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芝麻素对Toll样受体2在实验性颅脑损伤中表达的影响

吴少帅 徐福林 苏作鹏 杜嘉瑞 沈刚

引用本文:
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芝麻素对Toll样受体2在实验性颅脑损伤中表达的影响

    作者简介: 吴少帅(1981-), 男, 主治医师
  • 中图分类号: R742

Effect of sesamin on expression of Toll-like receptor 2 in experimental brain injury

  • CLC number: R742

  • 摘要: 目的探讨芝麻素对Toll样受体2(TLR2)在实验性颅脑损伤中表达的影响。方法采用自由落体法建立鼠颅脑损伤模型,将45只小鼠随机分为假手术组、颅脑损伤组、脑外伤后芝麻素治疗组。称量脑组织干湿重观察脑水肿的变化;用Western blotting方法检测各组小鼠脑组织中TLR2表达;采用实时荧光定量PCR检测脑损伤周围组织中炎症因子的表达水平。结果脑外伤组小鼠损伤侧脑水含量、TLR2表达及炎症因子表达水平较假手术组显著升高(P < 0.05~P < 0.01);而芝麻素治疗组的损伤侧脑水含量、TLR2蛋白表达及炎性因子表达水平则低于脑外伤组(P < 0.05~P < 0.01)。结论TBI后脑组织中TLR2表达增高及炎症反应增强,而芝麻素能够抑制炎症反应,进而起到保护脑组织进一步损伤。
  • 表 1  3组小鼠脑水含量及脑组织TLR2蛋白表达比较(x±s)

    分组 n 脑水含量/% TLR2蛋白量
    假手术组 5 71.57±7.9 4.67±0.42
    脑外伤组 5 82.16±4.6* 6.84±0.98**
    芝麻素组 5 74.26±5.6# 5.41±0.17##
    F 3.95 15.66
    P <0.05 <0.01
    MS组内 38.310 0.389
    q检验:与假手术组比较* P<0.05,**P<0.01;与脑外伤组比较#P<0.05,##P<0.01
    下载: 导出CSV

    表 2  3组小鼠脑组织IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表达比较(x±s)

    分组 n IL-1β mRNA IL-6 mRNA TNF-α mRNA
    假手术组 5 6.81±0.92 10.56±1.86 5.13±0.44
    脑外伤组 5 9.32±1.06** 14.38±2.14* 8.89±0.57**
    芝麻素组 5 7.49±0.79# 11.47±1.21# 6.49±0.36**##
    F 9.74 6.28 83.89
    P <0.01 <0.01 <0.01
    MS组内 0.865 3.168 0.216
    q检验:与假手术组比较*P<0.05,**P<0.01;与脑外伤组比较#P<0.05,##P<0.01
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-02-14
  • 录用日期:  2019-07-28
  • 刊出日期:  2020-01-15

芝麻素对Toll样受体2在实验性颅脑损伤中表达的影响

    作者简介: 吴少帅(1981-), 男, 主治医师
  • 上海市闵行区中心医院 神经外科, 201199

摘要: 目的探讨芝麻素对Toll样受体2(TLR2)在实验性颅脑损伤中表达的影响。方法采用自由落体法建立鼠颅脑损伤模型,将45只小鼠随机分为假手术组、颅脑损伤组、脑外伤后芝麻素治疗组。称量脑组织干湿重观察脑水肿的变化;用Western blotting方法检测各组小鼠脑组织中TLR2表达;采用实时荧光定量PCR检测脑损伤周围组织中炎症因子的表达水平。结果脑外伤组小鼠损伤侧脑水含量、TLR2表达及炎症因子表达水平较假手术组显著升高(P < 0.05~P < 0.01);而芝麻素治疗组的损伤侧脑水含量、TLR2蛋白表达及炎性因子表达水平则低于脑外伤组(P < 0.05~P < 0.01)。结论TBI后脑组织中TLR2表达增高及炎症反应增强,而芝麻素能够抑制炎症反应,进而起到保护脑组织进一步损伤。

