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肺癌病人EGFR基因突变与相关病理和临床特征分析

张辉 胡怀远

引用本文:
Citation:

肺癌病人EGFR基因突变与相关病理和临床特征分析

    作者简介: 张辉(1981-), 男, 主治医师
    通讯作者: 胡怀远, gjhcj79ai21@163.com
  • 基金项目:

    安徽省自然科学基金项目 1408085MH190

  • 中图分类号: R734.2

Analysis of the relationship between EGFR gene mutation, and related pathological and clinical features in lung cancer patients

    Corresponding author: HU Huai-yuan, gjhcj79ai21@163.com
  • CLC number: R734.2

  • 摘要: 目的分析肺癌病人表皮生长因子受体(EGFR)基因突变与临床病理特征的关系。方法选取70例晚期或局部晚期不能手术肺癌病人,通过肺穿刺或支气管镜活检采集组织标本,采用PCR技术检测EGFR基因突变情况,并根据检测结果分为突变组、无突变组;均给予尼妥珠单抗与多西紫杉醇+顺铂化疗联合治疗;分析2组年龄、性别、吸烟史、分化程度、组织学分型、淋巴结转移、肿瘤直径等特征信息,进行多因素logistic回归分析,并比较2组疾病控制率(DCR)。结果外周血、活检组织标本检测EGFR基因突变率均为42.86%(30/70),具有良好一致性;突变组与无突变组在年龄、性别、吸烟史、分化程度、组织学分型分布方面差异均有统计学意义(P < 0.01),在淋巴结转移、肿瘤直径分布方面差异无统计学意义(P>0.05)。年龄>50岁肺癌病人EGFR基因突变率高于≤ 50岁者(P < 0.01);女性肺癌病人EGFR基因突变率高于男性(P < 0.01);无吸烟史肺癌病人EGFR基因突变率高于有吸烟史者(P < 0.01);无分化、低中分化、高分化肺癌病人EGFR基因突变率差异明显,且分化程度越高,突变率越高(P < 0.01);腺鳞癌、腺癌肺癌病人EGFR基因突变率高于大细胞癌、鳞癌(P < 0.01)。多因素分析显示,EGFR基因突变与分化程度、组织学分型独立相关(P < 0.05和P < 0.01)。EGFR突变组疗效明显优于无突变组(P < 0.01)。结论EGFR基因突变多发于第19号、21号外显子,且多见于年龄>50岁、女性、无吸烟史、分化程度较高、腺鳞癌、腺癌肺癌病人,肿瘤分化程度、组织学分型与EGFR基因突变独立相关,存在EGFR基因突变病人DCR较高,有利于临床靶向治疗的筛选。
  • 表 1  结果判读

    检测结果 突变结果 判读
    检出突变 21显子插入 在指定EGFR区域存在突变
    G719X
    19外显子缺失
    T790M
    S768I
    L858R
    未检出突变 在EGFR检测区域无突变
    -示不适用b
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    表 2  EGFR基因突变与相关病理[n;百分率(%)]

    变量 突变组
    (n=30)
    无突变组
    (n=40)
    χ2 P
    年龄/岁
      ≤50
       > 50
    3(10.00)
    27(90.00)
    29(72.50)
    11(27.50)
    26.98 <0.01
    性别
      男
      女
    4(13.33)
    26(86.67)
    33(82.50)
    7(17.50)
    32.91 <0.01
    吸烟史
      否
      是
    22(73.33)
    8(26.67)
    14(35.00)
    26(65.00)
    10.08 <0.01
    分化程度
      无分化 1(3.33) 9(22.50)
      低中分化 10(33.33) 29(72.50) 4.55 <0.01
      高分化 19(63.33) 2(5.00)
    组织学分型
      大细胞癌 2(6.67) 12(30.00)
      鳞癌
      腺鳞癌
    1(3.33)
    14(46.67)
    20(50.00)
    5(12.50)
    11.69 <0.01
      腺癌 13(43.33) 3(7.50)
    淋巴结转移
      有
      无
    3(10.00)
    27(90.00)
    7(17.50)
    33(82.50)
    0.29 > 0.05
    肿瘤直径/cm
      ≥3
       < 3
    5(16.67)
    25(83.33)
    14(35.00)
    26(65.00)
    2.91 > 0.05
    下载: 导出CSV

