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PD-L1对肝细胞癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响

周万飞 刘高峰 秦中强 胡小梅 谈燚

引用本文:
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PD-L1对肝细胞癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响

    作者简介: 周万飞(1991-),男,硕士研究生
    通讯作者: 谈燚, doctortanyi2007@sina.com
  • 中图分类号: R735.7

Effect of PD-L1 on the proliferation,invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells

    Corresponding author: TAN Yi, doctortanyi2007@sina.com
  • CLC number: R735.7

  • 摘要: 目的 探讨程序性死亡配体(PD-L1)在肝癌细胞增殖、侵袭、迁移中的作用。 方法 转染有效的PD-L1基因siRNA干扰片段进入人肝细胞癌HepG2细胞中,下调细胞中PD-L1表达。采用荧光定量PCR法检测HepG2细胞中PD-L1基因表达情况,采用Western blotting法检测HepG2细胞中PD-L1蛋白表达情况。通过MTT实验观察其对HepG2细胞增殖能力的影响,采用细胞划痕实验检测细胞融合率,采用Transwell小室进行侵袭实验,观察其对HepG2细胞迁移及侵袭能力影响。 结果 下调PD-L1后,HepG2细胞PD-L1基因表达量、PD-L1蛋白表达量和细胞增殖能力、迁移能力及侵袭能力均明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01),阴性对照组和正常对照组上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。 结论 下调PD-L1后,肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力有一定程度下降,PD-L1可能成为肝细胞肝癌免疫治疗中的一个新基因靶位。
  • 图 1  各组细胞PD-L1蛋白表达

    图 2  Transwell实验示各组细胞侵袭能力

    图 3  划痕实验示各组细胞迁移能力

    表 1  各组细胞PD-L1蛋白表达量比较(x±s)

    分组 PD-L1蛋白 F P MS组内
    siRNA-PD-L1组 0.332±0.011
    siRNA-NC组 0.779±0.032** 439.64 <0.01 0.001
    空白对照组 0.831±0.044**
    q检验:与siRNA-PD-L1组比较**P<0.01
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    表 2  各组细胞PD-L1mRNA相对表达量比较(x±s)

    分组 PD-L1mRNA F P MS组内
    siRNA-PD-L1组 0.421±0.065
    siRNA-NC组 1.243±0.201** 219.62 <0.01 0.001
    空白对照组 1**
    q检验:与siRNA-PD-L1组比较**P<0.01
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    表 3  siRNA转染后不同时点各组细胞增殖率比较(x±s)

    分组 n 24 h 48 h 72 h
    siRNA-PD-L1组 6 0.610±0.011 0.653±0.045 0.705±0.053
    siRNA-NC组 6 0.628±0.029 0.710±0.029 0.901±0.034**
    空白对照组 6 0.602±0.044 0.699±0.069 0.904±0.059**
    F 1.10 2.16 31.44
    P >0.05 >0.05 <0.01
    MS组内 0.001 0.003 0.003
    q检验:与siRNA-PD-L1组比较**P<0.01
    下载: 导出CSV

    表 4  各组细胞侵袭能力比较(x±s)

    分组 穿膜细胞数 F P MS组内
    siRNA-PD-L1组 40.21±3.02
    siRNA-NC组 105.31±3.03** 535.04 <0.01 17.340
    空白对照组 110.62±5.78**
    q检验:与siRNA-PD-L1组比较**P<0.01
    下载: 导出CSV

    表 5  各组细胞迁移能力比较(x±s)

    分组 细胞迁移/% F P MS组内
    siRNA-PD-L1组 12.30±2.00
    siRNA-NC组 63.00±2.81** 441.71 <0.01 6.220
    空白对照组 66.00±3.04**
    q检验:与siRNA-PD-L1组比较**P<0.01
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-06-17
  • 录用日期:  2019-09-24
  • 刊出日期:  2020-05-15

