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不同炮制方法对熟地黄中7种化学成分含量的影响

李娴 邢亚东 李姗姗 刘浩

引用本文:
Citation:

不同炮制方法对熟地黄中7种化学成分含量的影响

    作者简介: 李娴(1979-), 女, 博士, 副教授
    通讯作者: 刘浩, liuhao6886@foxmail.com
  • 基金项目:

    国家自然科学基金面上项目 81372899

    安徽省高校自然科学研究重点项目 KJ2018A0983

  • 中图分类号: R283

Effect of different processing methods on the contents of seven chemical components in Rehmanniae Radix Praeparata

    Corresponding author: LIU Hao, liuhao6886@foxmail.com
  • CLC number: R283

  • 摘要: 目的通过建立熟地黄中梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和5-羟甲基糠醛(5-HMF)7种化学成分同时分析的方法,测定清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄3种不同炮制品中7种化学成分的含量,探讨不同炮制方法对熟地黄中化学成分的影响。方法采用超声提取法处理熟地黄3种不同炮制品,赛默飞C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:0.1%磷酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱,程序为:0~8 min,1% B;8~9 min,1%~4% B;9~25 min,4% B;25~35 min,4%~20% B;35~50 min,20% B;50~50.01 min,20%~1% B;50.01~55 min,1% B。柱温:30℃,检测波长:203 nm、332 nm,测定3种样品中7种化学成分的含量。结果生地黄中未检出5-HMF。清蒸熟地黄和酒炖熟地黄中,环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷几乎全部降解;环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量较生地黄中含量降低;可以检测到5-HMF。九蒸九晒熟地黄中环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷、环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷几乎全部降解;可以检测到5-HMF。结论不同炮制方法对熟地黄成分的影响较大,该方法可用于熟地黄不同炮制品的质量控制。
  • 图 1  混合对照品HPLC图

    图 2  生地黄样品HPLC图

    图 3  九蒸九晒熟地黄样品HPLC图

    表 1  各对照品的检出限和定量限

    对照品 检出限/(μg/g) 定量限/(μg/g)
    梓醇 7.18 23.92
    异毛蕊花糖苷 2.60 8.66
    毛蕊花糖苷 3.35 11.15
    益母草苷 59.29 197.63
    地黄苷A 10.36 34.53
    地黄苷D 13.26 44.20
    5-HMF 6.75 22.50
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    表 2  各成分线性关系

    成分 回归方程 R2 线性范围/μg
    梓醇 Y=9.157 4X-0.066 7 0.999 1 0.108 6~0.678 7
    益母草苷 Y=6.504 9X-0.045 6 0.999 2 0.142 3~1.565 3
    地黄苷A Y=9.254 6X-0.003 5 0.999 4 0.044 9~0.493 7
    地黄苷D Y=6.646 3-0.008 0.999 6 0.161 3~1.774 8
    毛蕊花糖苷 Y=17.233X+0.0335 0.999 4 0.008 1~0.101 8
    异毛蕊花糖苷 Y=12.985X+0.0114 0.999 6 0.002 6~0.039 0
    5-HMF Y=17.275X-0.2451 0.999 2 0.061 9~1.237 5
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    表 3  样品测定结果(n=3)

    炮制方法 各成分含量/(mg/g)
    梓醇 益母草苷 地黄苷A 地黄苷D 毛蕊花糖苷F 异毛蕊花糖苷 5-HMF
    生地黄 6.82 2.14 1.09 2.24 1.00 8.68 0
    清蒸熟地黄 0 0 0.13 0.85 0.11 0.62 0.56
    酒炖熟地黄 0 0 0.22 1.02 0.17 0.95 0.45
    九蒸九晒熟地黄 0 0 0 0 0 0 2.29
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    [3] 朱海彬初中岑曦 . 生脉地黄汤加减联合中药保留灌肠疗法治疗糖尿病肾病Ⅲ~Ⅳ期病人的疗效观察. 蚌埠医学院学报, 2022, 47(10): 1377-1382. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2022.10.011
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-03-05
  • 录用日期:  2019-05-10
  • 刊出日期:  2020-05-15

不同炮制方法对熟地黄中7种化学成分含量的影响

    通讯作者: 刘浩, liuhao6886@foxmail.com
    作者简介: 李娴(1979-), 女, 博士, 副教授
  • 蚌埠医学院 药学院, 安徽 蚌埠 233030
基金项目:  国家自然科学基金面上项目 81372899安徽省高校自然科学研究重点项目 KJ2018A0983

