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骨形态发生蛋白2在小鼠模型中诱导破骨细胞活化的机制

陈翔 汪萍萍

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骨形态发生蛋白2在小鼠模型中诱导破骨细胞活化的机制

    作者简介: 陈翔(1972-), 男, 副主任医师
    通讯作者: 汪萍萍, 731069746@qq.com
  • 中图分类号: R68

Mechanism of the bone morphogenetic protein 2 inducing osteoclast activation in the mouse model

    Corresponding author: WANG Ping-ping, 731069746@qq.com
  • CLC number: R68

  • 摘要: 目的探讨骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)在诱导小鼠破骨细胞活化的作用以及相关的机制。方法选取20只小鼠,按照随机数字法分为对照组和实验组,每组10只,均接受小鼠脊柱后外侧入路的横突间融合手术,实验组植入骨片和BMP-2,对照组仅植入骨片,评估术后骨骼变化情况。在小鼠胫骨内提取骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs),应用RANKL及M-CSF试剂诱导为破骨细胞,并在其中加入不同浓度的BMP-2,应用TRAP染色法检测破骨细胞情况,荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法测定Smad1及p65基因,Western blotting法测定Smad1及p65蛋白表达情况。结果微型CT仪影像检查显示,实验组小鼠术后的脊柱融合情况强于对照组。2组小鼠术后1、2、4周骨小梁体积和骨小梁厚度均呈增高趋势,骨小梁间隙呈降低趋势,差异均具有统计学意义(P < 0.01)。实验组术后1、2、4周骨小梁体积高于对照组,实验组术后2、4周骨小梁间隙低于对照组(P < 0.01)。在BMP-2浓度为60、90及120 ng/mL时破骨细胞总数和总面积均高于BMP-2浓度为0、30 ng/mL时(P < 0.01)。Smad1及p65 mRNA表达在不同浓度BMP-2诱导破骨细胞比较差异均具有统计学意义(P < 0.01),Smad1和p65 mRNA表达呈线性相关(P < 0.05)。结论BMP-2能够促进小鼠脊柱手术模型的融合,BMP-2参与了破骨细胞活化的过程,可能通过Smad1/p65信号通路介导破骨细胞活化。
  • 图 1  小鼠融合术后脊柱影像

    图 2  不同浓度BMP-2与RANKL诱导破骨细胞结果

    表 1  引物序列

    引物名 引物序列
    GAPDH
     上游引物 5′-CAA GAG GTC CTG TCT TCA GAT GA-3′
     下游引物 5′-TCT GTT TCC GTT TCC TGG TTC-3′
    BMP-2
     上游引物 5′-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3′
     下游引物 5′-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3′
    Smad1
     上游引物 5′-TAC GGA CGT CAG GTG CTC AGT TGC-3
     下游引物 5′-CCA TGC TGT GAC GTC CTG CAG C-3′
    p65
     上游引物 5′-CTA TGG CAT GGT AGA CGG ATG CCA-3′
     下游引物 5′-CGG ATT CGG CAA GGT CTC AAT TGC-3′
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    表 2  脊柱融合术后骨小梁相关指标对比(x±s)

    分组 n 1周 2周 4周 F P MS组内
    骨小梁体积/mm3
      对照组 10 0.030±0.006 0.056±0.003** 0.068±0.005**## 161.71 <0.01 0.000
      实验组 10 0.071±0.004 0.121±0.019** 0.143±0.021**## 49.93 <0.01 0.000
       t 17.98 10.69 10.99
       P <0.01 <0.01 <0.01
    骨小梁厚度/mm
      对照组 10 0.051±0.014 0.057±0.010 0.077±0.011**## 13.33 <0.01 0.000
      实验组 10 0.049±0.011 0.053±0.002 0.074±0.009**## 26.26 <0.01 0.000
      t 0.36 1.24 0.67
      P >0.05 >0.05 >0.05
    骨小梁间隙/mm
      对照组 10 0.093±0.013 0.074±0.012** 0.070±0.011** 10.44 <0.01 0.000
      实验组 10 0.077±0.022 0.042±0.010** 0.032±0.007** 26.46 <0.01 0.000
       t 1.98 6.48 9.22
       P >0.05 <0.01 <0.01
    q检验:与1周组比较** P<0.01;与2周组比较##P<0.01
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    表 3  不同浓度BMP-2诱导下破骨细胞总数量及总面积(x±s)