PD-L1对肝细胞癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响

    通讯作者: 谈燚, doctortanyi2007@sina.com
    作者简介: 周万飞(1991-),男,硕士研究生
  • 1. 蚌埠医学院第一附属医院 肝胆外科, 安徽 蚌埠 233004
  • 2. 蚌埠医学院 生命科学学院, 安徽 蚌埠 233030

摘要:  目的 探讨程序性死亡配体(PD-L1)在肝癌细胞增殖、侵袭、迁移中的作用。 方法 转染有效的PD-L1基因siRNA干扰片段进入人肝细胞癌HepG2细胞中,下调细胞中PD-L1表达。采用荧光定量PCR法检测HepG2细胞中PD-L1基因表达情况,采用Western blotting法检测HepG2细胞中PD-L1蛋白表达情况。通过MTT实验观察其对HepG2细胞增殖能力的影响,采用细胞划痕实验检测细胞融合率,采用Transwell小室进行侵袭实验,观察其对HepG2细胞迁移及侵袭能力影响。 结果 下调PD-L1后,HepG2细胞PD-L1基因表达量、PD-L1蛋白表达量和细胞增殖能力、迁移能力及侵袭能力均明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01),阴性对照组和正常对照组上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。 结论 下调PD-L1后,肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力有一定程度下降,PD-L1可能成为肝细胞肝癌免疫治疗中的一个新基因靶位。

English Abstract

  • 肝细胞癌为全球性健康问题[1],其发病率在全球排名第五,死亡率排名第二[2]。由于肝细胞癌早期无特征性临床表现,因此在发病早期难以发现,往往在病人就诊时已处于疾病晚期,失去了手术治疗的最佳时间[3]。因此,深入研究肝细胞癌的发病机制及发现新的治疗手段有重大意义。随着肿瘤免疫治疗突飞猛进,新型细胞免疫治疗技术得到飞速发展。近年来,在肿瘤免疫治疗研究中发现程序性死亡受体-1(programmed death receptor-1, PD-1) /程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1,PD-L1/B7-H1) 信号通路的激活可以诱导发生肿瘤免疫逃逸,促进肿瘤快速生长, 在免疫耐受调节中扮演重要角色[4]。但目前尚未见文献报道有关PD-L1在肿瘤细胞自身增殖能力方面的研究。既往研究[5-12]表明,PD-L1在多种恶性肿瘤中呈高表达状态,如骨肉瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、淋巴瘤、胰腺癌、脑胶质瘤、鳞状细胞癌等。并且最近有研究[13]表明,PD-L1在肝细胞癌中同样呈高表达状态。本研究应用RNA干扰技术下调肝细胞癌细胞中PD-L1基因,观察下调PD-L1基因对肝癌细胞迁移、侵袭、增殖能力的影响,为肝细胞肝癌免疫治疗提供前期实验基础。现作报道。

    • 人肝细胞癌细胞株(HepG2)(上海细胞库,中国)。DMEM培养基(Hyclone,美国);胎牛血清(Gibco,美国);胰蛋白酶(Biosharp,中国);双抗/青链霉素合剂(Gibco,美国);PBS 液(Biosharp,中国),Trizol(Invitrogen,美国);荧光定量试剂盒(TAKARA,日本) ;PD-L1山羊多克隆抗体(Abcam,英国);兔抗山羊IgG(Bisharp, 中国);PVDF膜(Bio-Rad,美国);RIPA裂解液(碧云天,中国)、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(Bisharp,中国);siRNA-PD-L1,siRNA-Control(GenePharma)。CFX 荧光定量PCR仪(Bio-Rad);倒置显微镜(Olympus,日本);酶标仪(Leica,德国);荧光共聚焦显微镜(Leica,德国) 。

