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糖尿病在中国已经成为影响居民生活质量的主要问题之一,在经济发展、生活条件富足以及人口老龄化等多种因素驱使下,糖尿病的发病人数仍在逐年上升[1-2]。糖尿病发病机制主要为胰岛素相对分泌不足及胰岛素抵抗,2型糖尿病是我国主要的糖尿病类型,胰岛素抵抗在2型糖尿病发病中发挥重要作用[3-4]。当前对于介导胰岛素抵抗信号的转导通路有较多研究,其中有关细胞因子信号转导抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3,SOCS3)介导胰岛素抵抗信号转导通路的研究也有一定进展[5-6],但目前较少有文献对SOCS3介导多条信号转导通路引起胰岛素抵抗进行报道。本研究通过构建2型糖尿病大鼠模型,探讨慢病毒介导沉默SOCS3基因对大鼠相关胰岛素通路蛋白表达的影响。现作报道。
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雄性5周龄SD大鼠40只,购自北京维通达生物技术有限公司,大鼠许可证号:SCXK(京)20170011,体质量170~230 g,所有SD大鼠均饲养于SPF级动物房。实验动物操作程序符合《实验动物管理和使用指南》规定,本实验研究方案通过医院伦理委员会批准。
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链脲佐菌素(streptozocin,STZ)试剂购自美国Sigma公司;空慢病毒载体购自北京义翘神州科技有限公司;葡萄糖测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;大鼠胰岛素ELISA试剂盒购自上海一基实业有限公司;血脂生化检测试剂盒购自上海透景诊断科技有限公司;Trizol RNAiso购自日本Takara公司;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)试剂盒购自北京九州天瑞科技有限公司;总RNA提取试剂盒购自北京凯瑞基生物科技有限公司;反转录试剂盒均购自美国Applied Biosystems公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京金克隆生物技术有限公司;兔抗鼠SOCS3蛋白、胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate-1,IRS1)、磷酸化IRS1(pIRS1)、胰岛素受体底物2(insulin receptor substrate-2,IRS2)、磷酸化IRS2(pIRS2)、信号传导及转录激活因子-5b(signal transducers and activators of transcription-5b,STAT5b)、磷酸化STAT5b(pSTAT5b)一抗购自美国Novus Biologicals公司;兔抗鼠酪氨酸激酶2(janus kinase 2,JAK2)、磷酸化JAK2(pJAK2)、信号转导及转录激活因子-3(signal transducers and activators of transcription-3,STAT3)、磷酸化STAT3(pSTAT3)一抗均购自美国Abcam公司;羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗购自美国Santa Cruz公司。KETA S凝胶成像分析系统购自美国Wealtec Corp公司;PCR仪购自美国Bio-rad公司,CFX96型;全自动生化分析系统购自美国Beckman Coulter公司,AU5800型。
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慢病毒SOCS3 RNAi构建由北京义翘神州科技有限公司完成,载体构建完成后由该公司提供基因测序结果,由我实验室人员进行确认。
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大鼠糖尿病模型构建:40只大鼠给予高糖高脂饲料(配比:胆固醇5%、猪油脂10%、蔗糖10%、普通饲料65%)喂养,饲养4周后,大鼠腹腔注射STZ缓冲液(STZ溶液1%,柠檬酸缓冲液99%)30 mg/kg。注射5 d后,随机3次测量鼠尾血糖,血糖值>16.7 mmol/L为大鼠2型糖尿病模型构建成功。建模成功大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、空白载体组和观察组,各10只。分组后1、15 d,观察组大鼠尾部注射SOCS3 RNAi慢病毒载体,每次1.5 mL;空白载体组大鼠尾部注射空慢病毒载体,每次1.5 mL;空白对照组不进行处理。继续饲养4周,所有大鼠禁食,收集血清、肝脏组织标本,肝脏组织标本于-80 ℃保存待检。
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载体注射4周后,检测大鼠空腹血糖、胰岛素、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及总胆固醇(TC)水平。其中空腹血糖采用葡萄糖氧化酶法检测,胰岛素测定采用ELISA法,HDL-C、TG、LDL-C和TC采用全自动生化分析仪测定。
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取大鼠肝脏组织1 g,以研磨棒充分研磨,加入1 mL Trizol RNAiso,提取总RNA,反转录操作参照反转录试剂盒说明书,提取20 μg RNA反转录为cDNA,GAPDH、SOCS3、IRS1、IRS2、STAT5b、JAK2、STAT3引物由北京义翘神州科技有限公司合成,引物序列见表 1。PCR反应条件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40个循环,循环完成后在72 ℃条件下继续延伸10 min。采用FS2000系统进行分析,并采用2-△△CT法计算mRNA相对表达量。
