DNMT3A R882突变在急性髓系白血病中的临床意义

王蕾; 杨艳丽; 张凤; 李佳佳; 耿英华; 李骏

doi:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2020.03.011

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DNMT3A R882突变在急性髓系白血病中的临床意义

蚌埠医学院第一附院医院血液科, 安徽蚌埠 233004

作者简介: 王蕾(1989-), 女, 硕士, 住院医师(现工作于苏州大学附属张家港医院)

通讯作者: 杨艳丽, yangyanli0702@126.com ;

中图分类号: R733.7

Clinical significance of DNMT3A R882 mutation in acute myeloid leukemia

Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu Anhui 233004, China

Corresponding author: YANG Yan-li, yangyanli0702@126.com ;

CLC number: R733.7

摘要: 目的研究初发急性髓系白血病（AML）病人中DNA甲基化转移酶3A（DNMT3A）R882位点突变情况，并分析其相关临床资料特征。方法运用DNA基因测序法检测116例AML病人与30例缺铁性贫血病人骨髓样本中DNMT3A R882突变情况。结果116例初发AML病人中，DNMT3A R882突变共16例，包括R882H突变9例，R882C突变7例，且均为杂合突变，而良性对照组中无突变；DNMT3A R882突变型AML（Mut-DNMT3A）组病人核型正常的AML（NK-AML）人数及M4、M5人数多于DNMT3A野生型AML组（Wild-DNMT3A组）（P < 0.05）。Mut-DNMT3A组病人年龄、外周血白细胞数及血小板数高于Wild-DNMT3A组（P < 0.05）。Mut-DNMT3A组病人总生存率、无病生存率均低于Wild-DNMT3A组（P < 0.05）。结论DNMT3A R882突变易发生于AML病人，特别是NK-AML及M4、M5病人，且常合并高龄、高白细胞危险因素；DNMT3A R882突变是AML病人预后不良的生物学标志。

Abstract: ObjectiveTo investigate the mutation of DNA methyltransferase 3A(DNMT3A) R882 in patients with acute myeloid leukemia(AML), and analyze the characteristics of related clinical data.MethodsThe mutations of DNMT3A R882 in 116 patients with AML and 30 patients with iron deficiency anemia were detected using DNA gene sequencing.ResultsAmong 116 patients with AML, 16 cases with DNMT3A R882 mutation were identified, which included 9 cases with R882H mutation and 7 cases with R882C mutation, all mutations were heterozygous mutations, while there was not mutation in benign control group.The number of patients with normal karyotype AML(NK-AML), and M4 and M5 in DNMT3A R882 mutation AML(Mut-DNMT3A) group were significantly higher than that in DNMT3A wild type AML(Wild-DNMT3A) group(P < 0.05).The patient age, and white blood cell amount and platelet amount in peripheral blood in Mut-DNMT3A group were significantly higher than those in Wild-DNMT3A group(P < 0.05).The overall survival rate and disease-free survival rate in Mut-DNMT3A group were significantly lower than those in Wild-DNMT3A group(P < 0.05).ConclusionsDNMT3A R882 mutation is easy to occur in AML patients, especially NK-AML, M4 and M5 patients, and complicated with risk factors of old age and high white blood cell amonut.DNMT3A R882 mutation is a biological marker of poor prognosis in AML patients.

Key words:

变量

DNMT3A R882突变

(+)

(-)

性别

男
女

11
5

60
40

0.45^*

>0.05

年龄/岁

59.5±13.5

45.0±15.2

2.32

< 0.05

骨髓原始细胞数/%

69.2±21.6

62.1±18.3

0.87

>0.05

白细胞数/(×10⁹/L)

43.2±21.9

26.4±23.4

2.08

< 0.05

血红蛋白/(g/L)

83.9±26.9

75.2±21.1

0.57

>0.05

血小板/(×10⁹/L)

74.3±40.1

37.8±39.7

3.02

< 0.01

NK-AML组
非NK-AML组

14
2

58
42

5.91^*

< 0.05

M4、M5分型组
M1、M2分型组

12
4

30
70

12.09^*

< 0.01

*示χ²值

融合基因

DNMT3A R882突变

校正χ²

(+)