    • 实验分组设siRNA-PD-L1组、siRNA-Control阴性对照组(siRNA-NC组)和正常细胞组(空白对照组),按照不同分组进行细胞转染。PD-L1的siRNA和siRNA-Control通过吉玛公司设计合成,培养细胞处于对数生长期时,应用siRNA-mate转染试剂(吉玛公司提供)进行常规转染,空白对照组不作处理。按细胞浓度1.5×106/2 mL于6孔板种植细胞,完全培养基(DMEM培养基,10%胎牛血清) 培养至细胞贴壁,分别用无血清DMEM培养基按质粒∶siRNA-mate=1∶5比例配置细胞转染液200 μL,室温静置10 min后混匀。培养板更换新鲜完全DMEN培养基,加入转染液,于37 ℃、5% CO2孵育箱内培养48 h,收取样本进行RT-PCR实验和Western blotting实验,检测PD-L1基因沉默水平。

    • 常规培养HepG2细胞,当细胞进入对数生长期后,按实验分组处理细胞,分别收集各组细胞约2.5×106个,用RIPA强细胞裂解液裂解细胞,提取总蛋白。用BCA 试剂盒测定蛋白浓度,SDS-PAGE电泳、转膜后检测蛋白表达,图像用ImageJ软件进行分析。

    • 常规培养HepG2细胞,当细胞进入对数生长期后,按实验分组处理细胞,分别收集各组细胞约2.5×106个,用Trizol 细胞裂解液裂解细胞,提取总RNA。用荧光定量PCR试剂盒检测 PD-L1基因表达,数据用ImageJ软件处理 。

    • 取对数生长期 HepG2细胞常规转染后,以2×103/mL细胞浓度接种96孔板,每孔100 μL,按实验分组,每组设6个复孔处理细胞,培养24 h后,每孔加入MTT 10 μL(5 mg/mL)继续培养4 h,弃上清,每孔加入DMSO 100 μL,摇床混匀15 min,在酶标仪490 nm处测定各组光密度(opti-caldensity,OD)值,计算各实验组HepG2细胞增殖率=实验组OD值/对照组OD值。

    • 在12孔板中加入细胞悬液,待细胞贴壁后,用消毒10 μL移液枪头均匀划4条横线,用PBS洗细胞3次,去除漂浮细胞。分3组处理细胞,放入37 ℃、5%CO2培养箱培养,取不同时间点于倒置显微镜下拍照,测量划痕融合率。

    • 用已预冷的不含血清的DMEM培养基来稀释Matrigel基质胶(培养基∶基质胶=1∶3),快速充分混匀后快速包被小室的上室,37 ℃干燥2 h。以2×104/mL细胞浓度接种Transwell小室,在下室中加入500 μL不含血清的DMEM培养基,放入37 ℃、5%CO2培养箱培养48 h,取出小室,4%多聚甲醛固定20 min,苏木紫染色60 min,在光学显微镜下进行细胞计数。

    • 采用方差分析和q检验。

    • Western blotting结果显示,siRNA-PD-L1组、siRNA-NC组和空白对照组PD-L1蛋白表达量间差异有统计学意义(P<0.01),其中siRNA-PD-L1组均明显低于siRNA-NC组和空白对照组(P<0.01),而siRNA-NC组和空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)(见图 1表 1)。

      图  1  各组细胞PD-L1蛋白表达

      分组 PD-L1蛋白 F P MS组内
      siRNA-PD-L1组 0.332±0.011
      siRNA-NC组 0.779±0.032** 439.64 <0.01 0.001
      空白对照组 0.831±0.044**
      q检验:与siRNA-PD-L1组比较**P<0.01

      表 1  各组细胞PD-L1蛋白表达量比较(x±s)

    • 荧光定量PCR结果显示,siRNA-PD-L1组、siRNA-NC组和空白对照组PD-L1蛋白表达量间差异有统计学意义(P<0.01),其中siRNA-PD-L1组均明显低于siRNA-NC组和空白对照组(P<0.01),而siRNA-NC组和空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)(见表 2)。

      分组 PD-L1mRNA F P MS组内
      siRNA-PD-L1组 0.421±0.065
      siRNA-NC组 1.243±0.201** 219.62 <0.01 0.001
      空白对照组 1**
      q检验:与siRNA-PD-L1组比较**P<0.01

