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糖尿病与痛风都是体内代谢异常引起的疾病，两者有共同的发病基础。据不完全统计[1-2]，糖尿病病人中伴有痛风者占3%~35%，而伴有高尿酸血症者约占25%，二病并存加重了对肾脏的损害，最终可导致肾衰竭。炎症因子在糖尿病与痛风的发病机制中起重要的介导作用。高迁移率簇蛋白B1(HMGB1)是强大的炎细胞因子，其可诱导单核及巨噬细胞产生多种细胞因子，并能显著上调巨噬细胞/单核细胞表达。在炎症的级联反应中，HGMB1起重要作用[3]。转录因子FOXOL在肥胖和胰岛素抵抗糖尿病之间起重要连接作用，参与多种生理活动，包括细胞周期的调节和葡萄糖内环境的稳定，而高血糖可促进FOXO3a的表达，对糖尿病导致的其他器官损害有一定影响[4]。本研究探讨萆苓祛痛方(萆苓方)对糖尿病痛风大鼠肾脏中HMGB1及FOXOL表达的影响，分析其作用机制。现作报道。
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选取清洁级健康SD雄性大鼠50只，体质量(200±20)g，购于武汉大学动物实验中心，SCXK(鄂) 2008-0004。大鼠饮食、活动正常，皮毛光泽，反应灵敏。适应性喂养1周，室内温度保持在25 ℃左右。
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萆苓方由安徽中医药大学第一附属医院药物制剂中心提供，方剂组成：萆薢、土茯苓、黄柏、怀牛膝、泽泻、车前草、当归、威灵仙、虎杖、苍术、全蝎等。盐酸吡格列酮(江苏德源药业股份有限公司，批号：H20110048)；吲哚美辛片(上海新黄河制药有限公司，批号：H31020148；HMGB1(CSJ公司，批号：000013)；FOXO3a(Bioworid公司，批号：AA66135)；尿酸钠(上海源叶生物科技有限公司，批号：S16N8146625)；吐温80(上海源叶生物科技有限公司，批号：M19A6K2526)；链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司，批号：20160805426)。
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血糖监测仪(美国强生公司，稳豪型)；特定蛋白仪(日本西门子公司，BN ProSpec System)；电泳仪(上海天能科技有限公司，EPS300型)；高速台式冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司，JW-3021HR型)；微量移液器(德国艾本德股份公司，Research plus)；全自动生化分析仪(日本株式会社，日立7600型)。
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大鼠50只适应性喂养1周后，随机选取正常对照组8只，不做处理，正常饲养。其他大鼠进行实验造模，造模前禁食12 h，给予高脂饲料进食(蛋白质15%，脂肪20%，碳水化合物50%，胆固醇5%，猪油10%)，喂养4周后，禁食10 h，一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg(临用前以pH 4.5的0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液新鲜配制)，72 h后尾静脉取血测血糖，以血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠造模成功。造模不成功大鼠追加三分之一STZ量。观察大鼠进食、饮水量和精神状态、体形毛色，期间剔除造模不成功大鼠。
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取250 mg尿酸钠加入0.9%氯化钠溶液45 mL，再加入5 mL聚山梨酯-80，加热搅拌配成50 g/L尿酸钠溶液。糖尿病造模成功后第4天，除正常对照组外，每只大鼠均以右踝关节外侧后方为穿刺点，针口斜面超前上方与胫骨成45°角穿入踝关节腔，以4号针头向关节腔注入0.2 mL尿酸钠溶液，以关节鼓起为注入标准，诱导痛风模型。剔除造模不成功大鼠。
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将造模成功的大鼠按照数字表法随机分为模型组、萆苓方组、吲哚美辛组和吡格列酮组，各8只。萆苓方组按10 g/kg灌胃给予萆苓方，吡格列酮组按15 mg/kg灌胃给予盐酸吡格列酮，吲哚美辛组按10 mg/kg灌胃给予吲哚美辛；正常对照组和模型组灌胃等量0.9%氯化钠溶液，每天1次，连续给药21 d。
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大鼠连续给药21 d后，禁食10 h。腹主动脉采血，测定血糖、尿酸、血脂。以3%戊巴比妥钠10 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速开腹，取出肾脏，放置-80 ℃液化氮中保存，采用Western blotting法检测大鼠肾脏HMGB1及FOXOL蛋白表达，计算蛋白相对表达量。