摘要: 目的通过建立熟地黄中梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和5-羟甲基糠醛(5-HMF)7种化学成分同时分析的方法,测定清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄3种不同炮制品中7种化学成分的含量,探讨不同炮制方法对熟地黄中化学成分的影响。方法采用超声提取法处理熟地黄3种不同炮制品,赛默飞C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:0.1%磷酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱,程序为:0~8 min,1% B;8~9 min,1%~4% B;9~25 min,4% B;25~35 min,4%~20% B;35~50 min,20% B;50~50.01 min,20%~1% B;50.01~55 min,1% B。柱温:30℃,检测波长:203 nm、332 nm,测定3种样品中7种化学成分的含量。结果生地黄中未检出5-HMF。清蒸熟地黄和酒炖熟地黄中,环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷几乎全部降解;环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量较生地黄中含量降低;可以检测到5-HMF。九蒸九晒熟地黄中环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷、环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷几乎全部降解;可以检测到5-HMF。结论不同炮制方法对熟地黄成分的影响较大,该方法可用于熟地黄不同炮制品的质量控制。

English Abstract

  • 地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根。始载于《神农本草经》,列为上品,现代被誉为“四大怀药”之一。生地黄经不同炮制方法,加工成熟地黄后,其药性由寒转温,味由苦转甘,功效由清转补,具有补血滋阴、益精填髓的功效[1]。熟地黄临床应用广泛,属于高配方频度中药之一。然而因其味甘而腻,易于助湿生满,有碍脾胃消化吸收,病人服用后,会出现滋腻碍胃的现象,即胃纳欠佳、腹胀、便溏等反应[2]。明代李时珍在《本草纲目》首次记载用酒和砂仁炮制地黄,指出因熟地黄质厚味浓,滋腻碍脾,酒制后其性转温,主补阴血,并可借酒力行散,起到行药势、通血脉的作用,同时借助砂仁香窜之性,合和五脏冲合之气,归宿丹田。

    目前熟地黄常用的炮制方法有2015版《中国药典》中收录的清蒸法和酒炖法,这两种炮制方法中均未加入辛香类药物。2005版《河南省中药饮片炮制规范》中收录的九蒸九晒法,加入了砂仁。因此,本实验分别选用清蒸法、酒炖法和九蒸九晒法3种方法炮制的熟地黄为供试品,通过建立HPLC法同时测定熟地黄中梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-羟甲基糠醛(5-HMF)7种化学成分含量,考察不同炮制方法对熟地黄主要化学成分的影响,以期为熟地黄临床应用和综合开发利用提供实验依据。

    • 赛默飞UltiMate3000型高相液相色谱仪(美国赛默飞科技公司,配置在线脱气机、四元泵、自动进样器、DAD检测器),赛默飞色谱工作站(美国赛默飞科技公司);KQ-600KDE1超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司;XS105分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);AL204分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);FW100粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

    • 梓醇(中国食品药品检定研究院,批号:110808-201711,纯度99.6%),益母草苷(合肥博美生物科技有限责任公司,批号:YA220607,纯度≥98%),地黄苷A(合肥博美生物科技有限责任公司,批号:DR192237,纯度≥98%),地黄苷D(合肥博美生物科技有限责任公司,批号:DR210025,纯度≥98%),毛蕊花糖苷(中国食品药品检定研究院,批号:111530-201713,纯度92.5%),异毛蕊花糖苷(合肥博美生物科技有限责任公司,批号:YI3306019,纯度≥98%),5-HMF(中国食品药品检定研究院,批号:111626-201711,纯度99.4%),甲醇、乙腈为色谱纯(美国天地有限公司),磷酸为分析纯(上海凌峰化学试剂有限公司),水为娃哈哈纯净水。

      黄酒(中国绍兴黄酒集团有限公司,生产批号:20170627,酒精度15%);地黄Rehmanniae Radix(产地河南)、砂仁Amomi Fructus(产地广东),均购自蚌埠医学院第二附属医院,经蚌埠医学院王迪生副教授鉴定,符合《中国药典》2015年版要求[5]