English Abstract

  • 创伤性脑损伤(TBI)是现代社会一种常见身体损伤,多为意外摔倒、车祸伤、高处坠落等导致,伤后病人病情危急,预后不佳。通过深入研究,近来发现TBI后继发炎症性脑损伤是影响病人预后的重要因素[1-2]。尧小龙等[3]报道TBI后通过Toll样受体(TLRs)/ κB信号通路激活小胶质细胞释放炎性因子,启动炎性反应。TLR2在实验性脑出血模型中被证明是炎症性脑损伤的重要启动因子[4],但在TBI中是否也存在类似机制鲜有报道。因此,本文通过鼠脑损伤模型研究,阐明TLR2在脑损伤后的表达及作用,同时评价芝麻素的抗炎效果。

    • 实验动物由上海交通大学瑞金医院动物实验中心提供。45只C57BL/6小鼠,体质量25~30 g,按随机化原则,分为假手术组、脑损伤组、脑损伤后芝麻素治疗组,每组15只;普通饲养。先通过二甲亚砜溶解芝麻素,在鼠损伤模型建立成功后,向芝麻素组鼠的腹腔中注入芝麻素(30 mg/kg),每天1次,连续3 d。

    • 采用腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)麻醉小鼠。麻醉成功后头部于立体定向仪上固定、备头皮、消毒。于人字缝与矢状缝交汇处作一正中切口,切开头皮、暴露颅骨,剥离骨膜;在左侧冠状缝和人字缝之间、中线旁开3 mm处颅骨钻孔,骨窗直径3 mm,使硬脑膜完整暴露;应用BW-ZYQ精细颅脑撞击仪(上海软隆科技公司)设定打击参数(深度:1 mm;砝码重量:10 g;打击高度:2 cm),使用直径2.5 mm的打击头撞击鼠的脑皮质。在致伤后移开鼠并重新缝合头皮。假手术组鼠均不行脑皮质打击,但其他步骤与实验组相同。

    • 脑损伤3 d后,于每组中取5只小鼠深度麻醉后处死(戊巴比妥麻醉),完整取出脑组织称重,记湿重;后置于100 ℃烘烤24 h,称重记为干重。脑水含量= (湿重-干重) /湿重×100%。

    • 于外伤后3 d,每组取5只小鼠深度麻醉下断头取脑,显微镜下取伤灶周边脑组织,加入RIPA裂解液,超声粉碎。向加样槽中加入样本后电泳、跑胶,在转膜电泳槽中装入膜,冰浴中恒流转膜1 h。在5%脱脂牛奶中浸润膜并封闭1 h;一抗4 ℃孵育过夜;用TBST清洗10 min×3次;二抗孵育1 h;用TBST清洗10 min×3次后,ECL显色,扫描显影。目标蛋白与内参照β-actin的比值为相对表达量。

    • 每组5只小鼠均于手术后3 d,深度麻醉下断头取脑,取伤灶周边脑组织,称取脑组织100 mg。Trizol法提取脑组织细胞中的RNA,参考M-MLV操作说明书(Promega公司)将RNA逆转录成cDNA。按照SYBR green说明书加样,各样本加入cDNA 2 μL,商品化引物2 μL(IL-1β:MQP027422;IL-6:MQP029457;TNF-α:MQP031019,美国Genecopoeia公司)。PCR反应条件为预变性95 ℃×2 min后,变性95 ℃ 40 s,退火52 ℃ 40 s,延伸72 ℃ 1 min,35个循环后72 ℃延伸10 min。

    • 采用方差分析和q检验。

    • 3组小鼠的脑水含量差异有统计学意义(P<0.05),脑外伤组脑水含量高于假手术组和芝麻素治疗组(P<0.05)。3组小鼠组织TLR2蛋白表达差异有统计学意义(P<0.01),脑外伤组TLR2蛋白表达水平显著高于假手术组和芝麻素治疗组(P<0.01)(见表 1)。

      分组 n 脑水含量/% TLR2蛋白量
      假手术组 5 71.57±7.9 4.67±0.42
      脑外伤组 5 82.16±4.6* 6.84±0.98**
      芝麻素组 5 74.26±5.6# 5.41±0.17##
      F 3.95 15.66
      P <0.05 <0.01
      MS组内 38.310 0.389
      q检验:与假手术组比较* P<0.05,**P<0.01;与脑外伤组比较#P<0.05,##P<0.01

      表 1  3组小鼠脑水含量及脑组织TLR2蛋白表达比较(x±s)