    BMP-2浓度/ng/mL n 破骨细胞总数/个 破骨细胞总面积/(×103μm2)
    0 10 76.65±6.39 2.67±0.65
    30 10 79.18±7.39 2.89±0.77
    60 10 113.43±9.10**## 6.15±0.89**##
    90 10 105.92±8.85**## 5.72±0.78**##
    120 10 110.27±8.77**## 5.52±0.68**##
    F 47.12 48.43
    P <0.01 <0.01
    MS组内 66.698 0.576
    q检验:与0 ng/mL比较** P<0.01;与30 ng/mL比较##P<0.01
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    表 4  不同浓度BMP-2诱导破骨细胞Smad1及p65 mRNA表达比较(x±s)

    BMP-2浓度/(ng/mL) n BMP-2 Smad1 p65
    0 10 1.265±0.032 0.786±0.022 0.985±0.045
    30 10 1.672±0.045 1.879±0.342* 3.768±0.937**
    60 10 6.726±1.027**## 4.172±0.769**## 4.872±1.209**#
    90 10 8.241±1.227**##▲▲ 6.384±1.673**##▲▲ 6.412±1.238**##▲▲
    120 10 9.452±1.544**##▲▲△△ 7.259±1.594**##▲▲ 8.195±1.463**##▲▲△△
    F 144.57 64.31 61.80
    P <0.01 <0.01 <0.01
    MS组内 0.989 1.210 1.203
    q检验:与0 ng/mL比较*P<0.05,** P<0.01;与30 ng/mL比较#P<0.05, ##P<0.01;与60 ng/mL组比较▲▲P<0.01;与90 ng/mL比较△△P<0.01
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-07-23
  • 录用日期:  2019-12-16
  • 刊出日期:  2020-01-15

骨形态发生蛋白2在小鼠模型中诱导破骨细胞活化的机制

    通讯作者: 汪萍萍, 731069746@qq.com
    作者简介: 陈翔(1972-), 男, 副主任医师
  • 鄂东医疗集团黄石市中心医院(湖北理工学院附属医院) 骨科, 湖北 黄石 435000

摘要: 目的探讨骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)在诱导小鼠破骨细胞活化的作用以及相关的机制。方法选取20只小鼠,按照随机数字法分为对照组和实验组,每组10只,均接受小鼠脊柱后外侧入路的横突间融合手术,实验组植入骨片和BMP-2,对照组仅植入骨片,评估术后骨骼变化情况。在小鼠胫骨内提取骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs),应用RANKL及M-CSF试剂诱导为破骨细胞,并在其中加入不同浓度的BMP-2,应用TRAP染色法检测破骨细胞情况,荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法测定Smad1及p65基因,Western blotting法测定Smad1及p65蛋白表达情况。结果微型CT仪影像检查显示,实验组小鼠术后的脊柱融合情况强于对照组。2组小鼠术后1、2、4周骨小梁体积和骨小梁厚度均呈增高趋势,骨小梁间隙呈降低趋势,差异均具有统计学意义(P < 0.01)。实验组术后1、2、4周骨小梁体积高于对照组,实验组术后2、4周骨小梁间隙低于对照组(P < 0.01)。在BMP-2浓度为60、90及120 ng/mL时破骨细胞总数和总面积均高于BMP-2浓度为0、30 ng/mL时(P < 0.01)。Smad1及p65 mRNA表达在不同浓度BMP-2诱导破骨细胞比较差异均具有统计学意义(P < 0.01),Smad1和p65 mRNA表达呈线性相关(P < 0.05)。结论BMP-2能够促进小鼠脊柱手术模型的融合,BMP-2参与了破骨细胞活化的过程,可能通过Smad1/p65信号通路介导破骨细胞活化。