剪取大鼠肾脏组织，每个样品约100 mg，加入RIPA细胞裂解液1 mL进行裂解，12 000 r/min离心10 min，收集上清液。按照SDS-PAGE凝胶配制样品处理，严格按照说明书操作。转膜完成后，立即将PVDF膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗5 min，洗去转膜液。加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动, 室温封闭2 h。用一抗稀释液进行稀释，HMGB1抗体属性为兔抗1:1 000稀释(10%分离胶)，FOXO3a抗体属性为兔抗1:500稀释(10%分离胶)，4 ℃缓慢摇动孵育过夜。加入洗涤液PBST，每次洗涤10 min，共洗涤3次。按照1:15 000比例用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育2 h。加入洗涤液PBST，每次洗涤10 min，洗涤3次。蛋白检测参考说明书，使用ECL超敏发光试剂盒检测。图片灰度值分析采用北京科创锐新生物凝胶成像系统进行胶片条带分析。
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采用方差分析和q检验。
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与正常对照组比较，模型组大鼠血糖、血尿酸和三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)均明显升高(P < 0.01)；与模型组比较，萆苓方组、吡格列酮组和吲哚美辛组大鼠血糖、血尿酸均下降(P < 0.05~P < 0.01)，萆苓方组和吡格列酮组TG、TC、LDL-C亦均下降(P < 0.05~P < 0.01)，吲哚美辛组TC、LDL-C均下降(P < 0.05和P < 0.01)(见表 1)。
分组 血糖/(mmol/L) 血尿酸/(μmol/L) TG/(mg/d) TC/(mmol/L) LDL-C/(mmol/L) 正常对照组 5.76±0.80 73.2±7.31 0.43±0.12 1.87±0.25 0.54±0.11 模型组 17.05±3.14** 144.20±25.35** 2.16±1.10** 3.10±1.10** 1.15±0.74** 萆苓方组 13.88±2.51**# 90.18±22.04## 1.54±1.06## 1.64±0.24## 0.51±0.07## 吡格列酮组 12.71±2.18**# 96.38±14.20## 0.97±0.29## 1.42±0.26## 0.45±0.14## 吲哚美辛组 15.19±1.28**# 92.86±17.25## 2.18±1.67 1.96±0.46# 0.63±0.25## F 42.859 36.875 44.028 52.754 4.98 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.685 0.724 0.669 0.112 0.129 q检验：与正常对照组比较** P < 0.01；与模型组比较# P < 0.05，## P < 0.01 表 1 各组大鼠血糖、血脂及血尿酸水平比较(x±s；n=8)
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与正常对照组比较，模型组、萆苓方组、吡格列酮组和吲哚美辛组大鼠肾组织HMGB1、FOXO3表达量均明显升高(P < 0.01)；与模型组比较，萆苓方组、吡格列酮组和吲哚美辛组HMGB1、FOXO3相对表达量均明显降低(P < 0.01)；吡格列酮组HMGB1、FOXO3表达量亦均低于萆苓组和吲哚美辛组(P < 0.05)，而萆苓组和吲哚美辛组HMGB1、FOXO3表达量差异均无统计学意义(P＞0.05)(见图 1、表 2)。
图 1 各组大鼠HMGB1和FOXO3相对表达量
分组 HMGB1 FOXO3 正常对照组 0.42±0.03 0.32±0.02 模型组 1.11±0.04** 1.05±0.05** 萆苓方组 0.74±0.04**##△ 0.72±0.03**##△ 吡格列酮组 0.59±0.06**## 0.49±0.01**## 吲哚美辛组 0.76±0.04**##△ 0.74±0.03**##△ F 56.328 47.889 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.251 0.168 q检验：与正常对照组比较** P < 0.01；与模型组比较## P < 0.01;与吡格列酮组比较△ P < 0.05 表 2 各组大鼠HMGB1和FOXO3相对表达量比较(x±s；n=8)
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目前糖尿病合并痛风的患病率不断上升，探寻其发病机制，研究中药解决糖尿病痛风及并发症问题一直是医学工作者研究的重点课题[1-2]。HMGB1在人体内广泛分布，正常情况下存在于细胞核中，但在某些特殊条件下，HMGB1能通过活化的巨噬细胞和单核细胞等炎症细胞的主动分泌和坏死细胞的被动释放转移至细胞外，参与多种疾病及炎症的发生发展。近年来有报道[3]认为HMGB1可能是导致肾脏损害的潜在因素，它主要表达于肾组织的系膜细胞、血管内皮细胞核肾小管上皮细胞的胞核内。还有学者[4]观察到在新诊断2型糖尿病病人中HMGB1活性上调，提示HMGB1的炎性作用在糖尿病初期已显现。本研究结果显示，造模后模型组大鼠HMGB1较正常对照组显著升高，予萆苓方后，上述指标明显下降。提示HMGB1参与糖尿病痛风的发病过程，是重要的炎症介质，萆苓方可显著降低HMGB1的高表达，此可能为其治疗糖尿病痛风的机理之一。
FOXO3a属于叉头蛋白FOXO家族成员，在调节机体多种病理生理过程，如血管生成、活性氧代谢、免疫反应及转录活性、调控下游基因等方面有重要作用。而高血糖、高血脂可以促进FOXO3a的过表达，并在其他器官损害中也发挥作用[5-9]。本研究结果显示，糖尿病痛风模型大鼠肾组织FOXO3a蛋白表达水平较正常对照组明显升高，用药8周后，萆苓组FOXO3a表达明显下降，提示FOXO3a参与糖尿病痛风的发病过程，而萆苓方可显著干预上述过程。
