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瓜蒌滴丸的化学指纹特征及4种成分的定量分析

洪国君 邹纯才 鄢海燕 王莉丽 吕文雅

引用本文:
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瓜蒌滴丸的化学指纹特征及4种成分的定量分析

    作者简介: 洪国君(1994-),男,硕士研究生
    通讯作者: 鄢海燕, yhy0801@126.com
  • 基金项目:

    安徽省高校自然科学研究重大项目 KJ2016SD60

    国家级大学生创新创业训练计划项目 201710368046

  • 中图分类号: R284

Study on the chemical fingerprint features and quantitative analysis of 4 components of Trichosanthis Fructus dropping pills

    Corresponding author: YAN Hai-yan, yhy0801@126.com ;
  • CLC number: R284

  • 摘要: 目的研究瓜蒌滴丸的化学指纹特征及4种成分的定量分析方法。方法采用HPLC-PDAD法建立10批瓜蒌滴丸的化学指纹图谱,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算瓜蒌滴丸的相似度;采用标准曲线法对瓜蒌滴丸中尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷进行定量分析。结果10批瓜蒌滴丸的相似度为0.99(Mark峰匹配)和0.97(全谱峰匹配)。瓜蒌滴丸中尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷的含量分别为0.06%、0.03%、0.11%、0.17%,该方法的精密度、稳定性、重复性和加样回收率的RSD最高值分别为2.24%、3.55%、4.23%和4.44%,可满足分析要求。结论建立了瓜蒌滴丸的化学指纹特征及4种成分的定量分析方法,可用于瓜蒌滴丸的质量控制。
  • 图 1  瓜蒌滴丸(A)和对照品(B) HPLC色谱图

    图 2  10批瓜蒌滴丸的HPLC指纹图谱

    表 1  瓜蒌滴丸中4种成分的线性回归方程建立

    对照品 回归方程 r 线性范围/(μg/mL)
    尿嘧啶 Y=24 934.12X-250.95 1.000 0 4.16~66.60
    次黄嘌呤 Y=21 044.13X+104.21 1.000 0 1.95~31.25
    鸟苷 Y=17 676.15X-37 084.32 0.999 5 8.33~133.30
    腺苷 Y=21 741.68X-28 602.50 0.999 9 12.50~200.00
    下载: 导出CSV

    表 2  瓜蒌滴丸中4种成分的加样回收率试验结果

    对照品 样品中量/
    μg
    加入量/
    μg
    测得量/
    μg
    回收率/
    %
    平均
    回收率/%
    RSD/%
    15.24 34.71 102.7
    15.24 34.28 99.9
    15.24 33.36 93.8
    19.05 38.63 102.7
    尿嘧啶 19.05 19.05 37.60 97.3 100.3 3.17
    19.05 38.39 101.5
    22.86 42.86 104.1
    22.86 42.24 101.4
    22.86 41.78 99.4
    11.45 9.16 21.03
    9.16 20.38 97.5
    9.16 20.87 102.9
    次黄嘌呤 11.45 11.45 22.91 100.1
    11.45 22.77 98.9 98.5 4.44
    11.45 21.97 91.9
    13.74 24.01 91.4
    13.74 24.99 98.5
    13.74 25.24 100.4
    28.58 22.86 52.89
    22.86 53.77 110.1
    22.86 51.40 99.8
    28.58 58.87 105.9
    鸟苷 28.58 28.58 57.51 101.2 104.4 4.15
    28.58 56.54 97.8
    34.30 66.10 109.3
    34.30 64.73 105.3
    34.30 64.23 103.9
    45.80 36.64 83.97
    36.64 84.70 106.1
    36.64 81.73 98.1
    45.80 93.55 104.2
    腺苷 45.80 45.80 91.33 99.4 101.2 3.32
    45.80 92.59 102.1
    54.96 99.55 97.8
    54.96 99.00 96.8
    54.96 102.32 102.8
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-07-02
  • 录用日期:  2019-03-04
  • 刊出日期:  2020-05-15

瓜蒌滴丸的化学指纹特征及4种成分的定量分析

    通讯作者: 鄢海燕, yhy0801@126.com
    作者简介: 洪国君(1994-),男,硕士研究生
  • 皖南医学院 药学院, 安徽 芜湖 241002
基金项目:  安徽省高校自然科学研究重大项目 KJ2016SD60国家级大学生创新创业训练计划项目 201710368046

