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食管癌是消化道常见的恶性肿瘤。全球每年新增食管癌40余万,包括2种主要组织学亚型:食管鳞癌和食管腺癌。我国为食管鳞癌的高发地区。早期食管鳞癌病人优先选择外科手术治疗,然而,食管癌的早期往往是非特异性的,大多数病人不重视本病,延误病情,丧失了手术切除的机会。因此放射治疗被广泛应用于中晚期食管癌病人中,尤其是食管鳞癌[1]。然而食管癌细胞对放射治疗为中度敏感,除食管癌的分期分型外,放射抗性也是局部复发和转移的主要原因之一[2]。因此寻找高效安全、优质价廉的药物,用来增加肿瘤组织细胞的放射敏感性有着十分重要的临床意义。丹皮酚是徐长卿粉末和牡丹皮,在中药提取为一种小分子酚类化合物,白色针状样晶体,化学名称为2-羟基-4-甲氧基苯乙酮,相对分子质量为166,分子式为C9H10O3。丹皮酚味苦、辛,熔点较低(51~52 ℃),微溶于水,溶于乙醇、三氯甲烷、乙醚、丙酮、苯和二硫化碳等有机溶剂[3]。近些年大量研究[4-6]均表明,在肝癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌等体内外细胞实验中,丹皮酚可通过多种机制发挥抗肿瘤作用,既有诱导肿瘤细胞凋亡、调控细胞周期,又有影响肿瘤血管生成、促进机体白细胞介素(IL)-2及肿瘤坏死因子α(TNF-α)生成的作用,以此发挥明显抗癌效应的作用。因此本研究以食管鳞癌细胞株KYSE450和TE10为研究对象,探讨丹皮酚对食管癌放射敏感性的影响。
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CCK8实验表明丹皮酚对于食管鳞癌细胞具有显著的药物毒性,它能够抑制食管鳞癌的增殖活性,其作用是剂量依赖性的(P<0.05~P<0.01)(见表 1)。丹皮酚作用细胞24 h后,其在KYSE450和TE10细胞中的IC50分别为104.48 mg/L和207.87 mg/L。因此,选择40 mg/L和100 mg/L浓度的丹皮酚应用于后续实验。
分组 KYSE450 TE10 24 h 48 h 24 h 48 h 空白组 102.54±0.05#△◇□ 103.80±4.37#△◇□ 103.51±5.82#△◇□ 102.57±3.63#△◇□ 丹皮酚20 mg/L 78.88±1.10*△◇□ 73.85±1.20*△◇□ 83.88±2.62*△◇□ 75.90±2.30*△◇□ 丹皮酚40 mg/L 68.25±0.64*#◇□ 62.31±0.68*#◇□ 72.71±2.18*#◇□ 63.96±1.51*#◇□ 丹皮酚80 mg/L 55.46±0.65*#△□ 47.51±1.82*#△□ 68.36±1.03*#△□ 58.29±1.48*#△□ 丹皮酚160 mg/L 36.31±2.05*#△◇ 30.19±0.45*#△◇ 56.08±3.32*#△◇ 43.82±2.81*#△◇ 丹皮酚320 mg/L 24.36±0.52*#△◇□ 8.72±0.17*#△◇□ 44.98±0.41*#△◇□ 31.64±2.81*#△□ F 9 016.00 3 287.00 531.30 1 155.00 P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 MS组内 1.086 4.090 9.623 6.455 q检验:与空白组比较*P<0.05;与丹皮酚20 mg/L组比较#P<0.05;与丹皮酚40 mg/L组比较△P<0.05;与丹皮酚80 mg/L组比较◇P<0.05;与丹皮酚160 mg/L组比较□P<0.05 表 1 CCK8实验检测食管癌细胞增殖活力(%;ni=12)
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为了验证丹皮酚关于食管鳞癌细胞的放射治疗增敏作用,我们用不同浓度的丹皮酚处理食管鳞癌细胞。经过单击多靶模型处理后,丹皮酚抑制KYSE450细胞的克隆形成,并呈现出剂量依赖关系(见图 1A)。应用单击多靶模型公式[SF=1-(1-e-D/D0)n]计算SF值。丹皮酚在TE10细胞的克隆形成实验中同样表现出显著差异(见图 2B), 放射治疗剂量在2 Gy时,40 mg/L或100 mg/L浓度的丹皮酚处理后的KYSE450细胞的存活率(SF2)分别为0.48和0.37(见表 2);同样处理后的TE10细胞的存活率(SF2)分别为0.48和0.35(32)。
分组 D0 Dq SF2 SER 对照组 2.99 0.66 0.57 — 丹皮酚40 mg/L 2.30 0.67 0.48 1.29 丹皮酚100 mg/L 1.94 0.28 0.37 1.54 表 2 丹皮酚对于KYSE450细胞的放射治疗增敏作用
分组 D0 Dq SF2 SER 对照组 2.49 2.28 0.72 — 丹皮酚40 mg/L 2.46 0.27 0.48 1.01 丹皮酚100 mg/L 1.83 0.09 0.35 1.36 表 3 丹皮酚对于TE10细胞的放射治疗增敏作用
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流式细胞仪检测丹皮酚或/和放射治疗(8 Gy)处理后的细胞凋亡率(见表 4)。与丹皮酚、放射治疗单独处理组相比,KYSE450和TE10细胞的联合处理组凋亡率显著增加(见图 2)。随着丹皮酚的给药剂量增加,两者联合作用的促凋亡作用更加明显(P<0.01)。结果表明,丹皮酚能提高食管鳞癌细胞的凋亡率,提高其放射治疗敏感性。
