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地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根。始载于《神农本草经》，列为上品，现代被誉为“四大怀药”之一。生地黄经不同炮制方法，加工成熟地黄后，其药性由寒转温，味由苦转甘，功效由清转补，具有补血滋阴、益精填髓的功效[1]。熟地黄临床应用广泛，属于高配方频度中药之一。然而因其味甘而腻，易于助湿生满，有碍脾胃消化吸收，病人服用后，会出现滋腻碍胃的现象，即胃纳欠佳、腹胀、便溏等反应[2]。明代李时珍在《本草纲目》首次记载用酒和砂仁炮制地黄，指出因熟地黄质厚味浓，滋腻碍脾，酒制后其性转温，主补阴血，并可借酒力行散，起到行药势、通血脉的作用，同时借助砂仁香窜之性，合和五脏冲合之气，归宿丹田。
目前熟地黄常用的炮制方法有2015版《中国药典》中收录的清蒸法和酒炖法，这两种炮制方法中均未加入辛香类药物。2005版《河南省中药饮片炮制规范》中收录的九蒸九晒法，加入了砂仁。因此，本实验分别选用清蒸法、酒炖法和九蒸九晒法3种方法炮制的熟地黄为供试品，通过建立HPLC法同时测定熟地黄中梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛(5-HMF)7种化学成分含量，考察不同炮制方法对熟地黄主要化学成分的影响，以期为熟地黄临床应用和综合开发利用提供实验依据。
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赛默飞UltiMate3000型高相液相色谱仪(美国赛默飞科技公司，配置在线脱气机、四元泵、自动进样器、DAD检测器)，赛默飞色谱工作站(美国赛默飞科技公司)；KQ-600KDE1超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司；XS105分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；AL204分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；FW100粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。
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梓醇(中国食品药品检定研究院，批号：110808-201711，纯度99.6%)，益母草苷(合肥博美生物科技有限责任公司，批号：YA220607，纯度≥98%)，地黄苷A(合肥博美生物科技有限责任公司，批号：DR192237，纯度≥98%)，地黄苷D(合肥博美生物科技有限责任公司，批号：DR210025，纯度≥98%)，毛蕊花糖苷(中国食品药品检定研究院，批号：111530-201713，纯度92.5%)，异毛蕊花糖苷(合肥博美生物科技有限责任公司，批号：YI3306019，纯度≥98%)，5-HMF(中国食品药品检定研究院，批号：111626-201711，纯度99.4%)，甲醇、乙腈为色谱纯(美国天地有限公司)，磷酸为分析纯(上海凌峰化学试剂有限公司)，水为娃哈哈纯净水。
黄酒(中国绍兴黄酒集团有限公司，生产批号：20170627，酒精度15%)；地黄Rehmanniae Radix(产地河南)、砂仁Amomi Fructus(产地广东)，均购自蚌埠医学院第二附属医院，经蚌埠医学院王迪生副教授鉴定，符合《中国药典》2015年版要求[5]。
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色谱柱：赛默飞C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.1%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，程序为：0~8 min，1%B；8~9 min，1%~4%B；9~25 min，4%B；25~35 min，4%~20%B；35~50 min，20%B；50~50.01 min，20%~1%B；50.01~55 min，1%B。柱温：30 ℃；检测波长：203 nm、332 nm，波长切换：0.00~29.00 min，波长203 nm，29.01~55.00 min，332 nm；进样量：1 μL。
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取生地黄，蒸制12 h，闷12 h后，上下翻动1次，如此反复蒸闷2次，70 ℃干燥至熟地黄饮片的含水量≤15.0%时取出，放凉即得[3]。
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取生地黄，加入黄酒拌匀，每100 kg生地黄用黄酒40 kg[3]，闷润至酒吸尽，连续炖制48 h后(炖制24 h时，上下翻动1次)，70 ℃干燥至熟地黄饮片的含水量≤15.0%时取出，放凉即得。
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取生地黄，加黄酒适量拌匀一段时间后闷润至酒吸尽，以武火加热，用容器收集流出的熟地黄汁，蒸约48 h至地黄中央发虚为度，取出，晒1 d；再拌入熟地黄汁和黄酒，再蒸24 h，取出再晒1 d；如此反复，蒸晒8次。至第9次，将黄酒与砂仁粉一起拌入，蒸24 h，以蒸至内外漆黑，味甜酸无苦味为度，取出即得。每100 kg生地黄用黄酒50 kg、砂仁粉0.9 kg[4]。
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分别取梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF对照品适量，精密称定，加入甲醇溶解制成质量浓度分别为2.1892、2.1658、2.0350、3.5574、2.2442、2.0168、2.0626 mg/mL的混合对照品储备液。
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取生地黄、清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄经粉碎(过4号筛)所得的粉末约2.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，精密称重，30 ℃水温超声处理40 min，过滤，放冷，补重，精密量取滤液25 mL，水浴蒸干，残渣加10%乙腈溶解，转移至10 mL量瓶中并定容，备用。