English Abstract

  • 脊柱手术是目前治疗脊椎相关疾病的主要方法之一,在部分病人中,需要进行脊柱间融合,脊柱融合的稳定性也直接决定了手术远期预后[1-4]。而脊柱融合过程中需要选择适合的植骨材料,临床研究显示植骨过程中加入骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)能够加强脊柱融合的效果并降低手术出血等指标,但近年较多研究提示脊柱手术中加入BMP-2也会增加不良反应发生率,主要包括颈椎前部水肿、移植物发生沉降、骨质溶解以及手术相关感染等,骨溶解可引起手术节段终板的损坏以及骨量的流失,最终导致手术效果差[5-9]。骨溶解被认为与破骨细胞异常活化有关,BMP-2在破骨细胞异常活化中的作用机制尚无统一意见。基于此,本研究旨在探讨破骨细胞活化诱导骨溶解的机制。

    • 选择3~5周龄雄性的C57小鼠30只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司),动物合格证号为:SCXK(京),20180019,饲养于我院动物实验中心,自主进食和水。其中20只小鼠按照随机数字法分组,对照组和实验组各10只,剩余10只用于提取巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs)。实验涉及的动物伦理问题已经我院伦理委员会批准。

    • 脱钙骨基质及小鼠BMP-2蛋白购自武汉艾美捷科技有限公司,RANKL试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司,M-CSF试剂盒购自长沙达尔锋生物科技有限公司,PCR试剂盒购自上海赛默飞世尔科技(中国)有限公司,Smad1蛋白一抗、p65蛋白一抗及二抗、Western blotting检测试剂盒购自苏州宇恒生物科技有限公司,TRAP试剂盒、BCA蛋白试剂盒购自美国Sigma公司,酶标仪购自北京普天新桥技术有限公司,PCR仪购自深圳市瑞安康医疗器械有限公司,凝胶电泳分析系统购自英国CLEAVER公司,光学显微镜购自上海玉研科学仪器有限公司,微型CT仪购自江苏平生医疗科技有限公司。

    • 所有小鼠均接受脊柱后外侧入路的横突间融合手术,实验组植入脱钙骨基质和BMP-2,对照组植入骨松质。方法参照韩兴龙[10]的方案,具体方法为:3%浓度的戊巴比妥以50 mg/kg体质量计算用量,采用腹腔注射麻醉,麻醉后小鼠俯卧位放置于操作手术台上,去L4、L5棘突部位行长约15 mm的正中切口,再沿棘突侧面行一个左侧旁正中切口,钝性分离L4~L5椎旁肌,清除附着软组织充分显露L4及L5的横突并去除骨皮质,直至横突渗血,将脱钙骨基质修型,使其能够顺利固定在L4与L5的横突间,实验组加入BMP-2,对照组无处置,覆盖软组织并进行缝合,闭合切口,手术由一位操作能力强的医生完成,术后给予抗生素预防感染。

    • 分别在手术后1周、2周、4周进行微型CT复查,观察椎间融合情况,留取图像资料,在CTAn软件中评估涉及的骨量、骨小梁厚度以及骨小梁间隙。

    • 取10只C57小鼠采取颈椎脱臼法处死,剪开皮肤显露双下肢,剥离股骨及胫骨处上的其他组织,先从髋关节处分离下肢骨骼,注意保护好股骨头,并在膝关节处离断股骨和胫骨,清理干净,置于75%乙醇进行浸泡5 min,再置入含有双抗的PBS液中。用新剪刀剪开股骨及胫骨的一侧,用1 mL注射器吸取α-MEM培养基(含有双抗及10%PBS液)放置在另一侧,剪开另一侧股骨及胫骨的另一侧,推注混合液使其骨髓进入10 mL的培养皿中,并向培养皿中加入RANKL(50 ng/μL)及M-CSF(30 ng/mL),并在各个培养皿中加入不同浓度的BMP-2稀释液(0、30、60、90、120 ng/mL),用吸管吹打至均匀,放入培养箱中培养,培养条件为37 ℃、5%的CO2。培养5 d后全部换液继续培养,根据BMMs的细胞密度达到90%时接种至96孔板内,观察其破骨细胞情况待用。