分组 n KYSE450 TE10 对照组 15 10.73±0.15 5.76±0.45 丹皮酚40 mg/L 15 11.25±0.01 7.795±0.12 丹皮酚100 mg/L 15 14.32±0.30 10.70±0.64 IR 15 16.72±0.19 15.29±0.22 IR+丹皮酚40 mg/L 15 18.19±0.15 17.23±0.32 IR+丹皮酚100 mg/L 15 19.44±0.40 21.61±1.48 F — 3 561.71 1 104.15 P — <0.01 <0.01 MS组内 — 0.055 0.495 表 4 流式细胞仪检测食管癌细胞凋亡率(%)
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为了探究丹皮酚的作用机制,本实验检测了凋亡相关蛋白的表达情况。比较不同处理措施后KYSE450和TE10两株细胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、PARP蛋白的表达情况。蛋白电泳实验表明在丹皮酚作用影响下,KYSE450和TE10细胞中促凋亡蛋白PARP、caspase-3、cleaved caspase-3和Bax的表达上调。相反,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达受到了抑制(见图 3)。
丹皮酚对食管癌细胞放射增敏作用及其机制
Effect of paeonol on the radiosensitization of esophageal cancer celland its mechanism
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摘要:
目的通过研究丹皮酚对食管鳞癌细胞株KYSE450、TE10放射敏感性的影响及探讨该作用的分子机制,为丹皮酚作为放射治疗增敏药物应用于食管鳞癌的综合治疗提供根据。 方法稳定培养食管癌细胞株,经不同浓度的丹皮酚作用后,CCK8法检测细胞增殖。克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡相关蛋白的表达。Western blotting实验检测凋亡相关蛋白的表达情况。 结果丹皮酚剂量依赖性地抑制食管癌细胞的增殖(P < 0.05~P < 0.01),并且抑制放射治疗后的肿瘤细胞克隆形成能力,增加肿瘤细胞的凋亡率(P < 0.01);Western blotting实验表示放疗与丹皮酚联合处理可降低Bcl-2的表达,增加Bax、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP的表达。 结论丹皮酚联合放疗可通过下调Bcl-2表达,上调Bax、caspase-3、PARP、cleaved caspase-3表达,从而抑制体外食管癌细胞的生长,实现放疗增敏。 Abstract:ObjectiveTo study the effects of paeonol on the radiosensitivity of esophageal squamous carcinoma cell lines KYSE450 and TE10, explore its molecular mechanism, and provide a new basis for the comprehensive treatment of esophageal squamous cell carcinoma with paeonol as radiotherapy sensitizing drug. MethodsEsophageal cancer cell lines were stably cultured.After the cells were treated with different concentrations of paeonol, the CCK8 method was used to detect the proliferation of cells, the ability of colony formation was detected using colony formation assay, the apoptosis was detected using flow cytometry, and the expression of apoptosis-related protein was detected using Western blotting. ResultsPaeonol could inhibit the proliferation of esophageal cancer cells at a concentration-dependent manner, inhibit the colony-forming ability of tumor cells after radiotherapy, and increase the apoptosis rate of tumor cells.The results of Western blotting analysis showed that the radiotherapy combined with paeonol could reduce the expression of Bcl-2, and increase the expression levels of Bax, caspase-3, cleaved caspase-3 and PARP. ConclusionsPaeonol combined with radiation therapy can inhibit the expression of Bcl-2, up-regulate the expression levels of Bax, caspase-3, cleaved caspase-3 and PARP, and the growth of esophageal cancer cells in vitro is inhibited to improve the radiosensitization. -