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分别取混合对照品溶液和供试品溶液，按“1.3 HPLC色谱条件”进样分析，各色谱峰的拖尾因子均在0.95~1.05之间，与相邻色谱峰的分离度大于1.5，梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF的理论塔板数均大于6 800。
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通过比较空白溶液、对照品溶液和供试品溶液的色谱图考察专属性。结果表明，供试品溶液中其他成分对待测成分无干扰，分析方法专属性良好，色谱图见图 1~3。
图 1 混合对照品HPLC图
图 2 生地黄样品HPLC图
图 3 九蒸九晒熟地黄样品HPLC图
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取各对照品溶液适量，加入甲醇溶液逐步稀释，以信噪比3时对应待测物浓度为检测限，以信噪比10时对应待测物浓度为定量限进行测定，结果见表 1。
对照品 检出限/(μg/g) 定量限/(μg/g) 梓醇 7.18 23.92 异毛蕊花糖苷 2.60 8.66 毛蕊花糖苷 3.35 11.15 益母草苷 59.29 197.63 地黄苷A 10.36 34.53 地黄苷D 13.26 44.20 5-HMF 6.75 22.50 表 1 各对照品的检出限和定量限
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分别精密量取梓醇、异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、5-HMF对照品储备液适量置5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得浓度分别为271.46、12.99、40.70、711.48、224.42、806.74、309.38 μg/mL的混合对照品工作液。按高效液相色谱条件分别精密吸取混合对照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.5 μL，依法测定，记录色谱峰的峰面积，以各对照品浓度X (μg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归计算，结果见表 2。
成分 回归方程 R2 线性范围/μg 梓醇 Y=9.157 4X-0.066 7 0.999 1 0.108 6~0.678 7 益母草苷 Y=6.504 9X-0.045 6 0.999 2 0.142 3~1.565 3 地黄苷A Y=9.254 6X-0.003 5 0.999 4 0.044 9~0.493 7 地黄苷D Y=6.646 3-0.008 0.999 6 0.161 3~1.774 8 毛蕊花糖苷 Y=17.233X+0.0335 0.999 4 0.008 1~0.101 8 异毛蕊花糖苷 Y=12.985X+0.0114 0.999 6 0.002 6~0.039 0 5-HMF Y=17.275X-0.2451 0.999 2 0.061 9~1.237 5 表 2 各成分线性关系
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精密吸取对照品溶液，在色谱条件下进样6次，每次5 μL，测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.41、0.67、1.14、1.88、0.33、1.71、0.46，表明仪器精密度良好。
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精密吸取同一供试品溶液，在色谱条件下分别于0、1、3、5、12、24 h测定，测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.38、0.94、1.19、0.94、0.70、0.90、0.45，表明溶液在24 h内稳定性良好。
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取清蒸熟地黄，按1.6方法平行制备供试品溶液6份，在色谱条件下，测得毛梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.81、0.85、1.36、1.36、0.67、1.22、0.42，表明该方法重复性良好。
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精密称取清蒸熟地黄粉末9份，每份1 g，精密秤定，精密加入对照品适量。按“1.6”项下方法制备供试品溶液，在色谱条件下，测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF平均加样回收率RSD分别为1.51、1.14、1.14、0.84、1.44、1.23、1.28。
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取生地黄、清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄各约2 g，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下操作，制备供试品溶液，按“高效液相色谱条件”进样5 μL，测定峰面积，采用外标法对梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF的含量进行测定，结果见表 3。
炮制方法 各成分含量/(mg/g) 梓醇 益母草苷 地黄苷A 地黄苷D 毛蕊花糖苷F 异毛蕊花糖苷 5-HMF 生地黄 6.82 2.14 1.09 2.24 1.00 8.68 0 清蒸熟地黄 0 0 0.13 0.85 0.11 0.62 0.56 酒炖熟地黄 0 0 0.22 1.02 0.17 0.95 0.45 九蒸九晒熟地黄 0 0 0 0 0 0 2.29 表 3 样品测定结果(n=3)
