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Wilms基因(WT-1)最早于1990年由CALL等在Wilms瘤中发现，定位于人类染色体11p13[1]，最早发现与肾母细胞瘤的发病机制有关，命名为Wilms瘤Ⅰ型基因[2]。研究[3-4]发现，WT-1可调控造血细胞增生和分化基因的转录或激活，与急性髓系白血病(AML)等多种肿瘤性疾病密切相关。因此，可作为白血病的特异性分子标志。本研究通过测定WT-1基因在非肿瘤病人和AML病人骨髓细胞的表达水平，比较AML病人和对照组以及AML各亚型WT-1基因水平的差异，并分析其与病人临床特征、疗效及预后的关系，为应用WT-1监测AML病人微小残留病和对AML病人进行预后分层提供理论依据。
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选取2014年1月至2017年4月在我院血液科住院经收治的初诊AML病人66例，其中男33例，女33例；年龄15~81岁。所有病人根据WHO白血病诊断标准进行骨髓形态分析、免疫分型、染色体检查、基因诊断(MICM)分析确诊，其中急性早幼粒细胞白血病(APL)病人8例，急性非淋巴细胞白血病ANLL病人58例(M1型9例，M2型39例，M4型7例，M5型2例，M7型1例)；并选同期健康体检的非肿瘤病人20例为对照组，均排除其他恶性肿瘤、感染疾病。
治疗标准参照2011年版《中国成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病诊疗指南》、2014年版《中国急性早幼粒细胞白血病诊疗指南》进行化疗，所有入组病例均为首次接受规范一个疗程化疗。
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收集所有研究对象的骨髓4 mL，2%EDTA抗凝，经Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用PBS洗涤细胞后加入1 mL Trizol(Invitrogen)，吹打均匀，置于-80 ℃保存，直至RNA提取。总RNA的提取按照Trizol试剂说明进行，经紫外分光光度计测定A260nm/A280nm比值，鉴定RNA纯度及定量后，-80 ℃冻存备用。
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采用一步法实时荧光定量PCR检测WT-1基因mRNA。仪器为ABI7500荧光检测仪，试剂来源于上海源奇生物技术有限公司生产的肿瘤相关基因WT-1检测试剂盒，步骤按照试剂盒操作说明书操作。反应条件为42 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，40个循环，PCR循环第二步60 ℃收集荧光信号。反应体系为25 μL。
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根据标准曲线分别计算出各份标本的Abelson原癌基因(ABL)和WT-1的拷贝数。以ABL的表达作为内参照。如果ABL基因的表达水平低于103，则本份标本视为RNA质量不合格，予以剔除。WT-1表达水平=(WT-1拷贝数/ABL拷贝数)×100%。以58例ANLL病人WT-1的中位表达水平作为界值(cut-off point)，分为WT-1基因高表达组和低表达组。
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采用方差分析、q检验、χ2检验和秩和检验。
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66例AML病人，59例检测到WT-1的表达，阳性率为89.4%；20例非肿瘤病人，6例检测WT-1的表达，阳性率为30%，2组WT-1表达率相比差异有统计学意义(χ2=29.34，P＜0.01)。各组WT-1表达水平相比差异有统计学意义(F=7.206，P＜0.05)，与对照组相比，APL病人和ANLL中分组为M1的病人的WT-1表达水平差异均有统计学意义(P＜0.05)。ANLL病人各亚型间相比差异有统计学意义(F=4.981，P＜0.05)，与M1组病人相比，M2组和M3组病人的WT-1表达水平差异有统计学意义(P＜0.05)(见表 1)。
分组 n 表达水平 APL 8 0.600 0±0.601 5* ANLL M1 9 0.930 0±0.846 1* M2 29 0.297 2±0.341 4△ M4 7 0.198 4±0.226 3△ M5 2 0.153 4±0.166 4 对照组 20 0.000 2±0.000 3 F — 7.21 P — ＜0.01 MS组内 — 0.172 与对照组比较*P＜0.05;与M1组比较△P＜0.05 表 1 不同组间WT-1转录本表达水平比较(x±s)
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以58例ANLL病人WT-1的中位表达水平作为界值，将其分为WT-1高表达组和低表达组，不同WT-1表达组AML病人性别、年龄、骨髓原幼细胞比例、外周血白细胞数、血红蛋白、血小板数、乳酸脱氢酶(LDH)、C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)等临床指标统计见表 2。结果显示：与WT-1低表达组相比，WT-1高表达组中骨髓原幼细胞比例、外周血白细胞数、CRP显著升高(P＜0.05)；而性别、年龄、血红蛋白、血小板数、LDH、PCT差异无统计学意义(P>0.05)。
