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研究[1]表明，长期吸入大气细颗粒物(particulate matters，PM)与人类心血管疾病、肺部疾病的发生及非传染性疾病的死亡率呈正相关关系。2012年WHO研究表明，空气污染是世界范围内死亡率及致残率的主要原因之一，每年约有370万的过早死亡与空气污染有密切关系[2]。PM2.5是指大气中空气动力学当量直径小于或等于2.5 μm的细颗粒物。因其表面能够吸附各种有毒有害物质，在空气中停留时间长，对人体健康的影响更大。PM2.5经呼吸系统进入人体后，由肺泡巨噬细胞通过Toll样受体(TLRs)识别、吞噬，激活氧化反应、炎症反应及自噬凋亡等[3-5]。本研究对来自美国和中国不同地区的PM2.5对THP1巨噬细胞TLR4表达及氧化应激水平的可能影响进行初步探讨。现作报道。
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人急性单核细胞白血病细胞THP1细胞株购自上海中科院细胞库，来自于美国ATCC菌种保存中心。表达红色荧光蛋白的结核分枝杆菌减毒株(H37ra-Red)由本实验室构建制备。PM2.5来自中国北京地区和美国巴尔的摩地区，将其分别溶于PBS，依据相关参考文献和预实验确定浓度为2 mg/mL、8 mg/mL，4 ℃避光保存。
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培养基RPMI-1640(GIBCO公司，货号：8117175)，胎牛血清(天津康源生物有限公司)，佛波醇酯(PMA, SIGMA公司，货号：p1585)、荧光素标记抗体TLR4(Biolegend公司，货号：312816)，活性氧(ROS)检测试剂盒(Solarbio公司，货号：CA1410)，逆转录试剂盒(Thermo公司，货号：00422714)，荧光定量染料试剂盒(Takara公司，货号：RR820A)，流式细胞仪FACS Calibur(美国Becton Dickinson公司)，荧光定量PCR仪(ABI公司)，荧光显微镜(蔡司公司)。
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用含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培养液将THP1细胞制成密度为5×105 /mL的细胞悬液，接种于6孔板中，每孔2 mL完全培养液，加入80 ng/mL PMA刺激24 h后，细胞贴壁生长，形态变大、变不规则，即为巨噬细胞，弃去旧培养液，每孔加2 mL新完全培养液，将两个地区2 mg/mL、8 mg/mL的PM2.5各取50 μL加至各孔细胞中，使每孔PM2.5的终浓度为50 μg /mL、200 μg /mL，阴性对照组加等量的PBS。
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将诱导好的巨噬细胞，按照未处理组、阴性对照组、北京地区50 μg/mL PM2.5组、北京地区200 μg/mL PM2.5组、巴尔的摩地区50 μg/mL PM2.5组、巴尔的摩地区200 μg/mL PM2.5组进行处理。将6孔板放于37 ℃ CO2培养箱中培养24 h后，收集各孔待测细胞，调整每组细胞密度为1×106 /mL，分别取50 μL细胞悬液，各管加入1 μL抗人TLR4-APC荧光素标记抗体，室温避光染色15 min后，用流式细胞仪FACS Calibur及Cellquest软件检测TLR4的表达情况。
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同上述处理方法，各组PM2.5染毒巨噬细胞24 h后，未处理组不做处理，其余各孔加入按1:5 000用不完全RPMI-1640培养液稀释的DCFH-DA 1 mL，于37 ℃ CO2培养箱孵育20 min后，用流式细胞仪FACS Calibur及Cellquest软件检测ROS的产生情况。
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各组PM2.5刺激巨噬细胞24 h后，提取RNA，逆转录cDNA，用荧光定量PCR技术检测细胞内Nrf2 mRNA表达，使用2-△△CT法分析目的基因mRNA的相对表达量。
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采用方差分析和q检验。
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低浓度(50 μg/mL)PM2.5刺激24 h后，北京地区和巴尔的摩地区组细胞TLR4表达率均较阴性对照组(50 μL PBS)升高(P < 0.05)；高浓度(200 μg/mL)PM2.5刺激24 h后，两地区组细胞TLR4表达率均较阴性对照组和低浓度组降低(P < 0.05)。北京地区与巴尔的摩地区同浓度PM2.5组TLR4表达率之间差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 1)。
PM2.5浓度/(μg/mL) 北京地区/% 巴尔的摩地区/% t P 0 22.63±0.57 22.63±0.57 0.00 > 0.05 50 26.27±4.41* 24.37±0.57* 0.74 > 0.05 200 20.97±0.96*# 17.67±2.01*# 2.57 > 0.05 F 14.16 23.16 — — P < 0.01 < 0.01 — — MS组内 69.323 36.286 — — q检验：与PM2.5浓度0组比较* P < 0.05；与PM2.5浓度50 μg/mL组比较# P < 0.05 表 1 两地区不同浓度PM2.5刺激24 h后巨噬细胞TLR4的表达率比较(n=3；x±s)