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本实验首次建立了同时测定熟地黄中梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF含量的HPLC方法。测定了熟地黄3种不同炮制品，即清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄中以梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D为主的环烯醚萜苷类成分，以毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷为主的苯丙素苷类成分，以及5-HMF的含量。实验预试中，经查阅文献，5-HMF的提取方法主要有水浴回流提取和超声提取两种方法[5]。考虑到回流提取的加热过程中，可能会使熟地黄中的多糖自身发生水解、脱水反应生成5-HMF，导致5-HMF含量偏高，实验数据不准确。故本实验采用超声提取方法，制备供试品溶液。
本实验结果显示，生地黄中不含5-HMF。清蒸熟地黄和酒炖熟地黄中，环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷几乎全部降解；环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量较生地黄中含量降低；可以检测到5-HMF。九蒸九晒熟地黄中环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷、环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷几乎全部降解；可以检测到5-HMF。
通过实验数据分析可知，由于梓醇和益母草苷都是环烯醚萜单糖苷，热稳定较差，地黄经过清蒸、酒炖和九蒸九晒加热过程后，其含量降低至几乎全部降解。地黄苷A和地黄苷D是环烯醚萜双糖苷，毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷属于苯丙素苷，均相对稳定，在清蒸熟地黄和酒炖熟地黄中均可以检测到，但较生地黄含量下降。可能因为毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为咖啡酸酯，在炮制过程中发生酯键的断裂，从而生成咖啡酸[6]。而九蒸九晒熟地黄蒸晒次数较多，上述成分几乎全部降解。地黄在清蒸、酒炖和九蒸九晒过程中发生了Maillard反应，生成了5-HMF。5-HMF在含糖中药的炮制过程中都有可能生成，与炮制时间和温度密切相关，现已成为中药炮制原理研究的活性成分，具有抗心肌缺血、抗氧化、降血糖、改变血液流变性和神经保护性作用[5]。
综上，通过测定熟地黄3种不同炮制品中7种化学成分的含量，可知不同炮制方法对熟地黄成分的影响较大，尤其是九蒸九晒熟地黄在反复蒸晒过程中苷类逐渐降解，其生成何种化合物，与九蒸九晒熟地黄增效袪腻药效变化是否有关，值得进一步深入研究。
不同炮制方法对熟地黄中7种化学成分含量的影响
Effect of different processing methods on the contents of seven chemical components in Rehmanniae Radix Praeparata
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摘要:
目的通过建立熟地黄中梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和5-羟甲基糠醛（5-HMF）7种化学成分同时分析的方法，测定清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄3种不同炮制品中7种化学成分的含量，探讨不同炮制方法对熟地黄中化学成分的影响。 方法采用超声提取法处理熟地黄3种不同炮制品，赛默飞C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱，程序为：0~8 min，1% B；8~9 min，1%~4% B；9~25 min，4% B；25~35 min，4%~20% B；35~50 min，20% B；50~50.01 min，20%~1% B；50.01~55 min，1% B。柱温：30℃，检测波长：203 nm、332 nm，测定3种样品中7种化学成分的含量。 结果生地黄中未检出5-HMF。清蒸熟地黄和酒炖熟地黄中，环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷几乎全部降解；环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量较生地黄中含量降低；可以检测到5-HMF。九蒸九晒熟地黄中环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷、环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷几乎全部降解；可以检测到5-HMF。 结论不同炮制方法对熟地黄成分的影响较大，该方法可用于熟地黄不同炮制品的质量控制。 Abstract:ObjectiveTo establish a method for simultaneous analysis of catalpol, leonurus glycoside, rehmannin A, rehmannin D, pilose glycoside, isostaminoside and 5-HMF in Rehmanniae Radix Praeparata, and determine the contents of seven chemical constituents in three different processed products of steamed rehmannia glutinosa; rehmannia rehmannia stewed in wine; nine steam nine sun cooked rehmannia, and explore the effects of different processing methods on the chemical constituents of Rehmanniae Rodix