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抑制USP22表达对胶质瘤细胞顺铂耐药的影响

吕和力

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抑制USP22表达对胶质瘤细胞顺铂耐药的影响

    作者简介: 吕和力(1972-), 男, 副主任医师
  • 中图分类号: R739.41

Effect of inhibiting the expression of USP22 on cisplatin resistance in glioma cells

  • CLC number: R739.41

  • 摘要: 目的 探讨泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase 22,USP22)对胶质瘤细胞顺铂耐药的作用。 方法 采用顺铂剂量梯度爬升筛选方法诱导顺铂耐药胶质瘤细胞株U251/CP2,转染USP22小干扰RNA沉默胶质瘤顺铂耐药细胞株U251/CP2中USP22的表达,RT-PCR检测细胞USP22 mRNA的表达水平,流式细胞术检测转染USP22-shRNA对细胞凋亡的影响,CCK-8法检测细胞的活力及耐药指数,Western blotting检测USP22的蛋白水平。 结果 成功构建了顺铂耐药胶质瘤细胞株U251/CP2、USP22基因沉默细胞株U251-shUPS22和U251/CP2-shUSP22。抑制USP22的表达可以明显提高U251/CP2-shUSP22细胞的凋亡率(P < 0.05),顺铂上调USP22蛋白在U251和U251/CP2细胞中的表达(P < 0.01)。U251-shUPS22、U251/CP2和U251/CP2-shUSP22各组细胞的顺铂半数抑制浓度分别为(0.56±0.07)μg/mL、(73.73±2.74)μg/mL和(51.25±1.09)μg/mL,与对照U251组(1.23±0.13)μg/mL比较差异均有统计学意义(P < 0.01)。 结论 抑制USP22表达可增强胶质瘤细胞对顺铂的敏感性,且可在一定程度上逆转耐药细胞株的顺铂耐药,提示USP22是胶质瘤顺铂耐药的潜在分子机制之一。
  • 图 1  耐药细胞U251/CP2的形态变化

    图 2  RT-PCR检测USP22基因沉默效果

    图 3  流式细胞术检测抑制USP22表达对胶质瘤细胞凋亡的影响

    图 4  Western blotting检测不同顺铂处理后细胞中USP22的表达

    图 5  Western blotting检测USP22基因沉默后USP22蛋白的表达

    图 6  Western blotting检测各组细胞USP22蛋白的表达情况

    表 1  耐药细胞U251/CP2的耐药性检测(ni=3;x±s)

    分组 顺铂IC50/(μg/mL)
    U251 1.20±0.24
    U251/CP2 72.35±2.20**
    U251/CP2(不加顺铂) 71.68±0.49**
    F 2 308.51
    P < 0.01
    MS组内 3 731.620
    q检验:与对照组U251比较**P < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 2  CCK-8检测各组细胞的顺铂IC50(ni=3;x±s)

    分组 顺铂IC50/(μg/mL)
    U251 1.23±0.13
    U251/CP2 73.73±2.74**
    U251/CP2-shUSP22 51.25±1.09**
    F 3 626.38
    P < 0.01
    MS组内 2914.630
    q检验:与对照组U251比较**P < 0.01
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-07-12
  • 录用日期:  2020-02-23
  • 刊出日期:  2020-04-15

抑制USP22表达对胶质瘤细胞顺铂耐药的影响

    作者简介: 吕和力(1972-), 男, 副主任医师
  • 山东省菏泽市中医医院 神经外科, 274035

摘要:  目的 探讨泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase 22,USP22)对胶质瘤细胞顺铂耐药的作用。 方法 采用顺铂剂量梯度爬升筛选方法诱导顺铂耐药胶质瘤细胞株U251/CP2,转染USP22小干扰RNA沉默胶质瘤顺铂耐药细胞株U251/CP2中USP22的表达,RT-PCR检测细胞USP22 mRNA的表达水平,流式细胞术检测转染USP22-shRNA对细胞凋亡的影响,CCK-8法检测细胞的活力及耐药指数,Western blotting检测USP22的蛋白水平。 结果 成功构建了顺铂耐药胶质瘤细胞株U251/CP2、USP22基因沉默细胞株U251-shUPS22和U251/CP2-shUSP22。抑制USP22的表达可以明显提高U251/CP2-shUSP22细胞的凋亡率(P < 0.05),顺铂上调USP22蛋白在U251和U251/CP2细胞中的表达(P < 0.01)。U251-shUPS22、U251/CP2和U251/CP2-shUSP22各组细胞的顺铂半数抑制浓度分别为(0.56±0.07)μg/mL、(73.73±2.74)μg/mL和(51.25±1.09)μg/mL,与对照U251组(1.23±0.13)μg/mL比较差异均有统计学意义(P < 0.01)。 结论 抑制USP22表达可增强胶质瘤细胞对顺铂的敏感性,且可在一定程度上逆转耐药细胞株的顺铂耐药,提示USP22是胶质瘤顺铂耐药的潜在分子机制之一。