目的基因 引物序列 GAPDH 上游引物 5′-GGT CAT TCA TCT GCA TCG GTA GTG-3′ 下游引物 5′-AGC GAG TGA GCT AGT GCG TCA TC-3′ SOCS3 上游引物 5′-CAA GAG GTC CTG TCT TCA GAT G-3′ 下游引物 5′-TCT GTA GTC CAT TTC CTG GTT CA-3′ IRS1 上游引物 5′- GAG ATG GAG AGC CCA CAG ATG -3′ 下游引物 5′- CTA GAG GTC TCG CAA CGT CCG-3′ IRS2 上游引物 5′-ACG CCT AAT GGA TCC GTC ACA A-3′ 下游引物 5′- ATG TGC AGT GAT TCT CCG ACT G-3′ STAT5b 上游引物 5′-GTG ATA AAG GTT TCG GTT GCT G-3′ 下游引物 5′-TGT ATC TGT GAC TCC TAG TCT G-3′ JAK2 上游引物 5′-CGT CAG ACA CCC AGT GGT CCT G-3′ 下游引物 5′-ATG CTG CTG AGG CGT CGA GAG G-3′ STAT3 上游引物 5′-AAC GTG TGA TAG CTA TGT GTA CG-3′ 下游引物 5′-CTC TGT GAT CTG ACA TCG TGC AT-3′ 表 1 各目的基因引物序列
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取大鼠肝脏组织1 g,以研磨棒充分研磨,加入1 mL RIPA细胞裂解液,各组细胞在冰上裂解30 min,移入1.5 mL离心管中,在预冷的4 ℃离心机中5 000 r/min离心5 min后提取上清,95 ℃煮沸后,收集蛋白备用。提取40 μg总蛋白,在120 g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离,采用电转移法转移至聚偏氟乙烯膜上,室温下用50 g/L脱脂奶粉进行封闭2 h。随后加入稀释的兔抗鼠SOCS3、IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、STAT5b、pSTAT5b、JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3一抗(1∶1 000),在4 ℃条件下进行孵育过夜备用。第2天用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)稀释液洗涤孵育后的溶液3次,然后加入山羊抗兔稀释二抗(1∶1 000)孵育2 h,用PBST稀释液洗涤3次,然后用二氨基联苯胺(DAB)显影液处理样本。采用Image J软件分析蛋白条带。
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采用方差分析和q检验。
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3组大鼠均精神状态较好,毛发光滑。3组大鼠入组时和注入载体后4周体质量差异均无统计学意义(P>0.05);构建糖尿病模型后,空白载体组和观察组大鼠体质量均明显高于空白对照组(P<0.01),空白载体组和观察组差异无统计学意义(P>0.05)(见表 2)。
分组 n 入组时 构建糖尿病模型后 注入载体后4周 空白对照组 10 201.63±25.47 352.77±33.84 398.41±32.18 空白载体组 10 208.77±18.23 361.93±23.46** 403.27±29.22 观察组 10 205.93±20.18 359.85±29.84** 411.36±31.56 F — 0.28 45.22 0.44 P — >0.05 <0.01 >0.05 MS组内 — 462.762 861.981 961.798 q检验:与空白对照组比较**P<0.01 表 2 3组大鼠不同时点体质量比较(x±s;g)
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观察组大鼠空腹血糖、胰岛素、TG、LDL-C和TC水平均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01),HDL-C水平均明显高于空白对照组和空白载体组(P<0.01);空白对照组和空白载体组大鼠上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 3)。
分组 n 空腹血糖/(mmol/L) 胰岛素/(mU/L) HDL-C/(mmol/L) TG/(mmol/L) LDL-C/(mmol/L) TC/(mmol/L) 空白对照组 10 19.28±2.57 26.18±2.87 1.10±0.17 1.82±0.24 1.98±0.23 3.15±0.31 空白载体组 10 20.14±3.42 25.36±3.22 1.03±0.21 1.79±0.21 1.95±0.21 3.11±0.25 观察组 10 12.37±3.10**△△ 14.26±3.26**△△ 1.58±0.33**△△ 1.03±0.19**△△ 1.29±0.13**△△ 2.10±0.34**△△ F — 19.50 45.49 14.78 43.64 40.06 38.73 P — <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 MS组内 — 9.303 9.744 0.061 0.046 0.038 0.091 q检验:与空白对照组比较**P<0.01;与空白载体组比较△△P<0.01 表 3 3组大鼠血糖、胰岛素和血脂水平比较(x±s)
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除STAT3mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)外, 3组大鼠SOCS3mRNA、STAT5bmRNA、IRS1mRNA、IRS2mRNA及JAK2mRNA表达间差异均有统计学意义(P<0.01)。其中, 观察组大鼠SOCS3mRNA和STAT5bmRNA表达均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01), IRS1mRNA、IRS2mRNA和JAK2mRNA表达均高于空白对照组和空白载体组(P<0.05~P<0.01);空白对照组和空白载体组相关mRNA 表达差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 4)。