分组 男 女 年龄/岁 原幼细胞比例/% 外周血白细胞数/(×109/L) 血红蛋白/(g/L) 血小板数/(×109/L) LDH/(U/L) CRP/(mg/L) PCT/(ng/L) WT-1低表达组 14 15 51.1±15.8 45.69±21.16 13.80±17.83 90.00±27.72 58.79±67.76 493.97±592.42 35.20±30.89 0.35±0.23 WT-1高表达组 16 13 51.60±15.7 72.97±19.01 70.01±97.75 87.31±31.19 44.10±34.15 707.72±767.84 61.20±31.02 0.42±0.26 t 0.15* 0.12 5.16 3.05 0.35 1.04 1.19 3.71 1.09 P >0.05 >0.05 ＜0.05 ＜0.05 >0.05 >0.05 >0.05 < 0.05 >0.05 *示χ2值 表 2 WT1的表达与初诊ANLL病人临床特征比较(x±s)
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58例ANLL病人完善染色体核型分析及基因检查，WT-1高表达组有10例存在染色体核型异常，其中t(8;21)(q22;q22)/AML1-ETO和11p+各2例，inv(16)(p13q22)/CBFB-MYH11、-y、8q-、+11、+21、del(20)(q11, 2q3.1)各1例，基因突变检测到NPM1突变2例，C/EBPα突变1例，C-kit突变1例，FLT3-ITD突变1例，NPM1、FLT3-ITD、DNMT3α突变1例；WT-1低表达组有6例染色核型异常，其中t (8;21)(q22;q22)、inv(16) (p13q22)、del(12)(q22q35)、del(5)(p11, 2p13)、多倍体、复杂核型各1例，C-kit突变1例，NPM1突变1例，C/EBPα突变2例，FLT3-ITD突变1例，NPM1、FLT3-TKD突变2例，NPM1、DNMT3α突变1例。根据《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)中国诊疗指南(2017版)》进行预后危险度分级，WT-1高表达组预后良好4例，预后中等22例，预后不良3例，WT-1低表达组预后良好6例，预后中等20例，预后不良3例，2组间病人预后水平差异无统计学意义(uc=394.50, P>0.05)(见表 3)。
分组 初次缓解 初次未缓解 半年复发 半年未复发 WT-1高表达组 16 13 8 21 WT-1低表达组 24 5 4 25 χ2 3.95 0.95 P ＜0.05 >0.05 表 3 不同WT-1表达组AML病人初次诱导后疗效评估(ni=29)
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8例APL病人在观察期内，2例病人发生颅内出血死亡，其余6例均初次诱导达完全缓解(CR)。58例ANLL病人中，WT-1高表达组与低表达组初次诱导CR率分别为53.6 %和82.8 %，高表达组AML病人CR率显著低于低表达组(P＜0.05)；WT-1高表达组与低表达组获得CR的病人半年内复发率分别为29.2%和14.3%，2组差异无统计学意义(P>0.05)(见表 3)。
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WT-1基因的异常表达与造血系统恶性肿瘤的发病密切相关。在恶性血液肿瘤的发病中，WT-1主要发挥转录抑制因子的作用，一方面在造血干细胞早期分化阶段，WT-1通过抑制IGF-Ⅱ、PDGF-A、GM-CSF、TGF-β等与调控细胞的生长、分化的基因，阻碍造血干细胞正常分化；另一方面当WT-1发生突变，抑制转录，导致细胞过度增殖而发生异常[5]。作为“泛白血病标志”，定量检测血液肿瘤病人血液及骨髓WT-1 mRNA的表达水平，对于疾病监测、化疗效果评估及预后判断等方面具有重要的意义[6]。本文利用荧光定量PCR技术检测WT-1基因在正常人和AML病人骨髓细胞的表达水平，比较AML病人和对照组以及AML各亚型WT-1基因水平的差异。结果表明，AML病人WT-1表达水平明显高于非肿瘤病人，同时发现WT-1基因在AML的亚型M1中表达水平显著高于其他亚型(P＜0.05)，与以往报道[7-9]一致。
本研究分析WT-1的表达与病人临床特征的相关性，结果显示WT-1表达水平与病人性别、年龄、血红蛋白、血小板等临床特征无显著相关性，与以往[10-11]报道一致。而WT-1高表达组骨髓原幼细胞比例、外周血白细胞量显著高于WT-1低表达组，这与前人研究存在一定差异。ADEL等[12]已经证实WT-1的表达水平与骨髓中幼稚细胞的数量和比例相关，在骨髓原幼细胞中高表达，与白血病病人的肿瘤负荷相关，而HAGAG等[13]研究结果显示，WT-1的表达与外周血白细胞量、骨髓原幼细胞比例间无统计学相关性。研究结果的差异可能与病人的差异、病人数量、WT-1基因亚型及突变等因素有关。LDH是一种糖酵解酶，存在于机体所有组织细胞的胞质内，研究[14]表明白血病细胞恶性增殖和坏死可引起血清LDH增高。CRP作为急性正时相反应蛋白，可快速监测和诊断机体感染、炎症发生反应[15]。PCT是无激素活性的降钙素前肽糖蛋白，随感染的加重或好转而持续升高或降至正常，可以作为感染预后的判断指标[16]。本研究结果显示与低表达组相比，WT-1高表达组LDH、CRP、PCT均无统计学差异(P>0.05)。
近年来，细胞遗传学和分子生物学不仅为白血病的诊断提供更多的遗传分子标志，而且为白血病危险度分级以及预后评估提供依据。58例ANLL病人中，常见的t(8;21)(q22;q22)、inv(16)(p13q22)、NPM1突变但不伴有FLT3-ITD突变、C/EBPα双突变通常是预后良好的类型，而复杂核型(≥3种)、FLT3-ITD突变、DNMT3α突变通常是预后不良的类型，其他类型均为预后中等。本文分析了AML病人WT-1基因不同表达组危险度分级的差异，发现2组相比差异无统计学意义。