    • 色谱柱:赛默飞C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:0.1%磷酸(A)-乙腈(B),梯度洗脱,程序为:0~8 min,1%B;8~9 min,1%~4%B;9~25 min,4%B;25~35 min,4%~20%B;35~50 min,20%B;50~50.01 min,20%~1%B;50.01~55 min,1%B。柱温:30 ℃;检测波长:203 nm、332 nm,波长切换:0.00~29.00 min,波长203 nm,29.01~55.00 min,332 nm;进样量:1 μL。

    • 取生地黄,蒸制12 h,闷12 h后,上下翻动1次,如此反复蒸闷2次,70 ℃干燥至熟地黄饮片的含水量≤15.0%时取出,放凉即得[3]

    • 取生地黄,加入黄酒拌匀,每100 kg生地黄用黄酒40 kg[3],闷润至酒吸尽,连续炖制48 h后(炖制24 h时,上下翻动1次),70 ℃干燥至熟地黄饮片的含水量≤15.0%时取出,放凉即得。

    • 取生地黄,加黄酒适量拌匀一段时间后闷润至酒吸尽,以武火加热,用容器收集流出的熟地黄汁,蒸约48 h至地黄中央发虚为度,取出,晒1 d;再拌入熟地黄汁和黄酒,再蒸24 h,取出再晒1 d;如此反复,蒸晒8次。至第9次,将黄酒与砂仁粉一起拌入,蒸24 h,以蒸至内外漆黑,味甜酸无苦味为度,取出即得。每100 kg生地黄用黄酒50 kg、砂仁粉0.9 kg[4]

    • 分别取梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF对照品适量,精密称定,加入甲醇溶解制成质量浓度分别为2.1892、2.1658、2.0350、3.5574、2.2442、2.0168、2.0626 mg/mL的混合对照品储备液。

    • 取生地黄、清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄经粉碎(过4号筛)所得的粉末约2.0g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,加入甲醇50 mL,精密称重,30 ℃水温超声处理40 min,过滤,放冷,补重,精密量取滤液25 mL,水浴蒸干,残渣加10%乙腈溶解,转移至10 mL量瓶中并定容,备用。

    • 分别取混合对照品溶液和供试品溶液,按“1.3 HPLC色谱条件”进样分析,各色谱峰的拖尾因子均在0.95~1.05之间,与相邻色谱峰的分离度大于1.5,梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF的理论塔板数均大于6 800。

    • 通过比较空白溶液、对照品溶液和供试品溶液的色谱图考察专属性。结果表明,供试品溶液中其他成分对待测成分无干扰,分析方法专属性良好,色谱图见图 1~3

      图  1  混合对照品HPLC图

      图  2  生地黄样品HPLC图

      图  3  九蒸九晒熟地黄样品HPLC图

    • 取各对照品溶液适量,加入甲醇溶液逐步稀释,以信噪比3时对应待测物浓度为检测限,以信噪比10时对应待测物浓度为定量限进行测定,结果见表 1

      对照品 检出限/(μg/g) 定量限/(μg/g)
      梓醇 7.18 23.92
      异毛蕊花糖苷 2.60 8.66
      毛蕊花糖苷 3.35 11.15
      益母草苷 59.29 197.63
      地黄苷A 10.36 34.53
      地黄苷D 13.26 44.20
      5-HMF 6.75 22.50

      表 1  各对照品的检出限和定量限

    • 分别精密量取梓醇、异毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、5-HMF对照品储备液适量置5 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,制得浓度分别为271.46、12.99、40.70、711.48、224.42、806.74、309.38 μg/mL的混合对照品工作液。按高效液相色谱条件分别精密吸取混合对照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.5 μL,依法测定,记录色谱峰的峰面积,以各对照品浓度X (μg/mL)为横坐标,峰面积Y为纵坐标,绘制标准曲线,进行回归计算,结果见表 2

      成分 回归方程 R2 线性范围/μg
      梓醇 Y=9.157 4X-0.066 7 0.999 1 0.108 6~0.678 7
      益母草苷 Y=6.504 9X-0.045 6 0.999 2 0.142 3~1.565 3
      地黄苷A Y=9.254 6X-0.003 5 0.999 4 0.044 9~0.493 7
      地黄苷D Y=6.646 3-0.008 0.999 6 0.161 3~1.774 8
      毛蕊花糖苷 Y=17.233X+0.0335 0.999 4 0.008 1~0.101 8
      异毛蕊花糖苷 Y=12.985X+0.0114 0.999 6 0.002 6~0.039 0
      5-HMF Y=17.275X-0.2451 0.999 2 0.061 9~1.237 5