分组 n SOCS3 IRS1 IRS2 STAT5b JAK2 STAT3 空白对照组 10 0.60±0.09 0.36±0.10 0.34±0.08 0.64±0.10 0.40±0.09 0.52±0.11 空白载体组 10 0.62±0.11 0.37±0.08 0.35±0.09 0.66±0.07 0.42±0.08 0.54±0.12 观察组 10 0.42±0.07**△△ 0.56±0.09**△△ 0.51±0.10**△△ 0.52±0.08**△△ 0.53±0.09**△ 0.59±0.11 F — 14.50 15.55 11.14 8.08 6.50 1.01 P — <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 >0.05 MS组内 — 0.008 0.008 0.008 0.007 0.008 0.013 q检验:与空白对照组比较**P<0.01;与空白载体组比较△P<0.05,△△P<0.01 表 4 3组大鼠相关mRNA表达比较(x±s)
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除STAT3蛋白表达间差异无统计学意义(P>0.05)外,3组大鼠相关通路蛋白表达间差异均有统计学意义(P<0.01)。其中,观察组SOCS3、STAT5b、pSTAT5b蛋白表达均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01),IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、JAK2、pJAK2、pSTAT3蛋白表达均明显高于空白对照组和空白载体组(P<0.01);空白对照组和空白载体组各通路蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 5)。
分组 n SOCS3 IRS1 pIRS1 IRS2 pIRS2 STAT5b pSTAT5b JAK2 pJAK2 STAT3 pSTAT3 空白对照组 10 0.67±0.06 0.27±0.05 0.18±0.04 0.50±0.05 0.31±0.07 1.40±0.18 1.02±0.20 2.00±0.21 0.88±0.09 1.90±0.20 1.00±0.12 空白载体组 10 0.69±0.08 0.29±0.07 0.16±0.08 0.51±0.07 0.32±0.08 1.42±0.21 1.03±0.18 2.01±0.23 0.87±0.10 1.89±0.23 1.01±0.11 观察组 10 0.45±0.09**△△ 0.42±0.06**△△ 0.28±0.07**△△ 0.72±0.11**△△ 0.51±0.09**△△ 1.12±0.20**△△ 0.73±0.12**△△ 2.32±0.19**△△ 1.23±0.09**△△ 1.96±0.17 1.29±0.18**△△ F — 29.39 18.09 9.61 23.74 19.64 7.24 10.03 7.46 48.13 0.35 13.80 P — <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 >0.05 <0.01 MS组内 — 0.006 0.004 0.004 0.007 0.007 0.039 0.029 0.044 0.009 0.041 0.020 q检验:与空白对照组比较**P<0.01;与空白载体组比较△△P<0.01 表 5 3组大鼠胰岛素通路蛋白表达的比较(x±s)
慢病毒介导沉默SOCS3基因对糖尿病大鼠相关胰岛素通路蛋白表达的影响
Effect of lentivirus-mediated silencing SOCS3 gene on the expression of related insulin pathway proteins in diabetic rats
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摘要:
目的构建糖尿病大鼠模型,探讨慢病毒介导沉默细胞因子信号转导抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3,SOCS3)基因对大鼠相关胰岛素通路蛋白表达的影响。 方法选取SD大鼠40只,构建2型糖尿病大鼠模型成功后,随机分为空白对照组、空白载体组和观察组,各10只。空白对照组不进行其他处理,空白载体组通过大鼠尾部静脉注射空慢病毒载体,观察组通过大鼠尾部静脉注射SOCS3 RNAi慢病毒载体。注射载体4周后,测定3组大鼠血糖、血脂、胰岛素水平;采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测SOCS3、IRS1、IRS2、STAT5b、JAK2和STAT3 mRNA表达,Western blotting法检测SOCS3、IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、STAT5b、pSTAT5b、JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表达。 结果注射载体4周后,观察组大鼠空腹血糖、胰岛素、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01),高密度脂蛋白胆固醇水平均明显高于空白对照组和空白载体组(P<0.01);观察组SOCS3 mRNA和STAT5b mRNA表达均低于空白对照组和空白载体组(P<0.01),IRS1 mRNA、IRS2 mRNA和JAK2 mRNA表达均高于空白对照组和空白载体组(P<0.05~P<0.01),3组STAT3 mRNA差异无统计学意义(P>0.05);观察组SOCS3、STAT5b、pSTAT5b表达均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01),IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、JAK2、pJAK2、pSTAT3蛋白表达均明显高于空白对照组和空白载体组(P<0.01),3组STAT3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。 结论沉默SOCS3基因可降低糖尿病大鼠血糖水平,SOCS3基因可能通过相关信号通路介导胰岛素抵抗。 -