本研究结果亦显示，模型组大鼠血糖、血脂和血尿酸水平均较正常对照组明显升高，而萆苓方组大鼠上述指标均较模型组明显降低，提示萆苓方有良好的降糖降脂、降低血尿酸作用，可通过多途径、多靶点发挥降糖、降尿酸作用，与我们以往的研究结论一致[10]。同步治疗，多靶点、多途径干预炎症因子，对降糖降脂、降低尿酸及延缓并发症有重要作用。
笔者从长期的临床实践中注意到糖尿病痛风并存的病机特点是湿浊毒瘀互结致病情反复，治疗上强调祛湿泻浊解毒，化瘀通络止痛，萆苓方正是在祛湿解毒的基础上加强活血通络药。方中土茯苓、萆薢、泽泻、薏苡仁利湿泻浊；黄柏、苍术、清热燥湿解毒；虎杖活血解毒定痛；威灵仙祛风湿、通经络、止疼痛；当归、牛膝、全蝎活血止痛，引湿下行，共奏泻浊解毒，活血化瘀，通络止痛之功。药理研究[11]证实当归提取物抑制脂多糖诱导的单核巨噬细胞释放HMGB1，并呈剂量依赖性，部分可通过干扰HMGB1的细胞质的转位实现。还有学者[12]报道，从虎杖中分离提取的大黄6-O-B-D葡萄糖苷, 可抑制脓毒症小鼠HMGB1的释放，提示某些中药可抑制HMGB1的过度释放。此外，牛膝、土茯苓、薏苡仁、泽泻、车前草均有抗炎利尿，消炎抑菌，促进尿酸排泄之功。威灵仙、虎杖、黄柏有消炎抗菌之效，土茯苓、虎杖能够抑制黄嘌呤氧化酶的活性；当归、全蝎不仅有扩血管、降血小板聚集、抗血栓形成左右，还有消炎镇痛的作用；苍术、薏仁则有良好的降血糖疗效，并有增强免疫功能的作用[13]。
综上，萆苓方可能通过干预糖尿病痛风大鼠肾脏HMGB1及FOXOL的高表达，有效控制炎症因子，从而发挥了良好的降糖、降脂和降尿酸作用，延缓肾脏损伤。
萆苓祛痛方对糖尿病痛风模型大鼠肾脏HMGB1及FOXO3的影响
Effect of Biling Qutong prescription on the levels of HMGB1 and FOXO3 in kidney of diabetic gout model rats
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摘要:
目的观察萆苓祛痛方（萆苓方）对糖尿病痛风模型大鼠肾脏高迁移率族蛋白B1（HMGB1）及FOXO3的影响。 方法选取健康雄性大鼠，分为正常对照组、模型组、萆苓组、吲哚美辛组和吡格列酮组，各8只。除正常对照组外，其他各组予高脂饲料喂养，联合小剂量链脲佐菌素35 mg/kg腹腔注射1次，以血糖≥16.7 mmol/L为成功建立糖尿病模型。4 d后关节腔注射5%尿酸钠溶液1次，诱导痛风模型。建模成功后萆苓组、吲哚美辛组和吡格列酮组继续给予相应药物21 d，正常对照组和模型组给予等量0.9%氯化钠溶液。21 d后，各组大鼠取血测定血糖、血脂、血尿酸，并取大鼠肾脏，测定HMGB1及FOXO3表达量。 结果与正常对照组比较，模型组大鼠血糖、血尿酸、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平均明显升高（P < 0.01），肾组织HMGB1、FOXO3表达量均明显升高（P < 0.01）。与模型组比较，萆苓方组、吡格列酮组和吲哚美辛组大鼠血糖、血尿酸水平均下降（P < 0.05~P < 0.01），肾组织HMGB1、FOXO3相对表达量均明显降低（P < 0.01），萆苓方组和吡格列酮组TG、TC、LDL-C亦均下降（P < 0.05~P < 0.01），吲哚美辛组TC、LDL-C均下降（P < 0.05和P < 0.01）。 结论萆苓方具有良好的降糖、调脂、降低血尿酸的作用，其作用机制可能与干预糖尿病痛风大鼠肾脏HMGB1及FOXO3的高表达有关，其对糖尿病痛风引起的肾脏病防治有重要意义。 Abstract:ObjectiveTo observe the effects of Biling Qutong prescription(Biling prescription) on the levels of high mobility group B1(HMGB1) and FOXO3 in kidney of diabetic gout model rats. MethodsForty healthy rats were divided into the normal control group, model group, Biling group, indomethacin group and pioglitazone group(8 rats in each group).Except the normal control group, the other groups were fed with high-fat diet combined with low-dose streptozotocin 35 mg/kg once a day, and the blood glucose ≥"16.7 mmol/L was set as the standard of the diabetes model.After 4 days, the 0.9% sodium chloride solution was injected into the joint cavity of rats to establish the gout model.After the model was successfully established, the Biling group, indomethacin and pioglitazone group were continuously treated with relative drug for 21 days.The normal control group and model group were given the same amount of 0.9% sodium chloride solution.After 