    表 3  预测EGFR基因突变的多因素分析

    变量 B SE Waldχ2 P OR(95%CI)
    年龄 -0.552 0.461 1.678 >0.05 0.58(0.26~0.66)
    性别 -1.026 0.502 2.339 >0.05 0.36(0.35~0.51)
    吸烟史 -1.224 0.564 3.874 >0.05 0.29(0.19~0.38)
    分化程度 1.845 0.397 16.054 <0.05 6.39(3.41~5.43)
    组织学分型 1.936 0.288 21.025 <0.01 6.93(1.02~4.07)
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    表 4  2组临床疗效比较[n;百分率(%)]

    分组 n CR PR SD PD DCR uc P
    突变组 30 4(13.33) 19(63.33) 5(16.67) 2(6.67) 28(93.33)
    无突变组 40 1(2.50) 10(25.00) 11(27.50) 18(45.00) 22(55.00) 4.26 <0.01
    合计 70 5(7.14) 29(41.43) 16(22.86) 20(28.57) 50(71.43)
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-01-21
  • 录用日期:  2019-04-27
  • 刊出日期:  2020-01-15

肺癌病人EGFR基因突变与相关病理和临床特征分析

    通讯作者: 胡怀远, gjhcj79ai21@163.com
    作者简介: 张辉(1981-), 男, 主治医师
  • 皖北煤电集团总医院 病理科, 安徽 宿州 234000
基金项目:  安徽省自然科学基金项目 1408085MH190

摘要: 目的分析肺癌病人表皮生长因子受体(EGFR)基因突变与临床病理特征的关系。方法选取70例晚期或局部晚期不能手术肺癌病人,通过肺穿刺或支气管镜活检采集组织标本,采用PCR技术检测EGFR基因突变情况,并根据检测结果分为突变组、无突变组;均给予尼妥珠单抗与多西紫杉醇+顺铂化疗联合治疗;分析2组年龄、性别、吸烟史、分化程度、组织学分型、淋巴结转移、肿瘤直径等特征信息,进行多因素logistic回归分析,并比较2组疾病控制率(DCR)。结果外周血、活检组织标本检测EGFR基因突变率均为42.86%(30/70),具有良好一致性;突变组与无突变组在年龄、性别、吸烟史、分化程度、组织学分型分布方面差异均有统计学意义(P < 0.01),在淋巴结转移、肿瘤直径分布方面差异无统计学意义(P>0.05)。年龄>50岁肺癌病人EGFR基因突变率高于≤ 50岁者(P < 0.01);女性肺癌病人EGFR基因突变率高于男性(P < 0.01);无吸烟史肺癌病人EGFR基因突变率高于有吸烟史者(P < 0.01);无分化、低中分化、高分化肺癌病人EGFR基因突变率差异明显,且分化程度越高,突变率越高(P < 0.01);腺鳞癌、腺癌肺癌病人EGFR基因突变率高于大细胞癌、鳞癌(P < 0.01)。多因素分析显示,EGFR基因突变与分化程度、组织学分型独立相关(P < 0.05和P < 0.01)。EGFR突变组疗效明显优于无突变组(P < 0.01)。结论EGFR基因突变多发于第19号、21号外显子,且多见于年龄>50岁、女性、无吸烟史、分化程度较高、腺鳞癌、腺癌肺癌病人,肿瘤分化程度、组织学分型与EGFR基因突变独立相关,存在EGFR基因突变病人DCR较高,有利于临床靶向治疗的筛选。