本文通过比较AML病人WT-1基因高表达组和低表达组首次诱导化疗CR率和半年内复发率的差异，探讨该基因对AML病人疗效和预后的影响，结果显示，WT-1基因高表达组CR率明显低于低表达组，而2组复发率相比差异无统计学意义，与前人研究结果相符[17-19]，表明WT-1基因可作为判断疗效和预后的一项指标。
综上所述，AML病人WT-1表达与外周血白细胞数量、骨髓原幼细胞比例、CR率及复发率存在一定的相关性，揭示WT-1在AML病人骨髓细胞中表达水平可作为临床评估疾病的预后、疗效的指标，尽管目前WT-1基因在AML病人过表达具体机制还不明确，但WT-1基因已作为重要的分子标志来判断AML病人预后以及监测微小残留病灶，随着研究的深入，该基因在AML病人预后分层、微小残留病灶监测及作为靶向基因指导治疗将起更加重要的作用。
定量检测WT-1基因在急性白血病病人中的表达及临床意义
Quantitative detection of the WT-1 gene expression in acute leukemia patients and its clinical significance
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摘要:
目的研究Wilms基因（WT-1）在急性髓系白血病（AML）病人骨髓细胞中的表达，并分析其表达与临床疗效的关系。 方法收集AML病人66例，其中急性早幼粒细胞白血病（APL）组8例，急性非淋巴细胞白血病（ANLL，除APL）组58例。对照组20名为健康体检者。采用实时定量PCR法检测骨髓细胞中WT-1表达，并以WT-1的中位表达水平作为界值，将初诊AML病人（APL除外）分为WT-1高表达组和低表达组，并分析其表达与病人性别、年龄、骨髓原幼细胞比例、外周血白细胞数、血红蛋白、血小板数、乳酸脱氢酶（LDH）、C反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、完全缓解（CR）率及复发率的关系，以揭示WT-1基因表达水平与AML预后的关系。 结果病例组与对照组相比WT-1表达率差异有统计学意义（χ2=29.34，P < 0.01）。各组WT-1表达水平相比差异有统计学意义（F=7.206，P < 0.05），与对照组相比，APL病人和ANLL中M1的病人的WT-1表达水平均较高（P < 0.05）。ANLL病人各亚型间相比差异有统计学意义（F=4.981，P < 0.05），与M1组病人相比，M2组和M3组病人的WT-1表达水平相对较低（P < 0.05）；与WT-1低表达组相比，WT-1高表达组中骨髓原幼细胞比例、外周血白细胞数显著升高（P < 0.05）；而性别、年龄、血红蛋白、血小板数、LDH、CRP、PCT差异无统计学意义（P>0.05），2组病人预后水平差异无统计学意义（P>0.05）；AML病人WT-1高表达组CR率低于低表达组（P < 0.05）。 结论WT-1在AML病人骨髓细胞中表达水平可作为临床评估疾病的预后、疗效的指标。 Abstract:ObjectiveTo study the expression of Wilms gene (WT-1) in bone marrow cells of patients with acute myeloid leukemia (AML), and analyze the relationship between the expression level of WT-1 and clinical efficacy. MethodsThe clinical data of 66 AML patients, which included 8 patients with acute promyelocytic leukemia (APL) and 58 patients with acute non-lymphocytic leukemia (ANLL, except APL), were collected.Twenty healthy people were set as the control group.The expression levels of WT-1 in bone marrow cells of AML patients were detected using real-time quantitative PCR.The median level of WT-1 was set as the clinic value, the 58 newly diagnosed as ANLL patients were divided into the high-expression WT-1 group and low-expression WT-1 group.The relationship between the expression level of WT-1 and sex, age, ratio of progenitor cells, count of peripheral white blood cells, hemoglobin, platelets, lactate dehydrogenase (LDH), C-reactive protein (CRP), calcitonin (PCT), complete remission rate (CR) and relapse rate were analyzed, and the relationship between