21 days, the levels of blood glucose, uric acid and blood uric acid, and expression levels of HMGB1 and FOXO3 in kidney were detected. ResultsCompared with the normal control group, the levels of blood glucose, serum uric acid, triacylglycerol(TG), total cholesterol (TC), low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C) significantly increased(P < 0.01), and the expression levels of HMGB1 and FOXO3 in kidney significantly increased in model group(P < 0.01).Compared with the model group, the levels of blood glucose and serum uric acid decreased, and the expression levels of HMGB1 and FOXO3 in kidney significantly decreased in Biling group, indomethacin and pioglitazone group(P < 0.05 to P < 0.01).Compared with the model group, the levels of TG, TC and LDL-C in Biling group and pioglitazone group decreased(P < 0.05 to P < 0.01), and the levels of TC and LDL-C in indomethacin group decreased(P < 0.05 and P < 0.01). ConclusionsBiling prescription has good effects in lowering blood glucose, regulating lipid and lowering blood uric acid, the action mechanism of which may be related to the intervention of the high expression of HMGB1 and FOXO3 in kidney of diabetic gout rats, and which is of great significance for the prevention and treatment of kidney disease induced by diabeticgout. -
Key words:
- diabetic gout /
- Biling Qutong prescription /
- high mobility group B1 /
- FOXO3 /
- rat
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表 1 各组大鼠血糖、血脂及血尿酸水平比较(x±s；n=8)
分组 血糖/(mmol/L) 血尿酸/(μmol/L) TG/(mg/d) TC/(mmol/L) LDL-C/(mmol/L) 正常对照组 5.76±0.80 73.2±7.31 0.43±0.12 1.87±0.25 0.54±0.11 模型组 17.05±3.14** 144.20±25.35** 2.16±1.10** 3.10±1.10** 1.15±0.74** 萆苓方组 13.88±2.51**# 90.18±22.04## 1.54±1.06## 1.64±0.24## 0.51±0.07## 吡格列酮组 12.71±2.18**# 96.38±14.20## 0.97±0.29## 1.42±0.26## 0.45±0.14## 吲哚美辛组 15.19±1.28**# 92.86±17.25## 2.18±1.67 1.96±0.46# 0.63±0.25## F 42.859 36.875 44.028 52.754 4.98 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.685 0.724 0.669 0.112 0.129 q检验：与正常对照组比较** P < 0.01；与模型组比较# P < 0.05，## P < 0.01 
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表 2 各组大鼠HMGB1和FOXO3相对表达量比较(x±s；n=8)
分组 HMGB1 FOXO3 正常对照组 0.42±0.03 0.32±0.02 模型组 1.11±0.04** 1.05±0.05** 萆苓方组 0.74±0.04**##△ 0.72±0.03**##△ 吡格列酮组 0.59±0.06**## 0.49±0.01**## 吲哚美辛组 0.76±0.04**##△ 0.74±0.03**##△ F 56.328 47.889 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.251 0.168 q检验：与正常对照组比较** P < 0.01；与模型组比较## P < 0.01;与吡格列酮组比较△ P < 0.05
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