(-)

CBFβ-MYH

阳性
阴性

2
14

8
92

0.01

>0.05

AML1-ET0

阳性
阴性

0
16

18
82

2.17

>0.05

CD抗原

DNMT3A R882突变

χ²

(+)

(-)

CD117

阳性
阴性

8
8

56
44

0.20

>0.05

HLA-DR

阳性
阴性

15
1

85
15

0.89

>0.05

CD13

阳性
阴性

12
4

78
22

0.07

>0.05

CD33

阳性
阴性

11
5

75
25

0.28

>0.05

CD15

阳性
阴性

11
5

53
47

1.38

>0.05

MPO

阳性
阴性

13
3

72
28

0.60

>0.05

CD56

阳性
阴性

3
13

22
78

0.09

>0.05

CD36

阳性
阴性

4
12

13
87

1.59

>0.05

CD64

阳性
阴性

3
13

9
91

1.41

>0.05

CD14

阳性
阴性

8
8

38
62

0.83

>0.05

DNMT3A R882突变在急性髓系白血病中的临床意义

通讯作者: 杨艳丽, yangyanli0702@126.com;

作者简介: 王蕾(1989-), 女, 硕士, 住院医师(现工作于苏州大学附属张家港医院)

蚌埠医学院第一附院医院血液科, 安徽蚌埠 233004

收稿日期: 2017-05-17

录用日期: 2019-01-20

网络出版日期: 2020-03-15

关键词:

全文HTML

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一类严重危害人类健康的异质性血液系统恶性肿瘤，发病率占我国成人白血病首位。DNA甲基化转移酶3A(DNA methyltransferase 3A, DNMT3A)位于人类2号染色体短臂2区3带(2p23)，是重要的甲基化转移酶之一，主要负责基因组DNA从头甲基化，在多种恶性肿瘤的发病机制中发挥重要作用^[1-3]。研究^[4-13]发现，在成人AML病人中DNMT3A R882位点高频突变，且常合并某些高危因素，是病人预后不良的重要分子生物学标志。本研究旨在通过收集临床骨髓标本及检测DNMT3A R882位点突变情况，探讨DNMT3A R882突变与AML发生、发展的相关性。

1. 资料与方法

1.1. 研究对象

收集2012年12月至2015年12月在蚌埠医学院第一附属医院被诊断为初发AML病人的骨髓标本116例及被诊断为缺铁性贫血病人的骨髓标本30例作为良性对照组。AML组男71例，女45例，年龄18~89岁。临床分型：M1型15例，M2型36例，M4型30例，M5型35例。所有病人均经细胞形态学、流式免疫学、细胞遗传学及分子生物学检查，并按照FAB国际分型标准明确诊断。良性对照组样本30例，男12例，女18例，年龄23~75岁。所有骨髓标本均经病人或家属签署知情同意书。

治疗方案：AML病人住院后均接受诱导缓解治疗，方案为蒽环类药物+阿糖胞苷(3 d+7 d)，如IA(去甲氧柔红霉素3 d+阿糖胞苷7 d)、DA(柔红霉素3 d+阿糖胞苷7 d)等，剂量参照《血液科临床处方手册》，并根据病人身高、体质量及体表面积而定。

疗效及随访：对116例AML病人通过查询住院病历、门诊病历及打电话方式进行随访，随访截止日期为2016年12月31日。完全缓解(complete remission, CR)定义为病人经初次或2次诱导缓解治疗后满足以下条件：(1)白血病症状及体征消失；(2)外周血中性粒细胞绝对数≥1.5×10⁹/L，血小板≥100×10⁹/L，白细胞分类中无白血病细胞；(3)骨髓原始细胞总数≤5%。总体生存时间(overall survival time，OS)定义为AML被确诊之日至死亡或末次随访的时间。无病生存时间(disease-free survival time, DFS)定义为经治疗获得CR后至复发或死亡的时间。