    • 与假手术组相比,脑外伤组中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达水平明显增高(P<0.05~P<0.01);而芝麻素处理组中脑组织中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表达水平则显著低于脑外伤组(P<0.05~P<0.01)(见表 2)。

      分组 n IL-1β mRNA IL-6 mRNA TNF-α mRNA
      假手术组 5 6.81±0.92 10.56±1.86 5.13±0.44
      脑外伤组 5 9.32±1.06** 14.38±2.14* 8.89±0.57**
      芝麻素组 5 7.49±0.79# 11.47±1.21# 6.49±0.36**##
      F 9.74 6.28 83.89
      P <0.01 <0.01 <0.01
      MS组内 0.865 3.168 0.216
      q检验:与假手术组比较*P<0.05,**P<0.01;与脑外伤组比较#P<0.05,##P<0.01

      表 2  3组小鼠脑组织IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、TNF-α mRNA的表达比较(x±s)

    • TBI的发病率、致残率居高不下,严重影响人们的生命健康。统计数据显示,全球TBI的发生率约为每年349/10万,ROOZENBEEK等[5]报道在美国TBI后死亡率高达17/10万人,在中国TBI死亡率在12.99/10万人,给社会和家庭带来沉重负担,因此TBI后病理生理变化和治疗仍是目前研究的一大热点。TBI后早期表现为神经元、胶质细胞大量变性、死亡,而早期脑损伤并非影响病人预后的唯一因素,更多学者关注TBI后继发性炎症性脑损伤,发现TBI后激活的小胶质细胞释放炎性因子,启动炎性反应及放大反应,导致脑组织进一步损伤,而TLRS信号通路在其中起着重要作用[1-2]

      TLRS作为主要的固有免疫受体类型,在调节免疫应答和启动继发性损伤中发挥关键作用[6]。有学者报道[7]TLRs通过结合相应的配体,激活NF-κB,使巨噬细胞/小胶质细胞释放炎性因子与炎性趋化因子。目前文献报道比较多的是TLR4, 作为TLRs家族中的重要成员,在TBI继发性损伤中发挥关键作用[8-9]。有学者通过实验性脑出血模型证明TLR2是炎症性脑损伤的重要启动因子[2],但在脑外伤中是否存在类似作用未见报道。

      芝麻素具有抗炎症、保护血管内皮细胞等重要作用,近来引起较多学者关注。AHMAD等[10]通过脑缺血动物实验研究,发现芝麻素可以降低炎症因子的表达。为了验证芝麻素在脑出血后的保护作用,苏作鹏等[11]通过出血性鼠模型研究,发现芝麻素能够保护血-脑屏障的完整性,减轻脑水肿,减轻炎症反应。那么,芝麻素是否在脑外伤后发挥脑保护作用值得研究。

      本组实验发现脑外伤组小鼠损伤侧脑水含量较假手术组显著升高,说明脑外伤后血-脑屏障破坏引起的细胞内外水含量增多;与脑外伤组相比,芝麻素治疗组的损伤侧脑水含量明显下降,显示芝麻素可以减轻脑外伤后的脑水肿程度。与假手术组相比,脑外伤组中TLR2、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达水平明显增高;而芝麻素治疗组的TLR2、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达水平低于脑外伤组。表明芝麻素可以降低脑外伤后炎症因子的表达。由此我们得出,TBI后多种刺激信号(如血红蛋白)激活相应的固有免疫受体,特别是小胶质细胞表面TLRs受体,启动炎症反应,释放大量炎性因子和炎症趋化因子,在继发性炎症损伤中发挥重要作用,而芝麻素能够减轻脑水肿和抑制炎症因子的表达,取到保护脑损伤作用。

      不同的TLR受体不仅可单独识别各种内源性及外源性配体,介导机体的免疫应答,而且TLR之间也可形成不同的二聚体从而使炎症反应放大。FORSTNER等[2]发现Hb刺激产生的TLR2/TLR4二聚体在脑出血继发性炎症损伤的上游关键启动环节发挥着重要的作用,如果干预该二聚体的行程,可能对脑出血具有明显的治疗效果,同时在理论上不会降低TLR2、TLR4本身的功能, 因此,脑外伤后TLR2/TLR4二聚体是否发挥主导作用值得进一步研究。通过本组实验发现芝麻素对于TBI后脑损伤具有保护作用,未来为TBI后的治疗提供一种更好选择。

参考文献 (11)

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