Key words:
- esophageal neoplasms /
- paeonol /
- apoptosis /
- proliferation /
- radiotherapy
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表 1 CCK8实验检测食管癌细胞增殖活力(%;ni=12)
分组 KYSE450 TE10 24 h 48 h 24 h 48 h 空白组 102.54±0.05#△◇□ 103.80±4.37#△◇□ 103.51±5.82#△◇□ 102.57±3.63#△◇□ 丹皮酚20 mg/L 78.88±1.10*△◇□ 73.85±1.20*△◇□ 83.88±2.62*△◇□ 75.90±2.30*△◇□ 丹皮酚40 mg/L 68.25±0.64*#◇□ 62.31±0.68*#◇□ 72.71±2.18*#◇□ 63.96±1.51*#◇□ 丹皮酚80 mg/L 55.46±0.65*#△□ 47.51±1.82*#△□ 68.36±1.03*#△□ 58.29±1.48*#△□ 丹皮酚160 mg/L 36.31±2.05*#△◇ 30.19±0.45*#△◇ 56.08±3.32*#△◇ 43.82±2.81*#△◇ 丹皮酚320 mg/L 24.36±0.52*#△◇□ 8.72±0.17*#△◇□ 44.98±0.41*#△◇□ 31.64±2.81*#△□ F 9 016.00 3 287.00 531.30 1 155.00 P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 MS组内 1.086 4.090 9.623 6.455 q检验:与空白组比较*P<0.05;与丹皮酚20 mg/L组比较#P<0.05;与丹皮酚40 mg/L组比较△P<0.05;与丹皮酚80 mg/L组比较◇P<0.05;与丹皮酚160 mg/L组比较□P<0.05 表 2 丹皮酚对于KYSE450细胞的放射治疗增敏作用
分组 D0 Dq SF2 SER 对照组 2.99 0.66 0.57 — 丹皮酚40 mg/L 2.30 0.67 0.48 1.29 丹皮酚100 mg/L 1.94 0.28 0.37 1.54 表 3 丹皮酚对于TE10细胞的放射治疗增敏作用
分组 D0 Dq SF2 SER 对照组 2.49 2.28 0.72 — 丹皮酚40 mg/L 2.46 0.27 0.48 1.01 丹皮酚100 mg/L 1.83 0.09 0.35 1.36 表 4 流式细胞仪检测食管癌细胞凋亡率(%)
分组 n KYSE450 TE10 对照组 15 10.73±0.15 5.76±0.45 丹皮酚40 mg/L 15 11.25±0.01 7.795±0.12 丹皮酚100 mg/L 15 14.32±0.30 10.70±0.64 IR 15 16.72±0.19 15.29±0.22 IR+丹皮酚40 mg/L 15 18.19±0.15 17.23±0.32 IR+丹皮酚100 mg/L 15 19.44±0.40 21.61±1.48 F — 3 561.71 1 104.15 P — <0.01 <0.01 MS组内 — 0.055 0.495 -
[1] DING YQ, QIN Q, YANG Y, et al.Improved sensitization effect of sunitinib in cancer cells of the esophagus under hypoxic microenviroment[J].Oncol Lett, 2016, 12(6):4671. [2] CHANG L, GRAHAM P, HAO J, et al.Proteomics discovery of radioresistant cancer biomarkers for radiotherapy[J].Cancer Lett, 2015, 369:289. [3] 吴桂莹, 亓玉玲, 郝宝燕, 等.丹皮酚衍生物及其药理活性研究进展[J].中草药, 2019, 4(4):1001. [4] 耿帅, 赵育林, 曾凯, 等.丹皮酚的研究进展[J].中国新药与临床杂志, 2016, 38(5):310. [5] 高立民, 满其倩.丹皮酚抗肿瘤作用及作用机制研究进展[J].药物评价研究, 2016, 39(2):296. [6] 田福忠, 周天华, 王善波.丹皮酚抗肿瘤作用及其机制研究进展[J].菏泽学院学报, 2018, 40(5):93. [7] 丁文秋, 徐华娥, 李晓林, 等.丹皮酚对肺癌细胞增殖与凋亡的影响[J].江苏医药, 2014, 40(12):1371. [8] 刘思涵.丹皮酚体内外诱导人食管癌Eca-109细胞凋亡及其机制研究[D].合肥: 安徽医科大学, 2008. [9] 杨震, 孙国平, 徐淑萍, 等.丹皮酚体内外抗人食管癌Eca-109细胞增殖及诱导凋亡的作用[J].中国药理学通报, 2007, 23(5):654. [10] 孙建华, 李雁.Fas/FasL系统在肿瘤细胞凋亡中的研究进展[J].医学综述, 2015, 21(20):3694. [11] HANAHAN D, WEINBERG RA.Halmarks of cancer:the next generation[J].Cell, 2011, 144(5):646. [12] 何焱, 王继双, 张鹏, 等.薯蓣皂苷元联合trail对非小细胞肺癌a549细胞的协同作用及其中效原理评价[J].药学学报, 2013(1):45. [13] 宋剑楠, 钱峰, 齐涵, 等.和厚朴酚促膀胱癌细胞周期停滞及诱导细胞凋亡的机制研究[J].临床泌尿外科杂志, 2015, 30(7):649.