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低浓度PM2.5刺激24 h后，北京地区和巴尔的摩地区组细胞内ROS水平均高于阴性对照组(P < 0.05)，且巴尔的摩地区细胞内ROS水平明显高于北京地区组(P < 0.01)。高浓度PM2.5刺激24 h后，北京地区组细胞内ROS水平均低于阴性对照组和低浓度组(P < 0.05)，而巴尔的摩地区组高于阴性对照组(P < 0.05)，且巴尔的摩地区细胞内ROS水平明显高于北京地区组(P < 0.01)(见表 2)。
PM2.5浓度/(μg/mL) 北京地区 巴尔的摩地区 t P 0 274.33±3.07 274.33±3.07 0.00 > 0.05 50 321.00±4.34* 386.67±5.63* 16.01 < 0.01 200 224.00±7.86*# 337.33±9.50*# 15.92 < 0.01 F 13.43 23.16 — — P < 0.01 < 0.01 — MS组内 6 823 9 297 — — q检验：与PM2.5浓度0组比较* P < 0.05；与PM2.5浓度50 μg/mL组比较# P < 0.05 表 2 两地区不同浓度PM2.5刺激24 h后巨噬细胞ROS产生情况比较(n=3；x±s)
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北京地区和美国巴尔的摩地区50 μg/mL PM2.5刺激24 h后，细胞Nrf2 mRNA的2-△△CT值与内参β-actin的比值，均较对照组升高(1.9 vs 1.0，0.9 vs 1.0，n=3，P < 0.05)；而两地区200 μg/mL PM2.5刺激24 h后，细胞Nrf2 mRNA的2-△△CT值与内参β-actin比值，均较对照组降低(1.9 vs 1.0及0.9 vs 1.0，n=3，P < 0.05)。
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在空气污染颗粒物中，PM2.5对人类健康的危害最大，其可逃避机体上呼吸道黏膜防御系统的过滤清洁作用，深入至肺泡，与呼吸道上皮细胞和肺泡巨噬细胞等直接接触。PM2.5与巨噬细胞直接接触后，巨噬细胞可通过伪足、突触来包围PM2.5，将其摄入胞内，或者细胞表面的一些病原体模式识别受体识别病原体的信息，将信号传入胞内，激活信号转导分子，然后通过分泌细胞因子、产生ROS、激发溶酶体产生溶菌酶等固有免疫反应来发挥直接的杀菌作用，也可以通过将抗原信息进行提交作为抗原提呈细胞，启动适应性免疫反应[6-7]。
PM2.5能导致巨噬细胞噬菌能力下降。有学者[8]研究发现，PM2.5可降低小鼠AM对肺炎链球菌的内化和杀伤作用。舒娟等[9]研究也表明PM2.5可明显降低健康小鼠和慢性肺阻塞小鼠AM吞噬大肠杆菌的能力，吞噬能力下降近50%。但其机制尚无明确证据。本研究结果显示，来自中国和美国两个不同地区的PM2.5，均可对巨噬细胞TLR4、Nrf2表达水平，以及胞内ROS产生水平产生明显影响，低浓度PM2.5可促进巨噬细胞TLR4表达，升高氧化应激水平。MIYATA等[10]研究也证实巨噬细胞经TLR4识别PM2.5，通过激活P38/MAPK通路而活化NADPH氧化酶，产生大量ROS，启动固有免疫反应，并且ROS的产生也会促进TLR4的表达，使TLR4介导氧化应激反应效应增强。TLR4是巨噬细胞识别病原体的关键受体类型，对抵抗外界病原体入侵发挥重要作用[11]。ROS则会氧化核酸、破坏蛋白质的结构及功能，改变入侵病原菌自我增殖的结构，发挥直接杀菌作用。
本研究结果还显示，高浓度PM2.5可降低巨噬细胞TLR4和Nrf2表达水平。推测高浓度的PM2.5可能通过降低Nrf2表达水平，抑制细胞对氧化应激产物的清除能力。大量ROS会与细胞内大分子物质核酸、蛋白质等发生反应，导致这些大分子物质结构损伤、功能丧失，细胞抗氧化能力下降甚至使氧化平衡紊乱。炎症反应功能作用的发挥是由致炎因子与抗炎因子平衡决定的，因此，细胞内炎症因子紊乱会使炎症反应失衡，细胞抵抗外界刺激能力下降，这可能是高浓度PM2.5诱发巨噬细胞损伤的机制之一[12-13]。
本研究中，PM2.5分别来自于中国北京地区及美国巴尔的摩地区，这两个地区PM2.5刺激巨噬细胞24 h后，美国巴尔的摩地区ROS的产生均较中国北京地区高，我们推测这些差异的存在可能是由于两个地区PM2.5成分的不同，巨噬细胞对抗PM2.5入侵的机制不同。每个地区不同时段及不同地区的PM2.5的成分是不同的，因此PM2.5对人类健康产生的损害机制较为复杂，需要进行更多的研究来探讨其差异机制。
PM2.5对THP1巨噬细胞TLR4表达及氧化应激水平的影响
Effect of PM2.5 on the TLR4 expression and oxidative stress levels in THP1 macrophages
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摘要:
目的探讨大气细颗粒物（particulate matters，PM）2.5对THP1巨噬细胞TLR4表达及氧化应激水平的影响。 方法THP1巨噬细胞分别给予来自中国北京、美国巴尔的摩地区的PM2.5刺激24 h，检测巨噬细胞TLR4、Nrf2表达水平，以及细胞内活性氧（ROS）产生水平。 结果与对照组比较，低浓度（50 μg/mL）北京地区和巴尔的摩地区PM2.5刺激24 h后，细胞TLR4、Nrf2表达水平与细胞内ROS产生水平均升高（P < 0.05）。与对照组比较，高浓度（200 μg/mL）北京地区和巴尔的摩地区PM2.5刺激24 h后，细胞TLR4表达水平、Nrf2表达水平均降低（P < 0.05），北京地区组细胞内ROS产生水平降低（P < 0.05），巴尔的摩地区组细胞内ROS升高（P < 0.05）。 结论低浓度PM2.5可促进巨噬细胞TLR4表达，升高氧化应激水平，高浓度PM2.5可降低巨噬细胞TLR4表达，降低氧化应激水平。 Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of atmospheric fine particulate matters(PM)2.5 on TLR4 expression and oxidative stress levels in THP1 macrophages. MethodsThe THP1 macrophages from Beijing China and Baltimore United States were stimulated by PM2.5 for 24 h.The expression levels of TLR4 and Nrf2 in macrophages and degree of intracellular reactive oxygen species(ROS) production were detected. ResultsThe expression levels of TLR4 and Nrf2 and degree of intracellular ROS production significantly increased after low concentration(50 μg/mL) PM2.5 from Beijing and Baltimore stimulating for 24h compared with the control group(P < 0.05).Compared with the control group, after the cells were stimulated using high concentration(200μg/mL) PM2.5 from Beijing and Baltimore for 24 h, the expression levels of TLR4 and Nrf2 decreased, the intracellular ROS production in Beijing area decreased(P < 0.05), and the intracellular ROS production in Baltimore increased(P < 0.05). ConclusionsThe low concentration of PM2.5 can promote the expression of TLR4 in macrophages, and increase the level of oxidative stress.The high concentration of PM2.5 can reduce the expression of TLR4 and level of oxidative stress in macrophages. -
Key words:
- macrophage /
- particulate matters 2.5 /
- reactive oxygen species
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表 1 两地区不同浓度PM2.5刺激24 h后巨噬细胞TLR4的表达率比较(n=3；x±s)
PM2.5浓度/(μg/mL) 北京地区/% 巴尔的摩地区/% t P 0 22.63±0.57 22.63±0.57 0.00 > 0.05 50 26.27±4.41* 24.37±0.57* 0.74 > 0.05 200 20.97±0.96*# 17.67±2.01*# 2.57 > 0.05 F 14.16 23.16 — — P < 0.01 < 0.01 — — MS组内 69.323 36.286 — — q检验：与PM2.5浓度0组比较* P < 0.05；与PM2.5浓度50 μg/mL组比较# P < 0.05 
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表 2 两地区不同浓度PM2.5刺激24 h后巨噬细胞ROS产生情况比较(n=3；x±s)
PM2.5浓度/(μg/mL) 北京地区 巴尔的摩地区 t P 0 274.33±3.07 274.33±3.07 0.00 > 0.05 50 321.00±4.34* 386.67±5.63* 16.01 < 0.01 200 224.00±7.86*# 337.33±9.50*# 15.92 < 0.01 F 13.43 23.16 — — P < 0.01 < 0.01 — MS组内 6 823 9 297 — — q检验：与PM2.5浓度0组比较* P < 0.05；与PM2.5浓度50 μg/mL组比较# P < 0.05
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