    • 在冰箱中取出TRAP试剂盒恢复至室温,配置固定液,固定液成分为枸橼酸盐25 mL、丙酮65 mL及37%甲醛8 mL,按照操作说明配置TRAP显色液。取出BMMs诱导破骨细胞孔板,用PBS漂洗2次,孔内加入100 μL的细胞固定液,固定30 s后弃除,PBS漂洗2次。每孔内加入100 μL的TRAP染色液,37 ℃孵育1 h,弃除染色液,PBS漂洗2次。光镜下观察5个视野内的TRAP染色阳性细胞数及总面积。

    • 待BMMs细胞诱导为破骨细胞后,应用RIPA裂解液进行细胞裂解,采用Trizol法进行细胞中总RNA的提取,并对RNA的纯度进行检测,提取20μg的总RNA,对提取的RNA反转录为cDNA,反转录操作参照反转录试剂盒的说明书要求。引物序列见表 1。PCR反应条件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40个循环,循环完成后在72 ℃条件下继续延伸10 min。采用FS2000系统进行分析,并采用2-△△CT的方法计算BMP-2、Smad1及p65相对表达量。

      引物名 引物序列
      GAPDH
       上游引物 5′-CAA GAG GTC CTG TCT TCA GAT GA-3′
       下游引物 5′-TCT GTT TCC GTT TCC TGG TTC-3′
      BMP-2
       上游引物 5′-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3′
       下游引物 5′-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3′
      Smad1
       上游引物 5′-TAC GGA CGT CAG GTG CTC AGT TGC-3
       下游引物 5′-CCA TGC TGT GAC GTC CTG CAG C-3′
      p65
       上游引物 5′-CTA TGG CAT GGT AGA CGG ATG CCA-3′
       下游引物 5′-CGG ATT CGG CAA GGT CTC AAT TGC-3′

      表 1  引物序列

    • 取出BMMs诱导破骨细胞孔板,加入细胞裂解液在冰上进行裂解30 min,收集1.5 mL裂解后细胞溶液于离心管中,在预冷4 ℃的离心机中5 000 r/min离心5 min,取上清液,经95 ℃煮沸后,应用二喹啉甲酸法检测总蛋白浓度。提取40 μg的总蛋白,将其在120 g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离,采用电转移法转移至聚偏氟乙烯膜上,在室温条件下用50 g/L的脱脂奶粉进行封闭2 h。加入稀释的Smad1蛋白一抗、p65蛋白一抗(1:1 000),在4 ℃条件下进行孵育备用。第2天用PBS液稀释洗涤孵育后的溶液,重复3次,然后加入稀释二抗(1:1 000稀释)孵育2 h,用PBS稀释液重复洗涤3次,然后用二氨基联苯胺显影液处理样本。采用Image J软件分析蛋白条带。

    • 采用t检验、方差分析和q检验及相关分析。

    • 2组小鼠接受脊柱后外侧入路的横突间融合手术后,实验组小鼠术后的脊柱融合情况强于对照组(见图 1)。2组小鼠术后1、2、4周骨小梁体积和骨小梁厚度均呈增高趋势,骨小梁间隙呈降低趋势(P<0.01)。实验组术后1、2、4周骨小梁体积高于对照组,实验组术后2、4周骨小梁间隙低于对照组(P<0.01),其余差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 2)。