关键词:
- 糖尿病 /
- 细胞因子信号转导抑制因子3基因 /
- 胰岛素抵抗 /
- 慢病毒 /
- 大鼠
Abstract:ObjectiveTo construct the diabetic rat model, and investigate the effects of lentivirus-mediated silencing the suppressors of cytokine signaling 3(SOCS3) gene on the expression of related insulin pathway proteins in diabetic rats. MethodsForty SD rats model of type 2 diabetes were constructed, and randomly divided into the blank control group, blank vector group and observation group(10 rats each group).The blank control group was not treated, the empty lentiviral vector was injected into the tail of rats of blank vector group, and the SOCS3 RNAi lentiviral vector was injected into the tail of rats of observation group.The levels of blood glucose, blood lipid and insulin in three groups were measured after 4 weeks of injection.The expression levels of SOCS3, IRS1, IRS2, STAT5b, JAK2 and STAT3 mRNA were detected using RT-PCR, and the expression levels of SOCS3, IRS1, pIRS1, IRS2, pIRS2, STAT5b, pSTAT5b, JAK2, pJAK2, STAT3 and pSTAT3 protein were detected using Western blotting. ResultsAfter 4 weeks of injection, the levels of fasting blood glucose, insulin, TG, LDL-C and TC in observation group were significantly lower than those in blank control group and blank vector group(P<0.01), and the level of HDL-C in observation group was significantly higher than that in blank control group and blank vector group(P<0.01).The expression levels of SOCS3 and STAT5b gene mRNA in observation group were lower than those in blank control group and blank vector group(P<0.01), the expression levels of IRS1, IRS2 and JAK2 mRNA in observation group were higher than those in blank control group and blank vector group(P<0.05 to P<0.01), and the differences of the expression level of STAT3 mRNA among three groups were not statistically significant(P>0.05).The expression levels of SOCS3, STAT5b and pSTAT5b protein in observation group were significantly lower than those in blank control group and blank vector group(P<0.01), the expression levels of IRS1, pIRS1, IRS2, pIRS2, JAK2, pJAK2 and pSTAT3 protein in observation group were significantly higher than those in blank control group and blank vector group(P<0.01), and the differences of the levels of STAT3 protein among three groups were not statistically significant(P>0.05). ConclusionsSilencing the SOCS3 gene can reduce the blood glucose level in diabetic rats, and the SOCS3 gene may mediate insulin resistance through related pathways. -
Key words:
- diabetes mellitus /
- suppressors of cytokine signaling 3 gene /
- insulin resistance /
- lentivirus /
- rat
