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地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根。始载于《神农本草经》,列为上品,现代被誉为“四大怀药”之一。生地黄经不同炮制方法,加工成熟地黄后,其药性由寒转温,味由苦转甘,功效由清转补,具有补血滋阴、益精填髓的功效[1]。熟地黄临床应用广泛,属于高配方频度中药之一。然而因其味甘而腻,易于助湿生满,有碍脾胃消化吸收,病人服用后,会出现滋腻碍胃的现象,即胃纳欠佳、腹胀、便溏等反应[2]。明代李时珍在《本草纲目》首次记载用酒和砂仁炮制地黄,指出因熟地黄质厚味浓,滋腻碍脾,酒制后其性转温,主补阴血,并可借酒力行散,起到行药势、通血脉的作用,同时借助砂仁香窜之性,合和五脏冲合之气,归宿丹田。
目前熟地黄常用的炮制方法有2015版《中国药典》中收录的清蒸法和酒炖法,这两种炮制方法中均未加入辛香类药物。2005版《河南省中药饮片炮制规范》中收录的九蒸九晒法,加入了砂仁。因此,本实验分别选用清蒸法、酒炖法和九蒸九晒法3种方法炮制的熟地黄为供试品,通过建立HPLC法同时测定熟地黄中梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛(5-HMF)7种化学成分含量,考察不同炮制方法对熟地黄主要化学成分的影响,以期为熟地黄临床应用和综合开发利用提供实验依据。
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通过比较空白溶液、对照品溶液和供试品溶液的色谱图考察专属性。结果表明,供试品溶液中其他成分对待测成分无干扰,分析方法专属性良好,色谱图见图 1~3。
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取各对照品溶液适量,加入甲醇溶液逐步稀释,以信噪比3时对应待测物浓度为检测限,以信噪比10时对应待测物浓度为定量限进行测定,结果见表 1。
对照品 检出限/(μg/g) 定量限/(μg/g) 梓醇 7.18 23.92 异毛蕊花糖苷 2.60 8.66 毛蕊花糖苷 3.35 11.15 益母草苷 59.29 197.63 地黄苷A 10.36 34.53 地黄苷D 13.26 44.20 5-HMF 6.75 22.50 表 1 各对照品的检出限和定量限
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分别精密量取梓醇、异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、5-HMF对照品储备液适量置5 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,制得浓度分别为271.46、12.99、40.70、711.48、224.42、806.74、309.38 μg/mL的混合对照品工作液。按高效液相色谱条件分别精密吸取混合对照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.5 μL,依法测定,记录色谱峰的峰面积,以各对照品浓度X (μg/mL)为横坐标,峰面积Y为纵坐标,绘制标准曲线,进行回归计算,结果见表 2。
成分 回归方程 R2 线性范围/μg 梓醇 Y=9.157 4X-0.066 7 0.999 1 0.108 6~0.678 7 益母草苷 Y=6.504 9X-0.045 6 0.999 2 0.142 3~1.565 3 地黄苷A Y=9.254 6X-0.003 5 0.999 4 0.044 9~0.493 7 地黄苷D Y=6.646 3-0.008 0.999 6 0.161 3~1.774 8 毛蕊花糖苷 Y=17.233X+0.0335 0.999 4 0.008 1~0.101 8 异毛蕊花糖苷 Y=12.985X+0.0114 0.999 6 0.002 6~0.039 0 5-HMF Y=17.275X-0.2451 0.999 2 0.061 9~1.237 5 表 2 各成分线性关系
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精密吸取对照品溶液,在色谱条件下进样6次,每次5 μL,测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.41、0.67、1.14、1.88、0.33、1.71、0.46,表明仪器精密度良好。
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精密吸取同一供试品溶液,在色谱条件下分别于0、1、3、5、12、24 h测定,测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.38、0.94、1.19、0.94、0.70、0.90、0.45,表明溶液在24 h内稳定性良好。
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取清蒸熟地黄,按1.6方法平行制备供试品溶液6份,在色谱条件下,测得毛梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.81、0.85、1.36、1.36、0.67、1.22、0.42,表明该方法重复性良好。
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精密称取清蒸熟地黄粉末9份,每份1 g,精密秤定,精密加入对照品适量。按“1.6”项下方法制备供试品溶液,在色谱条件下,测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF平均加样回收率RSD分别为1.51、1.14、1.14、0.84、1.44、1.23、1.28。
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取生地黄、清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄各约2 g,精密称定,按“供试品溶液的制备”项下操作,制备供试品溶液,按“高效液相色谱条件”进样5 μL,测定峰面积,采用外标法对梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF的含量进行测定,结果见表 3。
炮制方法 各成分含量/(mg/g) 梓醇 益母草苷 地黄苷A 地黄苷D 毛蕊花糖苷F 异毛蕊花糖苷 5-HMF 生地黄 6.82 2.14 1.09 2.24 1.00 8.68 0 清蒸熟地黄 0 0 0.13 0.85 0.11 0.62 0.56 酒炖熟地黄 0 0 0.22 1.02 0.17 0.95 0.45 九蒸九晒熟地黄 0 0 0 0 0 0 2.29 表 3 样品测定结果(n=3)
不同炮制方法对熟地黄中7种化学成分含量的影响
Effect of different processing methods on the contents of seven chemical components in Rehmanniae Radix Praeparata
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摘要:
目的通过建立熟地黄中梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和5-羟甲基糠醛(5-HMF)7种化学成分同时分析的方法,测定清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄3种不同炮制品中7种化学成分的含量,探讨不同炮制方法对熟地黄中化学成分的影响。 方法采用超声提取法处理熟地黄3种不同炮制品,赛默飞C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:0.1%磷酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱,程序为:0~8 min,1% B;8~9 min,1%~4% B;9~25 min,4% B;25~35 min,4%~20% B;35~50 min,20% B;50~50.01 min,20%~1% B;50.01~55 min,1% B。柱温:30℃,检测波长:203 nm、332 nm,测定3种样品中7种化学成分的含量。 结果生地黄中未检出5-HMF。清蒸熟地黄和酒炖熟地黄中,环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷几乎全部降解;环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量较生地黄中含量降低;可以检测到5-HMF。九蒸九晒熟地黄中环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷、环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷几乎全部降解;可以检测到5-HMF。 结论不同炮制方法对熟地黄成分的影响较大,该方法可用于熟地黄不同炮制品的质量控制。 Abstract:ObjectiveTo establish a method for simultaneous analysis of catalpol, leonurus glycoside, rehmannin A, rehmannin D, pilose glycoside, isostaminoside and 5-HMF in Rehmanniae Radix Praeparata, and determine the contents of seven chemical constituents in three different processed products of steamed rehmannia glutinosa; rehmannia rehmannia stewed in wine; nine steam nine sun cooked rehmannia, and explore the effects of different processing methods on the chemical constituents of Rehmanniae Rodix Praeparata. MethodsThree different processed products of Rehmanniae Rodix Praeparata were extracted by ultrasonic extraction, and Thermo C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used.The mobile phase was 0.1% phosphoric acid(A)-acetonitrile(B), the gradient elution procedure was 0-8min, 1%B; 8-9min, 1%-4%B; 9-25min, 4%B; 25-35min, 4%-20%B; 35-50min, 20%B; 50-50.01min, 20%-1%B and 50.01-55min, 1%B.The column temperature was 30℃, the detection wavelength was 203nm and 332nm, and the contents of seven chemical constituents in three samples were determined. ResultsThe 5-HMF was not detected in radix rehmanniae.In steamed Rehmanniae Rodix Praeparata and stewed Rehmanniae Rodix Praeparata in wine, the cycliterpene monoglycoside catalpol and leonurus glycoside were almost complete degraded, the contents of iridoid diterpenoid glycoside rehmannin A, rehmannin D, phenylpropanoid glycoside piloside and isobruchin glycoside were low compared with Rehmanniae Radix, and 5-HMF could be detected.The cyclioterpene monoglycoside catalpol, leonurus glycoside, cyclioterpene diglycoside rehmanin A, rehmanin D, phenylpropyl glycoside mullein glycoside and isomullein glycoside were almost degraded, and 5-HMF could be detected in nine steam nine sun cooked rehmannia. ConclusionDifferent processing methods have great influence on the components of decoctian piecesof.This method can be used for the quality control of Rehmanniae Radix Praeparata. -
表 1 各对照品的检出限和定量限
对照品 检出限/(μg/g) 定量限/(μg/g) 梓醇 7.18 23.92 异毛蕊花糖苷 2.60 8.66 毛蕊花糖苷 3.35 11.15 益母草苷 59.29 197.63 地黄苷A 10.36 34.53 地黄苷D 13.26 44.20 5-HMF 6.75 22.50 表 2 各成分线性关系
成分 回归方程 R2 线性范围/μg 梓醇 Y=9.157 4X-0.066 7 0.999 1 0.108 6~0.678 7 益母草苷 Y=6.504 9X-0.045 6 0.999 2 0.142 3~1.565 3 地黄苷A Y=9.254 6X-0.003 5 0.999 4 0.044 9~0.493 7 地黄苷D Y=6.646 3-0.008 0.999 6 0.161 3~1.774 8 毛蕊花糖苷 Y=17.233X+0.0335 0.999 4 0.008 1~0.101 8 异毛蕊花糖苷 Y=12.985X+0.0114 0.999 6 0.002 6~0.039 0 5-HMF Y=17.275X-0.2451 0.999 2 0.061 9~1.237 5 表 3 样品测定结果(n=3)
炮制方法 各成分含量/(mg/g) 梓醇 益母草苷 地黄苷A 地黄苷D 毛蕊花糖苷F 异毛蕊花糖苷 5-HMF 生地黄 6.82 2.14 1.09 2.24 1.00 8.68 0 清蒸熟地黄 0 0 0.13 0.85 0.11 0.62 0.56 酒炖熟地黄 0 0 0.22 1.02 0.17 0.95 0.45 九蒸九晒熟地黄 0 0 0 0 0 0 2.29 -
[1] 李娴, 卫向龙, 庄蕴丁, 等.比较熟地黄不同炮制品引起大鼠滋腻碍胃现象的实验研究[J].中国临床药理学杂志, 2017, 33(14):1336. [2] 王芳, 于欢, 李风琴, 等.砂仁制地黄的炮制工艺分析[J].中国实验方剂学杂志, 2018, 24(18):5. [3] 国家药典委员会.中国药典: 一部[S].北京: 中国医药科技出版社, 2015. [4] 河南省食品药品监督管理局.河南省中药饮片炮制规范[M].郑州:河南人民出版社, 2005. [5] 韩笑, 匡宇, 赵永艳, 等.九蒸九晒黄精5-HMF含量的变化[J].中药与临床, 2018, 9(3):4. [6] 田伟, 甄亚钦, 范帅帅, 等.高效液相色谱法同时测定车前子配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量[J].中国药学杂志, 2018, 53(2):140.