English Abstract

  • 肺癌是全球范围内恶性肿瘤相关死亡首位原因[1]。据相关调查[2-4],全世界每年新发病例约180万,病死病例约159万,我国新发与病死病例分别占65万、59万,是危害国民生命健康重要疾病类型。肺癌早期确诊病人通过手术治疗可获得良好预后,但75%以上病人确诊时处于疾病晚期,即使接受规范化放化疗,5年生存率仍低于15%,预后较差[5-6]。表皮生长因子受体(EGFR)是首个于肺癌中筛查出的重要驱动因子,其下游通路参与肿瘤细胞的侵袭、增殖与转移[7]。近年来随着肺癌驱动基因学发展,针对EGFR酪氨酸激酶抑制剂分子靶向技术已成为不能手术EGFR基因突变肺癌一线治疗手段,众多病人受益于此,疾病控制率得到提高,但由于个体差异,存在部分病人EGFR基因突变检测无法实施,不能为药物靶向治疗提供指导[8-9]。本研究选取70例晚期或局部晚期不能手术肺癌病人,分析EGFR基因突变与临床病理特征关系,以期为不能获取组织标本进行检测病人合理应用靶向药物提供理论依据。现作报道。

    • 选取2017年1月至2018年7月我院收治的70例晚期或局部晚期不能手术肺癌病人,其中男37例,女33例,年龄43~91岁;吸烟史34例;肺穿刺活检组织标本29例,支气管镜活检组织标本41例;鳞癌34例,腺癌36例;未分化10例,低分化16例,中分化23例,高分化21例。本研究经我院伦理委员会审核通过,符合《世界医学会赫尔辛基宣言》相关要求。

    • (1) 纳入标准:符合肺癌诊断标准[10];肿瘤TNM分期Ⅳ期病人;入组前4周未接受过相关治疗;自愿签署知情同意书;无白血病。(2)排除标准:正在参与其他研究者;合并休克病人;认知功能、精神异常者;预估生存期 < 3个月者;依从性较差者;伴有自身免疫类疾病者;不能耐受活检者;临床资料不完整者;不能获得足够组织标本者。

    • 耐高温塑料染色架(福州迈新,RAK-2001);实时荧光定量PCR仪(Roche,Cobas Z480);基因分析仪ABI3100型(美国ABI公司);核酸蛋白定量仪(NanoDrop 2000);电热恒温水箱CU600型(海门市其林贝儿公司);RM2135型石蜡组织切片机、ST5020型染色机、EG1140H型包埋机、DM1000型显微镜、PELORISⅡ型脱水机,均购于德国Leica。

    • 血清/血浆游离DNA试剂盒(武汉海吉力生物科技有限公司);EGFR基因突变检测试剂盒(武汉海吉力生物科技有限公司);石蜡标本组织DNA提取试剂盒(杭州迅捷生物技术有限公司);苏木精、中性树胶、伊红(北京索莱宝科技有限公司);枸橼酸组织抗原修复液(福州迈新MVS-0100/0101,0.01 mol/L,pH=6.0±0.01);Taq DNA聚合酶与阳性质控品(南京欧凯生物)。

    • 采集病人10 mL外周静脉血标本,置于抗凝管中,2 h内按照两级离心法离心,以血清/血浆游离DNA试剂盒抽提DNA,以核酸蛋白定量仪测定抽提DNA浓度,OD260/OD230>2.0,OD260/OD280:1.8~2.0。以EGFR基因突变检测试剂盒检测EGFR基因突变情况。