      图  1  小鼠融合术后脊柱影像

      分组 n 1周 2周 4周 F P MS组内
      骨小梁体积/mm3
        对照组 10 0.030±0.006 0.056±0.003** 0.068±0.005**## 161.71 <0.01 0.000
        实验组 10 0.071±0.004 0.121±0.019** 0.143±0.021**## 49.93 <0.01 0.000
         t 17.98 10.69 10.99
         P <0.01 <0.01 <0.01
      骨小梁厚度/mm
        对照组 10 0.051±0.014 0.057±0.010 0.077±0.011**## 13.33 <0.01 0.000
        实验组 10 0.049±0.011 0.053±0.002 0.074±0.009**## 26.26 <0.01 0.000
        t 0.36 1.24 0.67
        P >0.05 >0.05 >0.05
      骨小梁间隙/mm
        对照组 10 0.093±0.013 0.074±0.012** 0.070±0.011** 10.44 <0.01 0.000
        实验组 10 0.077±0.022 0.042±0.010** 0.032±0.007** 26.46 <0.01 0.000
         t 1.98 6.48 9.22
         P >0.05 <0.01 <0.01
      q检验:与1周组比较** P<0.01;与2周组比较##P<0.01

      表 2  脊柱融合术后骨小梁相关指标对比(x±s)

    • BMMs在不同浓度BMP-2、RANKL及M-CSF诱导5 d后破骨细胞结果见图 2。在BMP-2浓度为60、90及120 ng/mL时破骨细胞总数和总面积均高于BMP-2浓度为0、30 ng/mL时(P<0.01),而在BMP-2浓度为0与30 ng/mL时比较,差异无统计学意义(P>0.05),在BMP-2浓度为60、90及120 ng/mL时比较,差异无统计学意义(P>0.05)(见表 3)。

      图  2  不同浓度BMP-2与RANKL诱导破骨细胞结果

      BMP-2浓度/ng/mL n 破骨细胞总数/个 破骨细胞总面积/(×103μm2)
      0 10 76.65±6.39 2.67±0.65
      30 10 79.18±7.39 2.89±0.77
      60 10 113.43±9.10**## 6.15±0.89**##
      90 10 105.92±8.85**## 5.72±0.78**##
      120 10 110.27±8.77**## 5.52±0.68**##
      F 47.12 48.43
      P <0.01 <0.01
      MS组内 66.698 0.576
      q检验:与0 ng/mL比较** P<0.01;与30 ng/mL比较##P<0.01

      表 3  不同浓度BMP-2诱导下破骨细胞总数量及总面积(x±s)

    • BMP-2诱导破骨细胞BMP-2 mRNA表达的在0 ng/mL与30 ng/mL比较,差异无统计学意义(P>0.05),在其余浓度间比较差异具有统计学意义(P<0.01);Smad1 mRNA表达在不同浓度BMP-2诱导破骨细胞比较,差异均具有统计学意义(P<0.05~P<0.01);p65 mRNA表达在不同BMP-2浓度诱导破骨细胞对比差异均具有统计学意义(P<0.05~P<0.01)。两种mRNA进行线性分析,结果显示Smad1和p65呈显著正相关关系(r=0.215,P<0.05)(见表 4)。

      BMP-2浓度/(ng/mL) n BMP-2 Smad1 p65
      0 10 1.265±0.032 0.786±0.022 0.985±0.045
      30 10 1.672±0.045 1.879±0.342* 3.768±0.937**
      60 10 6.726±1.027**## 4.172±0.769**## 4.872±1.209**#
      90 10 8.241±1.227**##▲▲ 6.384±1.673**##▲▲ 6.412±1.238**##▲▲
      120 10 9.452±1.544**##▲▲△△ 7.259±1.594**##▲▲ 8.195±1.463**##▲▲△△
      F 144.57 64.31 61.80
      P <0.01 <0.01 <0.01
      MS组内 0.989 1.210 1.203
      q检验:与0 ng/mL比较*P<0.05,** P<0.01;与30 ng/mL比较#P<0.05, ##P<0.01;与60 ng/mL组比较▲▲P<0.01;与90 ng/mL比较△△P<0.01

      表 4  不同浓度BMP-2诱导破骨细胞Smad1及p65 mRNA表达比较(x±s)

    • 在不同浓度BMP-2诱导破骨细胞后检测Smad1及p65蛋白的表达对比,结果显示在不同浓度BMP-2下Smad1、p65蛋白差异具有统计学意义(P<0.01)(见表 4)。对Smad1及p65蛋白相对表达量进行线性分析,结果显示Smad1及p65蛋白表达呈显著正相关关系(r=0.249,P<0.05)。