English Abstract

  • 神经胶质瘤是大脑中最常见的原发性肿瘤,占所有恶性脑肿瘤的80%[1]。化疗是胶质瘤重要的辅助治疗手段之一,但是由于肿瘤存在异质性的问题,病人对化疗药物的敏感性有很大差异,从而影响了治疗效果。顺铂是胶质瘤化疗的重要药物之一,因此探讨胶质瘤的顺铂耐药分子特征,对开发胶质瘤个体化化疗具有参考意义。泛素特异性肽酶22 (ubiquitin specific peptidase 22,USP22)是泛素水解酶家族一个较新的成员,被证实在多种恶性肿瘤的发生、发展和转移中扮演重要角色[2-3]。大量的研究发现USP22在多种肿瘤中表达增高,其异常高表达常预示肿瘤即出现转移或出现化疗耐药[4-5]。其中,李朝晖等[6]检测到USP22基因在胶质瘤细胞中高表达,并且证实USP22基因在胶质瘤细胞的增殖中发挥重要作用。王宛明等[7]发现抑制USP22表达可增加胰腺癌细胞对化疗药物吉西他滨的敏感性。但是,USP22是否与胶质瘤耐药相关尚未有文献报道。本研究探讨在胶质瘤中USP22的表达是否参与其顺铂耐药,从而发掘胶质瘤顺铂耐药的潜在分子机制,为胶质瘤化疗提供新的理论依据。

    • 人胶质瘤细胞株U251购自中科院上海细胞所。DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司。顺铂(cisplatin)购自美国Sigma公司。USP22单克隆抗体为美国Santa Cruz公司的产品。Lipofectamine 2000试剂、CCK-8试剂盒和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

    • 参照文献[8],用顺铂剂量梯度爬升筛选方法将U251细胞体外培养10个月,建立顺铂耐受细胞株(U251/CP2)。采用CCK-8方法,测定细胞的顺铂半数抑制浓度(IC50),鉴定所诱导的U251/CP2细胞株的耐药性。

    • 利用Lipofectamine 2000将USP22-shRNA表达质粒与病毒包装混合质粒共转染至293T细胞,进行病毒包装。收集病毒液后分别感染U251和U251/CP2细胞,polybrene筛选稳定干扰USP22表达的细胞克隆。RT-PCR法检测细胞USP22 mRNA表达水平,鉴定沉默效果。

    • 转染24 h后,收集细胞。PBS洗涤2次,重悬于500 μL的Binding Buffer溶液中,细胞筛过筛,加入5 μL Annexin Ⅴ和5 μL PI染色液后混匀,室温下孵育15 min,然后上样至流式细胞仪检测分析凋亡情况。

    • 提取细胞总蛋白质,BCA法检测蛋白浓度后取等量蛋白上样,10% SDS-PAG/E恒压电泳分离蛋白,然后恒流电转至PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭1 h,USP22一抗和GAPDH内参4 ℃孵育过夜,PBST洗膜后,二抗37 ℃孵育1 h,采用凝胶成像系统成像,利用图像分析软件进行分析。

    • 取对数生长期的细胞消化后制备成细胞悬液,以2×104/mL密度接种于96孔板,每孔100 μL,贴壁过夜。不同分组设3个复孔,培养24 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,孵育3 h,酶标仪测定450 nm处的吸光度,绘制曲线,计算顺铂IC50

    • 采用t检验、单因素方差分析及q检验。

    • 经历持续10个月的诱导,获得在顺铂(2μg/mL)中生长良好的耐药细胞U251/CP2。与亲本细胞相比,U251/CP2形态略有变化,表现为胞体较小,轴突较短且未分叉(见图 1)。CCK-8法检测亲本细胞U251和耐药细胞U251/CP2对顺铂的敏感性差异有统计学意义(P < 0.01),显示U251/CP2顺铂耐药;U251/CP2细胞无药培养2周后,IC50为(71.68±0.49) μg/mL,耐药性未见降低(P>0.05),说明U251/CP2对顺铂稳定耐药(见表 1)。