    • 活检组织标本切片应用乙醇进行脱水,石蜡包埋,切片,厚度控制在4~5 μm,中性树胶封片。

    • 取10片石蜡切片,按临床样品基因组DNA小量提取试剂盒提取DNA,应用分光光度计测量浓度,要求DNA样本浓度>20 ng/mL,总量>200 ng。

    • (1) 取出Taq DNA聚合酶与阳性质控品,震荡混匀待用;(2)取42.3 μL待测DNA样品,加入42.3 μL纯化水、2.7 μL Taq DNA聚合酶、42.3 μL阳性质控品,漩涡器混匀,快速离心15 s;(3)取5 μL混匀的DNA样品,靠PCR管上管壁加入8联反应条中,盖好管盖,离心处理;(4)置于实时荧光定量PCR仪,若不能及时上机,可在4 ℃冰箱或冰水混合物中保存PCR反应条,12 h内上机;(5)应用套式PCR扩增EGFR基因第19、21号外显子,第19号外显子上下游外、上下游内引物序列分别为:5′-AAT ATC AGC CTT AGG TGC G-3′、5′-CCA GTA ATT GCC TGT TTC C-3′、5′-CTG GGC AGC ATG TGG CA-3′、5′-ATG TGG AGA TGA GCA GGG TCT-3;第21号上下游外、上下游内引物序列分别为:5′-GTT CGC CAG CCA TAA GTC C-3′、5′-TCA TTC ACT GTC CCA GCA AG-3′、5′-TTC CCA TGA TGA TCT GTC CCT C-3′、5′-CAG CCT GGT CCC TGG TGT C-3′。第1~3阶段扩增条件分别为:1个循环、95 ℃ 5 min;15个循环、72 ℃ 20 s、95 ℃ 25 s、64 ℃ 20 s;31个循环、60 ℃ 35 s、93 ℃ 25 s、72 ℃ 20 s。第三阶段60 ℃时收集HEX、FAM荧光信号,反应结束实时荧光定量PCR仪自动输出扩增结果。

    • 每次检测最多30个样本,均加入EGFR阴性对照与突变对照,两者均有效则运行有效,若其一与工作液反应结果无效,整轮结果均视为无效,重新进行检测。

    • 分为在EGFR检测区域存在突变与无突变2种结果(见表 1)。

      检测结果 突变结果 判读
      检出突变 21显子插入 在指定EGFR区域存在突变
      G719X
      19外显子缺失
      T790M
      S768I
      L858R
      未检出突变 在EGFR检测区域无突变
      -示不适用b

      表 1  结果判读

    • 所有入组病人均给予尼妥珠单抗与多西紫杉醇+顺铂化疗联合治疗:(1)75 mg/m2多西紫杉醇(广东星昊药业有限公司,国药准字H20178012)与500 mL 5%葡萄糖混合后静滴3 h左右,d1、d8;75 mg/m2顺铂(广东岭南制药有限公司,国药准字H20143124)与250 mL 0.9%氯化钠溶液混合后静滴1 h左右,d1~3。(2)化疗同期予以尼妥珠单抗(百泰生物药业有限公司,国药准字S20080001),第1~6周为1次/周静滴,第7周起2次/周静滴,剂量均为200毫克/次,3周为1个周期。2组均为2个治疗周期。

    • 治疗后根据实体瘤疗效评价标准划分疗效为完全缓解(病灶完全消失,CR)、部分缓解(病灶缩小>30%,PR)、稳定(病灶缩小≤30%或增大 < 20%,SD)、进展(病灶增大≥20%,PD)。疾病控制率(DCR)=(SD例数+PR例数+CR例数)/总例数×100%。

    • (1) EGFR基因突变情况。(2)根据EGFR基因突变情况分为突变组、无突变组,分析2组年龄、性别、吸烟史、分化程度、组织学分型、淋巴结转移、肿瘤直径等特征信息。(3)比较2组DCR。

    • 采用χ2检验、秩和检验和logistic回归分析。

    • 外周血与活检组织标本均检测到EGFR基因突变30例,两者EGFR基因突变率均为42.86%(30/70),具有良好一致性。其中活检组织标本检测发现15例第19号外显子突变,17例第21号外显子突变,第19与21号外显子均存在突变2例。

    • 突变组与无突变组在年龄、性别、吸烟史、分化程度、组织学分型分布方面差异均有统计学意义(P<0.01),在淋巴结转移、肿瘤直径分布方面差异无统计学意义(P>0.05)(见表 2)。年龄>50岁肺癌病人EGFR基因突变率高于≤50岁者(P<0.01);女性肺癌病人EGFR基因突变率高于男性(P<0.01);无吸烟史肺癌病人EGFR基因突变率高于有吸烟史者(P<0.01);无分化、低中分化、高分化肺癌病人EGFR基因突变率差异明显,且分化程度越高,突变率越高(P<0.01);腺鳞癌、腺癌肺癌病人EGFR基因突变率高于大细胞癌、鳞癌(P<0.01)。