    • 本研究对小鼠实施脊柱后外侧入路的横突间融合手术,结果显示两种方式均能获得良好的效果,而加用BMP-2融合效果更明显。应用CTAn软件评价融合术后骨小梁情况,结果显示,加用BMP-2小鼠在骨小梁体积及骨小梁间隙方面高于未添加小鼠,而在骨小梁厚度方面则无差异。综合分析其原因可能为:未添加BMP-2小鼠脊柱术后融合效果良好,排除了手术、脱钙骨基质带来的干扰,加用BMP-2后,可以有效增加诱导脊柱骨性融合,明显提高骨生长相关指标,BMP-2可能通过介导骨细胞生长促进脊柱融合。与朱卫国等[11-13]研究结果相近。

      在体外实验中,提取骨髓来源的巨噬细胞,应用RANKL及M-CSF试剂对其进行诱导产生破骨细胞,结果显示诱导破骨细胞总数为(76.65±6.39)个,面积为(2.67±0.65)×103μm2,表明本次研究构建体外诱导破骨细胞模型成功,与既往研究结果相似。在加入60、90、120 ng/mL BMP-2培养发现破骨细胞总数及面积明显高于未添加和30 ng/mL,而BMP-2浓度在60、90、120 ng/mL比较无差异,在未添加和30 ng/mL之间也无差异。结果显示BMP-2可能参与了诱导破骨细胞活化的过程,并且随着浓度的持续增加,其破骨细胞活化未能一直增高,分析原因可能为BMP-2可能参与了破骨细胞诱导的过程,其诱导破骨细胞表达水平可能与细胞内相应的受体数量有关,当受体配体匹配饱和后,增加BMP-2浓度无法增加诱导破骨细胞活化能力。高浚淮等[14]研究对仿生壳聚糖载体包裹的BMP-2诱导间充质干细胞分化为成骨细胞进行观察,结果提示BMP-2能够促进成骨细胞的分化。PHAM等[15]研究显示增加BMP-2数量可以提高TWSG1过表达诱导的破骨细胞数量,本次研究结果与之一致。我们检测了体外实验诱导破骨细胞BMP-2 mRNA,在不同浓度BMP-2加入时其表达水平不同,说明外源性加入BMP-2对内源性表达有影响作用,但具体的作用还需进行探讨。对诱导破骨细胞后Smad1及p65 mRNA及蛋白的表达进行检测,结果显示,随着BMP-2浓度增加表达水平均有所提高,并且Smad1及p65 mRNA及蛋白表达具有相关性。我们推测在BMP-2诱导破骨细胞活化过程中,Smad1及p65可能参与了信号转导的过程。而缪雄[16]研究也证实了BMP-2通过激活Smad1及p65信号通路,进而促使破骨细胞活化致使骨溶解,支持本次研究结果。因此,我们总结了BMP-2在诱导小鼠破骨细胞活化的机制,具体为BMP-2激活Smad1,使Smad1磷酸化,进而激活p65磷酸化,促进磷酸化的p65转入细胞核内,促进破骨细胞活化。

      在本次研究中,总结了小鼠脊柱手术模型实验中的注意事项:(1)构建动物模型时,将BMP-2注射入小鼠胫骨内,因小鼠胫骨较细,注射时避免针尖未完全注入骨髓腔或刺破骨内侧壁,在注射时注意回抽确认位置;(2)BMP-2慢病毒载体在注入小鼠胫骨内,其表达程度难以稳定,小鼠的免疫系统会消化清除部分BMP-2慢病毒载体,需要进行几次预实验对BMP-2表达的稳定性进行评估;(3)在选取动物时,因考虑实验经济成本等条件,本次选择小型动物,具有简便、可行性高等特点,未建立大型动物模型。

      综上所述,BMP-2应用在小鼠脊柱手术模型中能够促进骨融合,BMP-2参与诱导破骨细胞活化的过程,诱导破骨细胞活化可能通过Smad1/p65信号通路。

参考文献 (16)

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