      图  1  耐药细胞U251/CP2的形态变化

      分组 顺铂IC50/(μg/mL)
      U251 1.20±0.24
      U251/CP2 72.35±2.20**
      U251/CP2(不加顺铂) 71.68±0.49**
      F 2 308.51
      P < 0.01
      MS组内 3 731.620
      q检验:与对照组U251比较**P < 0.01

      表 1  耐药细胞U251/CP2的耐药性检测(ni=3;x±s)

    • RT-PCR检测U251组、U251/CP2组、U251-shUSP22组和U251/CP2-shUSP22组细胞中USP22 mRNA的相对表达量分别为0.80±0.10、0.29±0.02、0.12±0.05、0.18±0.05。与U251组相比,U251-shUSP22组的USP22mRNA表达水平明显降低(t=10.49, P < 0.01);与U251/CP2组相比,U251/CP2-shUSP22组的USP22mRNA表达水平也明显降低(t=3.44, P < 0.05),说明成功干扰USP22基因沉默表达(见图 2)。

      图  2  RT-PCR检测USP22基因沉默效果

    • 流式细胞仪检测U251组、U251-shUSP22组、U251/CP2组和U251/CP2-shUSP22组的细胞凋亡率分别为(4.13±0.59)%、(23.64±4.82)%、(7.65±0.73)%和(19.36±5.49)%;与U251组相比,U251-shUSP22组细胞凋亡率明显升高(t=6.96,P < 0.01);与U251/CP2组相比,U251/CP2-shUSP22组的细胞凋亡率同样也明显升高(t=3.66,P < 0.05);提示抑制USP22的表达可以显著提高胶质瘤细胞的凋亡率(见图 3)。

      图  3  流式细胞术检测抑制USP22表达对胶质瘤细胞凋亡的影响

    • Western blotting检测发现0 μg/mL、0.5 μg/mL、8 μg/mL顺铂短暂处理(24 h)后U251细胞内USP22蛋白相对表达量分别为0.21±0.02、0.30±0.01、0.64±0.01,U251/CP2细胞2 μg/mL顺铂短暂处理(24 h)后USP22蛋白相对表达量为0.43±0.02(见图 4)。与对照U251(0 μg/mL)组相比,USP22蛋白表达水平在U251(0.5 μg/mL)组、U251(8 μg/mL)组和U251/CP2(2 μg/mL)组中均明显提高(t=9.70、40.35、14.60, P < 0.01)。提示顺铂用药可影响胶质瘤细胞中USP22的表达。

      图  4  Western blotting检测不同顺铂处理后细胞中USP22的表达

    • 与对照细胞U251相比,U251-shUSP22中USP22的蛋白表达水平明显下调(t=6.83,P < 0.01)(见图 5)。同时,U251-shUSP22的顺铂IC50为(0.56±0.07) μg/mL,与U251的顺铂IC50 (1.23±0.13) μg/mL差异有统计学意义(t=7.70,P < 0.01)。提示下调USP22表达可增强胶质瘤细胞对顺铂的敏感性。

      图  5  Western blotting检测USP22基因沉默后USP22蛋白的表达

    • 与对照细胞U251/CP2相比,U251/CP2-shUSP22中USP22蛋白表达水平显著下调(t=3.01,P < 0.05)(见图 6)。U251/CP2的顺铂IC50为(73.73±2.74) μg/mL,而U251/CP2-shUSP22的顺铂IC50下降至(51.25±1.09) μg/mL(P < 0.01) (见表 2),提示USP22表达下调,可逆转耐药细胞株U251/CP2对顺铂的耐药。U251与U251/CP2-shUSP22的顺铂敏感性差异有统计学意义(P < 0.01),说明USP22表达下调可在一定程度上逆转U251/CP2对顺铂耐药,但并非完全逆转。

      图  6  Western blotting检测各组细胞USP22蛋白的表达情况

      分组 顺铂IC50/(μg/mL)
      U251 1.23±0.13
      U251/CP2 73.73±2.74**
      U251/CP2-shUSP22 51.25±1.09**
      F 3 626.38
      P < 0.01
      MS组内 2914.630
      q检验:与对照组U251比较**P < 0.01

      表 2  CCK-8检测各组细胞的顺铂IC50(ni=3;x±s)