WT-1 gene expression level and prognosis of AML patients was revealed. ResultsThe difference of the expression rate of WT-1 between cases group and control group was statistically significant (P < 0.01), and the difference of the expression level of WT-1 among each group was statistically significant (P < 0.05).Compared with the control group, the expression levels of WT-1 in APL patients and M1 group were higher (P < 0.05).The difference of the expression level of WT-1 among ANLL patient subtypes was statistically significant (P < 0.05).Compared with the M1 group, the expression levels of WT-1 in M2 and M3 group were relatively low (P < 0.05).Compared with the low WT-1 expression group, the proportion of bone marrow progenitor cells and number of peripheral blood white blood cells in high WT-1 expression group significantly increased (P < 0.05).There was no statistical significance in gender, age, hemoglobin, platelet count, LDH, CRP, and PCT between low and high WT-1 expression groups (P>0.05), and there was no statistical significance in prognosis between two groups (P>0.05).The CR rate of AML patients in high WT-1 expression group was lower than that in low WT-1 expression group (P < 0.05). ConclusionsThe expression level of WT-1 in bone marrow cells of patients with AML can be used as an index to evaluate the prognosis and curative effect of the disease. -
Key words:
- acute myeloid leukaemia /
- WT-1 gene /
- real-time quantitative PCR
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表 1 不同组间WT-1转录本表达水平比较(x±s)
分组 n 表达水平 APL 8 0.600 0±0.601 5* ANLL M1 9 0.930 0±0.846 1* M2 29 0.297 2±0.341 4△ M4 7 0.198 4±0.226 3△ M5 2 0.153 4±0.166 4 对照组 20 0.000 2±0.000 3 F — 7.21 P — ＜0.01 MS组内 — 0.172 与对照组比较*P＜0.05;与M1组比较△P＜0.05 
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表 2 WT1的表达与初诊ANLL病人临床特征比较(x±s)
分组 男 女 年龄/岁 原幼细胞比例/% 外周血白细胞数/(×109/L) 血红蛋白/(g/L) 血小板数/(×109/L) LDH/(U/L) CRP/(mg/L) PCT/(ng/L) WT-1低表达组 14 15 51.1±15.8 45.69±21.16 13.80±17.83 90.00±27.72 58.79±67.76 493.97±592.42 35.20±30.89 0.35±0.23 WT-1高表达组 16 13 51.60±15.7 72.97±19.01 70.01±97.75 87.31±31.19 44.10±34.15 707.72±767.84 61.20±31.02 0.42±0.26 t 0.15* 0.12 5.16 3.05 0.35 1.04 1.19 3.71 1.09 P >0.05 >0.05 ＜0.05 ＜0.05 >0.05 >0.05 >0.05 < 0.05 >0.05 *示χ2值
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表 3 不同WT-1表达组AML病人初次诱导后疗效评估(ni=29)
分组 初次缓解 初次未缓解 半年复发 半年未复发 WT-1高表达组 16 13 8 21 WT-1低表达组 24 5 4 25 χ2 3.95 0.95 P ＜0.05 >0.05
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