      变量 突变组
      (n=30)
      无突变组
      (n=40)
      χ2 P
      年龄/岁
        ≤50
         > 50
      3(10.00)
      27(90.00)
      29(72.50)
      11(27.50)
      26.98 <0.01
      性别
        男
        女
      4(13.33)
      26(86.67)
      33(82.50)
      7(17.50)
      32.91 <0.01
      吸烟史
        否
        是
      22(73.33)
      8(26.67)
      14(35.00)
      26(65.00)
      10.08 <0.01
      分化程度
        无分化 1(3.33) 9(22.50)
        低中分化 10(33.33) 29(72.50) 4.55 <0.01
        高分化 19(63.33) 2(5.00)
      组织学分型
        大细胞癌 2(6.67) 12(30.00)
        鳞癌
        腺鳞癌
      1(3.33)
      14(46.67)
      20(50.00)
      5(12.50)
      11.69 <0.01
        腺癌 13(43.33) 3(7.50)
      淋巴结转移
        有
        无
      3(10.00)
      27(90.00)
      7(17.50)
      33(82.50)
      0.29 > 0.05
      肿瘤直径/cm
        ≥3
         < 3
      5(16.67)
      25(83.33)
      14(35.00)
      26(65.00)
      2.91 > 0.05

      表 2  EGFR基因突变与相关病理[n;百分率(%)]

    • 以单因素分析差异有统计学意义的变量为自变量进行多因素logistic回归分析,结果显示,EGFR基因突变与分化程度、组织学分型独立相关(P<0.05和P<0.01)(见表 3)。

      变量 B SE Waldχ2 P OR(95%CI)
      年龄 -0.552 0.461 1.678 >0.05 0.58(0.26~0.66)
      性别 -1.026 0.502 2.339 >0.05 0.36(0.35~0.51)
      吸烟史 -1.224 0.564 3.874 >0.05 0.29(0.19~0.38)
      分化程度 1.845 0.397 16.054 <0.05 6.39(3.41~5.43)
      组织学分型 1.936 0.288 21.025 <0.01 6.93(1.02~4.07)

      表 3  预测EGFR基因突变的多因素分析

    • EGFR突变组疗效明显优于无突变组(P<0.01)(见表 4)。

      分组 n CR PR SD PD DCR uc P
      突变组 30 4(13.33) 19(63.33) 5(16.67) 2(6.67) 28(93.33)
      无突变组 40 1(2.50) 10(25.00) 11(27.50) 18(45.00) 22(55.00) 4.26 <0.01
      合计 70 5(7.14) 29(41.43) 16(22.86) 20(28.57) 50(71.43)

      表 4  2组临床疗效比较[n;百分率(%)]

    • EGFR位于7号染色体上,基因长约110 kb,属于人EGFR家族中一个跨膜酪氨酸激酶受体,其编码分为3个区域:细胞内、跨膜区酪氨酸激酶活性区、细胞外配体结合区[11-12]。EGFR与细胞外配体于结合区结合后,可激活下游一系列信号通路,从而促进细胞分化、生长,对正常细胞存活与功能发挥具有重要调控作用[13]。但既往研究[14-15]发现,肺癌病人体内存在EGFR过表达现象,且与EGFR基因突变有关。而EGFR共有26个外显子,目前已发现18~21外显子为主要基因突变点:18外显子突变,19外显子缺失碱基,20外显子碱基插入或突变,21外显子突变[16]。突变可造成EGFR下游信号通路异常,细胞增殖、转移、凋亡失去调控,最终发生肿瘤[17-18]。ANTONICELLI等[19]研究指出,EGFR基因突变90%左右发生于第19、21外显子上。杨长绍等[20]研究显示,第18、20号外显子突变发生率较低,分别为3.2%、2.2%。本研究结果显示,30例EGFR基因突变均发生于第19号、21号外显子,与以上报道主要基因突变点相符。且本研究还发现,外周血与活检组织标本检测到EGFR基因变率均为42.86%,均有良好一致性,这可为晚期不能耐受组织活检病人EGFR基因突变的检测提供一种思路。