Praeparata. MethodsThree different processed products of Rehmanniae Rodix Praeparata were extracted by ultrasonic extraction, and Thermo C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used.The mobile phase was 0.1% phosphoric acid(A)-acetonitrile(B), the gradient elution procedure was 0-8min, 1%B; 8-9min, 1%-4%B; 9-25min, 4%B; 25-35min, 4%-20%B; 35-50min, 20%B; 50-50.01min, 20%-1%B and 50.01-55min, 1%B.The column temperature was 30℃, the detection wavelength was 203nm and 332nm, and the contents of seven chemical constituents in three samples were determined. ResultsThe 5-HMF was not detected in radix rehmanniae.In steamed Rehmanniae Rodix Praeparata and stewed Rehmanniae Rodix Praeparata in wine, the cycliterpene monoglycoside catalpol and leonurus glycoside were almost complete degraded, the contents of iridoid diterpenoid glycoside rehmannin A, rehmannin D, phenylpropanoid glycoside piloside and isobruchin glycoside were low compared with Rehmanniae Radix, and 5-HMF could be detected.The cyclioterpene monoglycoside catalpol, leonurus glycoside, cyclioterpene diglycoside rehmanin A, rehmanin D, phenylpropyl glycoside mullein glycoside and isomullein glycoside were almost degraded, and 5-HMF could be detected in nine steam nine sun cooked rehmannia. ConclusionDifferent processing methods have great influence on the components of decoctian piecesof.This method can be used for the quality control of Rehmanniae Radix Praeparata. -
表 1 各对照品的检出限和定量限
对照品 检出限/(μg/g) 定量限/(μg/g) 梓醇 7.18 23.92 异毛蕊花糖苷 2.60 8.66 毛蕊花糖苷 3.35 11.15 益母草苷 59.29 197.63 地黄苷A 10.36 34.53 地黄苷D 13.26 44.20 5-HMF 6.75 22.50 
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表 2 各成分线性关系
成分 回归方程 R2 线性范围/μg 梓醇 Y=9.157 4X-0.066 7 0.999 1 0.108 6~0.678 7 益母草苷 Y=6.504 9X-0.045 6 0.999 2 0.142 3~1.565 3 地黄苷A Y=9.254 6X-0.003 5 0.999 4 0.044 9~0.493 7 地黄苷D Y=6.646 3-0.008 0.999 6 0.161 3~1.774 8 毛蕊花糖苷 Y=17.233X+0.0335 0.999 4 0.008 1~0.101 8 异毛蕊花糖苷 Y=12.985X+0.0114 0.999 6 0.002 6~0.039 0 5-HMF Y=17.275X-0.2451 0.999 2 0.061 9~1.237 5
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表 3 样品测定结果(n=3)
炮制方法 各成分含量/(mg/g) 梓醇 益母草苷 地黄苷A 地黄苷D 毛蕊花糖苷F 异毛蕊花糖苷 5-HMF 生地黄 6.82 2.14 1.09 2.24 1.00 8.68 0 清蒸熟地黄 0 0 0.13 0.85 0.11 0.62 0.56 酒炖熟地黄 0 0 0.22 1.02 0.17 0.95 0.45 九蒸九晒熟地黄 0 0 0 0 0 0 2.29
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[1] 李娴, 卫向龙, 庄蕴丁, 等.比较熟地黄不同炮制品引起大鼠滋腻碍胃现象的实验研究[J].中国临床药理学杂志, 2017, 33(14):1336. [2] 王芳, 于欢, 李风琴, 等.砂仁制地黄的炮制工艺分析[J].中国实验方剂学杂志, 2018, 24(18):5. [3] 国家药典委员会.中国药典: 一部[S].北京: 中国医药科技出版社, 2015. [4] 河南省食品药品监督管理局.河南省中药饮片炮制规范[M].郑州:河南人民出版社, 2005. [5] 韩笑, 匡宇, 赵永艳, 等.九蒸九晒黄精5-HMF含量的变化[J].中药与临床, 2018, 9(3):4. [6] 田伟, 甄亚钦, 范帅帅, 等.高效液相色谱法同时测定车前子配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量[J].中国药学杂志, 2018, 53(2):140. -
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