      表 2  各组细胞PD-L1mRNA相对表达量比较(x±s)

    • MTT实验结果显示,siRNA转染HepG2细胞后24、48 h,3组细胞增殖率差异均无统计学意义(P>0.05);转染后72 h,siRNA-PD-L1组细胞增殖率均明显低于siRNA-NC组和空白对照组(P<0.01)(见表 3)。

      分组 n 24 h 48 h 72 h
      siRNA-PD-L1组 6 0.610±0.011 0.653±0.045 0.705±0.053
      siRNA-NC组 6 0.628±0.029 0.710±0.029 0.901±0.034**
      空白对照组 6 0.602±0.044 0.699±0.069 0.904±0.059**
      F 1.10 2.16 31.44
      P >0.05 >0.05 <0.01
      MS组内 0.001 0.003 0.003
      q检验:与siRNA-PD-L1组比较**P<0.01

      表 3  siRNA转染后不同时点各组细胞增殖率比较(x±s)

    • Transwell侵袭实验结果显示,3组细胞侵袭能力间差异有统计学意义(P<0.01),其中siRNA-PD-L1组穿膜细胞数均明显低于siRNA-NC组和空白对照组(P<0.01),而siRNA-NC组和空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)(见图 2表 4)。

      分组 穿膜细胞数 F P MS组内
      siRNA-PD-L1组 40.21±3.02
      siRNA-NC组 105.31±3.03** 535.04 <0.01 17.340
      空白对照组 110.62±5.78**
      q检验:与siRNA-PD-L1组比较**P<0.01

      表 4  各组细胞侵袭能力比较(x±s)

      图  2  Transwell实验示各组细胞侵袭能力

    • 细胞划痕实验结果显示,3组细胞迁移能力间差异有统计学意义(P<0.01),其中siRNA-PD-L1组均明显低于siRNA-NC组和空白对照组(P<0.01),而siRNA-NC组和空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)(见图 3表 5)。

      分组 细胞迁移/% F P MS组内
      siRNA-PD-L1组 12.30±2.00
      siRNA-NC组 63.00±2.81** 441.71 <0.01 6.220
      空白对照组 66.00±3.04**
      q检验:与siRNA-PD-L1组比较**P<0.01

      表 5  各组细胞迁移能力比较(x±s)

      图  3  划痕实验示各组细胞迁移能力

    • PD-L1作为共刺激分子B7家族中的一员,其主要通过抑制T细胞的增殖、活化和相关细胞因子的分泌及降低细胞毒性作用来负性调控T细胞免疫。然而最近相关研究发现PD-L1同样影响着肿瘤的生物学活性,例如肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭能力。蒋涛等[14]研究发现,应用siRAN下调肺腺癌组织中PD-L1蛋白表达,可以显著降低癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力。周婷等[15]研究亦显示,上调宫颈癌组织中PD-L1蛋白的表达,可以显著增加癌细胞的迁移能力。

      本研究采用siRNA基因沉默技术下调肝细胞肝癌HepG2细胞中PD-L1蛋白的表达,观察HepG2细胞生物行为学变化。实验结果显示,在有效下调细胞中PD-L1蛋白表达后,siRNA-PD-L1组细胞的增殖、迁移、侵袭能力均明显低于siRNA-NC组和空白对照组,提示下调PD-L1可明显抑制HepG2细胞的增殖、迁移、侵袭。PD-L1作为肿瘤微环境中重要的免疫抑制分子,在多种实体肿瘤前期临床实验中,针对PD-L1的靶向性阻断显示出显著的疗效优势,具有可观前景[16],但其机制尚未阐明,仍有待于进一步研究。

      综上,下调PD-L1后,肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力有一定程度下降,PD-L1可能成为肝细胞肝癌免疫治疗中的一个新基因靶位。本研究应用siRNA基因沉默手段,为深入探讨其机制提供了依据,也为PD-L1在实体肿瘤治疗中的应用提供了前期实验基础。

参考文献 (16)

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