      影响EGFR基因突变因素较多,如吸烟史、年龄、组织分型、性别等,国内外学者对此进行了大量研究。如DASGUPTA等[21]报道显示,从未吸烟肺癌病人EGFR基因突变率较高。LI等[22]对中国208例肺癌病人进行调查发现,女性、非吸烟者、腺癌病人EGFR基因突变率较高。张著学等[23-24]报道指出,高分化程度肺癌病人EGFR基因突变率高于未分化或低分化病人。本研究结果显示,年龄>50岁、女性、无吸烟史、分化程度较高肺癌病人EGFR基因突变率较高,与以上研究结果相符。在恶性肿瘤生物学行为方面,组织病理学研究较分子生物学研究经济性高,且更有效率,因此EGFR基因突变与组织学分型关系始终是临床研究热点。丁昊等[25]报道显示,EGFR基因突变多见于腺鳞癌。杨宁等[26]研究指出,肺腺癌EGFR基因突变率高于其他类型肺癌。SHOLL等[27]指出,EGFR基因突变多见于微乳头腺癌,浸润性黏液腺癌、实体状腺癌较低。本研究结果显示腺鳞癌EGFR基因突变率最高。推测不同组织学分型肺癌可能受基因突变机制影响而存在异质性。梁颖等[28]研究对此进行进一步探讨,发现肺癌病人EGFR基因突变不一致率较高。因此临床进行EGFR基因突变检测时,应尽量避免应用含有实性或黏液成分较多腺癌标本,以提高EGFR基因突变检出率。以往大多学者研究多局限于此,本研究在此基础上进行深入分析发现,EGFR基因突变与年龄、性别、吸烟史无明显相关性,而与分化程度、组织学分型独立相关(P<0.05),提示肺癌病人肿瘤分化程度、组织学分型才为预测EGFR基因突变有价值参考指标。

      此外,以往研究[29]表明,EGFR络氨酸激酶抑制剂对EGFR基因突变病人有效,而对EGFR未突变病人基本无效,这是临床制定靶向性治疗方案重要依据。刘冰等[30]研究发现,肺癌病人应用EGFR-TKI类药物治疗时,突变阳性者DCR明显优于突变阴性者,其原因与EGFR基因突变对酪氨酸激酶抑制剂敏感性较高有关。本研究结果显示,突变组DCR(93.33%)高于无突变组(55.00%)(P<0.05),提示以EGFR基因突变为依据,选用针对性EGFR络氨酸激酶抑制剂能提高疾病控制率。但EGFR表达在预测靶向治疗对病人生存率方面的价值仍存在争议。张旭刚等[31]研究指出,EGFR基因突变是肺腺癌病人远期生存率独立影响因素。张童童等[32]对比了肺癌常见驱动基因指导下靶向治疗的效果,发现靶向治疗对EGFR基因突变病人无进展生存期无显著影响。目前普遍认同的是,EGFR基因突变是EGFR络氨酸激酶抑制剂应用指征,能提高短期疗效,但对疾病长远影响尚需长期随访进行验证。另临床确诊肺癌病人TNM可分为Ⅰ~Ⅳ期,Ⅰ~Ⅲ期常采用以手术为主综合治疗方案,Ⅳ期主要采用保守治疗方法,故本研究仅探析TNM Ⅳ期肺癌病人EGFR基因突变相关情况,而TNM Ⅰ~Ⅲ期病人是否存在此规律,有待扩大样本量深入分析。

      综上所述,EGFR基因突变多发于第19号、21号外显子,且多见于年龄>50岁、女性、无吸烟史、分化程度较高、腺鳞癌、腺癌肺癌病人,肿瘤分化程度、组织学分型与EGFR基因突变独立相关,存在EGFR基因突变病人DCR较高,有利于临床靶向治疗的筛选。

参考文献 (32)

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