      表 2  各成分线性关系

    • 精密吸取对照品溶液,在色谱条件下进样6次,每次5 μL,测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.41、0.67、1.14、1.88、0.33、1.71、0.46,表明仪器精密度良好。

    • 精密吸取同一供试品溶液,在色谱条件下分别于0、1、3、5、12、24 h测定,测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.38、0.94、1.19、0.94、0.70、0.90、0.45,表明溶液在24 h内稳定性良好。

    • 取清蒸熟地黄,按1.6方法平行制备供试品溶液6份,在色谱条件下,测得毛梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF峰面积RSD分别为0.81、0.85、1.36、1.36、0.67、1.22、0.42,表明该方法重复性良好。

    • 精密称取清蒸熟地黄粉末9份,每份1 g,精密秤定,精密加入对照品适量。按“1.6”项下方法制备供试品溶液,在色谱条件下,测得梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF平均加样回收率RSD分别为1.51、1.14、1.14、0.84、1.44、1.23、1.28。

    • 取生地黄、清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄各约2 g,精密称定,按“供试品溶液的制备”项下操作,制备供试品溶液,按“高效液相色谱条件”进样5 μL,测定峰面积,采用外标法对梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF的含量进行测定,结果见表 3

      炮制方法 各成分含量/(mg/g)
      梓醇 益母草苷 地黄苷A 地黄苷D 毛蕊花糖苷F 异毛蕊花糖苷 5-HMF
      生地黄 6.82 2.14 1.09 2.24 1.00 8.68 0
      清蒸熟地黄 0 0 0.13 0.85 0.11 0.62 0.56
      酒炖熟地黄 0 0 0.22 1.02 0.17 0.95 0.45
      九蒸九晒熟地黄 0 0 0 0 0 0 2.29

      表 3  样品测定结果(n=3)

    • 本实验首次建立了同时测定熟地黄中梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、5-HMF含量的HPLC方法。测定了熟地黄3种不同炮制品,即清蒸熟地黄、酒炖熟地黄、九蒸九晒熟地黄中以梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D为主的环烯醚萜苷类成分,以毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷为主的苯丙素苷类成分,以及5-HMF的含量。实验预试中,经查阅文献,5-HMF的提取方法主要有水浴回流提取和超声提取两种方法[5]。考虑到回流提取的加热过程中,可能会使熟地黄中的多糖自身发生水解、脱水反应生成5-HMF,导致5-HMF含量偏高,实验数据不准确。故本实验采用超声提取方法,制备供试品溶液。

      本实验结果显示,生地黄中不含5-HMF。清蒸熟地黄和酒炖熟地黄中,环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷几乎全部降解;环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量较生地黄中含量降低;可以检测到5-HMF。九蒸九晒熟地黄中环烯醚萜单糖苷梓醇和益母草苷、环烯醚萜双糖苷地黄苷A、地黄苷D和苯丙素苷毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷几乎全部降解;可以检测到5-HMF。

      通过实验数据分析可知,由于梓醇和益母草苷都是环烯醚萜单糖苷,热稳定较差,地黄经过清蒸、酒炖和九蒸九晒加热过程后,其含量降低至几乎全部降解。地黄苷A和地黄苷D是环烯醚萜双糖苷,毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷属于苯丙素苷,均相对稳定,在清蒸熟地黄和酒炖熟地黄中均可以检测到,但较生地黄含量下降。可能因为毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为咖啡酸酯,在炮制过程中发生酯键的断裂,从而生成咖啡酸[6]。而九蒸九晒熟地黄蒸晒次数较多,上述成分几乎全部降解。地黄在清蒸、酒炖和九蒸九晒过程中发生了Maillard反应,生成了5-HMF。5-HMF在含糖中药的炮制过程中都有可能生成,与炮制时间和温度密切相关,现已成为中药炮制原理研究的活性成分,具有抗心肌缺血、抗氧化、降血糖、改变血液流变性和神经保护性作用[5]

      综上,通过测定熟地黄3种不同炮制品中7种化学成分的含量,可知不同炮制方法对熟地黄成分的影响较大,尤其是九蒸九晒熟地黄在反复蒸晒过程中苷类逐渐降解,其生成何种化合物,与九蒸九晒熟地黄增效袪腻药效变化是否有关,值得进一步深入研究。

参考文献 (6)

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