    • 胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,恶性程度高,侵袭性强,易复发,治疗相当困难。目前临床常用的治疗胶质瘤推荐方案包括替莫唑胺(TMZ)剂量密度方案、联合治疗方案、抗血管生成治疗等。替莫唑胺为常用抗肿瘤药物,可通过阻断DNA合成,发挥抗肿瘤作用,控制病情进展。但是,并非所有病人均对替莫唑胺敏感,比如,O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶高表达病人易对烷化剂类产生耐药性[9]。有学者[10]指出采用替莫唑胺与铂类药物联合治疗复发性恶性肿瘤效果更优,可有效改善病人临床症状,控制癌灶扩散,延长病人生存时间。

      顺铂是临床上最常用的铂类药物,主要作用靶点就是DNA,通过在细胞内形成铂-DNA加合物抑制DNA的复制和转录,是临床治疗多种实体瘤的重要药物,也是对胶质瘤敏感性较高的药物之一[11-12]。以抑制DNA合成的抗肿瘤药物,同时会使细胞启动防止其自身凋亡的多种修复机制来修复损伤的DNA,比如激活各种DNA修复酶使受损伤的DNA尽量恢复其结构和功能,从而尽量维持其正常的结构和功能,从而降低了该药物的临床疗效,使得肿瘤对该药物产生耐药性[13]

      胶质瘤的化疗耐药机制十分复杂,涉及到多方面因素,比如肿瘤细胞内药物的积聚减少、药物作用靶点减少、凋亡与抗凋亡机制失衡、DNA修复机制及肿瘤干细胞等。TABATABAI等[14]从胶质瘤中分离出胶质瘤干细胞(glioma stem cell, GSC)并发现胶质瘤细胞和GSC均具有多药耐药现象,以GSC更为显著。无论在体内还是体外GSC基本处于休眠状态,停滞于细胞周期中的G0/G1期并且高表达ABCG2、MDR等耐药基因。GSC能特征性表达ABC转运体,能将多种化疗药物转运出细胞外,从而对化疗药物产生耐药性[15]。另外,胶质瘤的耐药性还可能与高表达的MGMT、抗凋亡蛋白和凋亡蛋白抑制因子有关。崔磊等[16]利用芯片-基因组杂交技术筛选胶质瘤细胞中与顺铂耐药相关分子标志物,发现与胶质瘤顺铂耐药有关的基因包括CFHR1、CFHR3和IL-7等。但是,USP22基因是否也参与了胶质瘤耐药尚未有研究报道。

      USP22基因位于人类17号染色体,编码蛋白产物约66000,是hSAGA(human Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase)复合物的一个亚单位, 是一类去泛素化酶,主要通过去泛素化修饰来调控肿瘤细胞的生长分化、影响细胞周期、转录激活和信号转导等。同时,USP22作为一个肿瘤干细胞标记家族的成员,在细胞周期、DNA转录、肿瘤发生发展进程中发挥重要作用,USP22可能通过细胞周期G1/S转换参与肿瘤耐药[17]

      李朝晖研究团队[6, 18]通过多项研究,明确了USP22在胶质瘤细胞中高表达,且验证了USP22通过调节细胞凋亡和细胞周期在胶质瘤细胞的增殖中发挥作用。吕磊等[19]的研究指出沉默USP22可逆转膀胱癌细胞T24对丝裂霉素化疗药的耐药。王宛明等[7]的研究则指出了抑制USP22可逆转胰腺癌细胞SW1990对吉西他滨化疗药的耐药。然而,关于USP22是否参与了胶质瘤细胞耐药目前尚无人研究。

      本研究首次探讨USP22表达与胶质瘤细胞顺铂耐药的关系。首先,通过剂量梯度爬升诱导顺铂耐药胶质瘤细胞株U251/CP2,相对于亲本细胞株U251,U251/CP2对顺铂的敏感性显著下降,显示出顺铂耐受。此后,Western blotting检测其中USP22蛋白表达情况,发现在U251/CP2中USP22的表达显著高于U251,提示USP22可能参与了胶质瘤顺铂获得性耐药。因此,本文又采用小干扰RNA沉默U251、U251/CP2细胞的USP22表达,证实抑制USP22表达可降低U251对顺铂的抗药性并可在一定程度上逆转耐药细胞株对顺铂的耐药。

      综上所述,本研究发现USP22的表达与胶质瘤U251细胞对顺铂的耐药有相关性,提示USP22可能是胶质瘤顺铂耐药的分子机制之一,为进一步研究胶质瘤顺铂耐药机制提供了新的方向。

参考文献 (19)

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