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表 1 各目的基因引物序列
目的基因 引物序列 GAPDH 上游引物 5′-GGT CAT TCA TCT GCA TCG GTA GTG-3′ 下游引物 5′-AGC GAG TGA GCT AGT GCG TCA TC-3′ SOCS3 上游引物 5′-CAA GAG GTC CTG TCT TCA GAT G-3′ 下游引物 5′-TCT GTA GTC CAT TTC CTG GTT CA-3′ IRS1 上游引物 5′- GAG ATG GAG AGC CCA CAG ATG -3′ 下游引物 5′- CTA GAG GTC TCG CAA CGT CCG-3′ IRS2 上游引物 5′-ACG CCT AAT GGA TCC GTC ACA A-3′ 下游引物 5′- ATG TGC AGT GAT TCT CCG ACT G-3′ STAT5b 上游引物 5′-GTG ATA AAG GTT TCG GTT GCT G-3′ 下游引物 5′-TGT ATC TGT GAC TCC TAG TCT G-3′ JAK2 上游引物 5′-CGT CAG ACA CCC AGT GGT CCT G-3′ 下游引物 5′-ATG CTG CTG AGG CGT CGA GAG G-3′ STAT3 上游引物 5′-AAC GTG TGA TAG CTA TGT GTA CG-3′ 下游引物 5′-CTC TGT GAT CTG ACA TCG TGC AT-3′ 表 2 3组大鼠不同时点体质量比较(x±s;g)
分组 n 入组时 构建糖尿病模型后 注入载体后4周 空白对照组 10 201.63±25.47 352.77±33.84 398.41±32.18 空白载体组 10 208.77±18.23 361.93±23.46** 403.27±29.22 观察组 10 205.93±20.18 359.85±29.84** 411.36±31.56 F — 0.28 45.22 0.44 P — >0.05 <0.01 >0.05 MS组内 — 462.762 861.981 961.798 q检验:与空白对照组比较**P<0.01 表 3 3组大鼠血糖、胰岛素和血脂水平比较(x±s)
分组 n 空腹血糖/(mmol/L) 胰岛素/(mU/L) HDL-C/(mmol/L) TG/(mmol/L) LDL-C/(mmol/L) TC/(mmol/L) 空白对照组 10 19.28±2.57 26.18±2.87 1.10±0.17 1.82±0.24 1.98±0.23 3.15±0.31 空白载体组 10 20.14±3.42 25.36±3.22 1.03±0.21 1.79±0.21 1.95±0.21 3.11±0.25 观察组 10 12.37±3.10**△△ 14.26±3.26**△△ 1.58±0.33**△△ 1.03±0.19**△△ 1.29±0.13**△△ 2.10±0.34**△△ F — 19.50 45.49 14.78 43.64 40.06 38.73 P — <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 MS组内 — 9.303 9.744 0.061 0.046 0.038 0.091 q检验:与空白对照组比较**P<0.01;与空白载体组比较△△P<0.01 表 4 3组大鼠相关mRNA表达比较(x±s)
分组 n SOCS3 IRS1 IRS2 STAT5b JAK2 STAT3 空白对照组 10 0.60±0.09 0.36±0.10 0.34±0.08 0.64±0.10 0.40±0.09 0.52±0.11 空白载体组 10 0.62±0.11 0.37±0.08 0.35±0.09 0.66±0.07 0.42±0.08 0.54±0.12 观察组 10 0.42±0.07**△△ 0.56±0.09**△△ 0.51±0.10**△△ 0.52±0.08**△△ 0.53±0.09**△ 0.59±0.11 F — 14.50 15.55 11.14 8.08 6.50 1.01 P — <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 >0.05 MS组内 — 0.008 0.008 0.008 0.007 0.008 0.013 q检验:与空白对照组比较**P<0.01;与空白载体组比较△P<0.05,△△P<0.01 表 5 3组大鼠胰岛素通路蛋白表达的比较(x±s)
分组 n SOCS3 IRS1 pIRS1 IRS2 pIRS2 STAT5b pSTAT5b JAK2 pJAK2 STAT3 pSTAT3 空白对照组 10 0.67±0.06 0.27±0.05 0.18±0.04 0.50±0.05 0.31±0.07 1.40±0.18 1.02±0.20 2.00±0.21 0.88±0.09 1.90±0.20 1.00±0.12 空白载体组 10 0.69±0.08 0.29±0.07 0.16±0.08 0.51±0.07 0.32±0.08 1.42±0.21 1.03±0.18 2.01±0.23 0.87±0.10 1.89±0.23 1.01±0.11 观察组 10 0.45±0.09**△△ 0.42±0.06**△△ 0.28±0.07**△△ 0.72±0.11**△△ 0.51±0.09**△△ 1.12±0.20**△△ 0.73±0.12**△△ 2.32±0.19**△△ 1.23±0.09**△△ 1.96±0.17 1.29±0.18**△△ F — 29.39 18.09 9.61 23.74 19.64 7.24 10.03 7.46 48.13 0.35 13.80 P — <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 >0.05 <0.01 MS组内 — 0.006 0.004 0.004 0.007 0.007 0.039 0.029 0.044 0.009 0.041 0.020 q检验:与空白对照组比较**P<0.01;与空白载体组比较△△P<0.01 -
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