1.2. 主要试剂和仪器

超低温冰箱(-80 ℃)、低温高速离心机(Thermo科技公司)；核酸蛋白检测仪(Eppendorf科技公司)；梯度PCR扩增仪(东胜国际贸易有限公司)；水平式凝胶电泳槽及电泳仪、全自动凝胶成像系统(Tanon科技公司)；DNA上样缓冲液(6×)、TIANamp Genomic DNA Kit(天根生化科技有限公司)；Marker、5×TBE缓冲液、溴化乙锭(上海生物工程股份有限公司)。

1.3. DNA提取及突变检测

将收集到的骨髓标本提取单个核细胞后，根据DNA提取试剂盒说明提取基因组DNA，置于分光光度计中检测DNA浓度及纯度，并通过聚合酶链式反应及琼脂糖凝胶电泳，将高纯度的DNA送于上海生物工程股份有限公司进行DNMT3A R882突变检测。

1.4. 统计学方法

采用秩和检验、χ²检验和Log-rank检验。

3. 讨论

本实验检测到DNMT3A R882在AML组中突变率为13.8%，在良性对照组中无突变，由于对照组中病例数偏少，2组间差异无统计学意义。DNMT3A R882在NK-AML中突变率为19.4%，与以往发现的DNMT3A R882在AML中突变率为9.3%~19.7%、在NK-AML中达18.1~27%^[4-11]相符。

细胞表面相关免疫表型的表达可以判断骨髓细胞来源及发育程度，章梁君等^[9]研究指出DNMT3A R882突变的AML病人中细胞表面CD14与CD56分子表达显著增高，而本研究虽然显示M4、M5分型的病人人数在Mut-DNMT3A组中所占比例高于Wild-DNMT3A组，不过在分析2组间细胞免疫表型表达时，发现2组间与单核细胞表面标志相关的CD14、CD64、CD36、CD56分子表达差异并无统计学意义，这可能是因为细胞表面CD分子分化程度，或是成熟程度不一所造成的结果。

我们在分析Mut-DNMT3A组与Wild-DNMT3A组间AML1-ETO及CBFβ-MYH融合基因时，发现2组间人数差异均无统计学意义，但我们的研究发现Mut-DNMT3A更易发生于NK-AML病人，且EL GHANNAM等^[8]研究发现Mut-DNMT3A常伴有NMP1、FLT3-ITD突变，特别是NMP1突变常与DNMT3A R882突变关系密切^[6-10]。这可能是由于我们分析的融合基因种类少的原因，且提示当病人染色体核型正常，合并NMP1、FLT3-ITD突变时，可进一步检测DNMT3A R882突变。

我们虽然发现Mut-DNMT3A组病人年龄、外周血白细胞数及血小板数高于Wild-DNMT3A组，与HOU等^[7]发现的其中一部分相符，但其亦指出Mut-DNMT3A组病人中骨髓原始细胞数显著增加，而我们的研究显示Mut-DNMT3A组病人骨髓原始细胞数虽然较Wild-DNMT3A组病人增加，但差异无统计学意义。也有研究^[12]指出AML病人骨髓原始细胞数、外周血白细胞数、血小板数及年龄与DNMT3A R882是否突变无关。造成各研究中出现差异的原因可能有人种的不同、病例收集数量不同、实验研究方法不同及误差等。

大量研究^[10-13]显示DNMT3A R882突变病人复发率极高、生存率下降，预示着病人预后不良。本实验中发现Mut-DNMT3A组与Wild-DNMT3A组间病人CR率差异虽无统计学意义，但Mut-DNMT3A组病人OS率、DFS率较Wild-DNMT3A组病人均下降，提示DNMT3A R882突变可能是AML病人预后不良的生物学标志。

通过本实验研究可以得出DNMT3A R882突变易发生于AML病人，特别是NK-AML或M4、M5病人，且常合并高龄、高白细胞危险因素，DNMT3A R882突变使OS率及DFS率显著下降，是病人预后不良的生物分子学标志，也提示DNMT3A R882突变在AML的发病机制中发挥重要作用，仍需大量研究进一步阐明细胞分子生物学机制在其中的作用。

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