re/(cmH2O·L-1·S-1) Cl/(mL/ cmH2O) MVV/mL (FEV1/FVC)/% MK组 20 4.52±0.97 3.44±0.82 73.81±25.26 8.29±2.37 55.27±15.30 BPD组 20 7.21±1.36* 6.41±0.96* 54.22±13.19* 4.53±1.26* 42.51±12.99* 对照组 20 3.55±0.84*△ 2.94±0.77*△ 80.77±23.50*△ 9.77±2.52*△ 67.28±16.33*△ F — 61.71 96.54 8.33 32.30 13.75 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 1.165 18.176 454.765 4.518 223.166 q检验：与MK组比较*P＜0.05；与BPD组比较△P＜0.05 
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表 2 3组大鼠Th1、Th2细胞水平比较(x±s)
分组 n Th1/% Th2/% Th1/ Th2 MK组 20 7.21±2.94 6.31±0.94 1.52±0.86 BPD组 20 12.57±4.06* 3.41±1.06* 4.33±2.70* 对照组 20 5.62±2.33*△ 7.51±1.49*△ 0.93±0.27*△ F — 26.04 63.07 24.44 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 10.185 1.409 2.701 q检验：与MK组比较*P＜0.05；与BPD组比较△P＜0.05
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表 3 3组大鼠局部肺组织促炎因子相关细胞因子水平比较(x±s)
分组 n IFN-γ/(μg/L) TNF-α/(ng/mL) IL-1β/(pg/mL) IL-6/(pg/mL) MK组 20 52.19±7.26 3.18±1.07 137.42±9.55 184.31±27.68 BPD组 20 64.22±6.33* 7.44±2.46* 177.86±12.31* 238.69±43.15* 对照组 20 44.18±8.39*△ 1.31±0.29*△ 91.42±4.92*△ 137.42±27.66*△ F — 37.41 81.34 420.43 45.42 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 54.390 2.427 88.982 1131.060 q检验：与MK组比较*P＜0.05；与BPD组比较△P＜0.05
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表 4 3组大鼠局部肺组织抗炎因子相关细胞因子水平比较(x±s)
分组 n IL-4/(pg/mL) IL-10/(ng/mL) IL-13/(ng/L) MK组 20 94.22±16.37 52.16±9.42 42.33±9.16 BPD组 20 115.67±15.23* 77.86±10.49* 63.47±12.29* 对照组 20 72.15±9.88*△ 38.44±5.29*△ 14.31±5.22*△ F — 47.55 105.96 139.16 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 199.181 75.587 87.399 q检验：与MK组比较*P＜0.05；与BPD组比较△P＜0.05
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