摘要: 目的研究瓜蒌滴丸的化学指纹特征及4种成分的定量分析方法。方法采用HPLC-PDAD法建立10批瓜蒌滴丸的化学指纹图谱,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算瓜蒌滴丸的相似度;采用标准曲线法对瓜蒌滴丸中尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷进行定量分析。结果10批瓜蒌滴丸的相似度为0.99(Mark峰匹配)和0.97(全谱峰匹配)。瓜蒌滴丸中尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷的含量分别为0.06%、0.03%、0.11%、0.17%,该方法的精密度、稳定性、重复性和加样回收率的RSD最高值分别为2.24%、3.55%、4.23%和4.44%,可满足分析要求。结论建立了瓜蒌滴丸的化学指纹特征及4种成分的定量分析方法,可用于瓜蒌滴丸的质量控制。

English Abstract

  • 瓜蒌用于胸癖症的治疗始见于汉代名医张仲景所著的《金匮要略》[1]。瓜蒌滴丸是在瓜蒌片(国药准字Z31020173)剂型的基础上[2],经提取溶剂和瓜蒌皮、子配比优化等,制备瓜蒌提取物[3],进一步添加聚乙二醇辅料制备而成,用于冠心病、心绞痛等预防与治疗。本研究采用HPLC-PDAD法建立10批瓜蒌滴丸[4]的化学指纹图谱,利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(国家药典委员会,2012.130723版本)计算瓜蒌滴丸的相似度,采用标准曲线法测定瓜蒌滴丸中尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷的含量[5],以期为瓜蒌滴丸的质量控制提供理论依据。现作报道。

    • 岛津LC-20A型高效液相色谱仪(含GDU 20A真空在线脱气机,LC-20AT四元泵,CTO-10AS柱温箱,SPD-M20 A检测器),AUW-220D型电子天平(日本岛津公司),UV2550型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司),DZF-6030A型真空干燥箱(上海恒一科技有限公司)。

    • 瓜蒌滴丸(课题组自制,规格25 mg/丸,每丸相当于原瓜蒌生药0.167 g,批号20170701~20170710);尿嘧啶(国药集团化学试剂有限公司,纯度≥98%,批号20150417),次黄嘌呤(国药集团化学试剂有限公司,纯度≥98%,批号20140928);鸟苷(国药集团化学试剂有限公司,纯度≥98%,批号20140522),腺苷(国药集团化学试剂有限公司,纯度≥98%,批号20150528),甲醇为色谱纯,水为娃哈哈纯净水,其他试剂均为分析纯。

    • (1) 对照品溶液制备:取尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷对照品,于硅胶干燥器中干燥12 h。分别取适量,精密称定,加15%甲醇制得质量浓度分别为66.6、31.25、133.3、200 μg/mL的混合对照品溶液。(2)瓜蒌滴丸供试品溶液制备:取瓜蒌滴丸适量,精密称定,置于容量瓶中,加15%甲醇定容至刻度,制得75 mg/mL供试品溶液,0.45 μm微孔滤膜过滤后,备用。

    • YMC-Pack ODS-A色谱柱(250 mm×4.6 mm,I.D.S-5 μm),以甲醇-水为流动相梯度洗脱:0~30 min,甲醇0%;30~50 min,甲醇0%~2%;50~80 min,甲醇2%~6%;80~200 min,甲醇6%~15%;200~250 min,甲醇15%~15%。总流速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃;DAD检测器,检测波长为254 nm。

    • 瓜蒌滴丸及对照品色谱图见图 1。根据《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》,设置1号样品色谱图为参照图谱,经多点校正,Mark峰及全谱峰匹配,生成对照图谱,得到共有峰的数目为29个。其中2、5、13、19号峰分别为尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷。计算10批瓜蒌滴丸的指纹图谱与共有模式的相似度。

      图  1  瓜蒌滴丸(A)和对照品(B) HPLC色谱图

    • 精密吸取混合对照品溶液,稀释1、2、4、8倍,按“1.3.2 ”项下色谱条件进样。以对照品溶液质量浓度X(μg/mL)为横坐标,峰面积Y为纵坐标进行线性回归,结果见表 1

      对照品 回归方程 r 线性范围/(μg/mL)
      尿嘧啶 Y=24 934.12X-250.95 1.000 0 4.16~66.60
      次黄嘌呤 Y=21 044.13X+104.21 1.000 0 1.95~31.25
      鸟苷 Y=17 676.15X-37 084.32 0.999 5 8.33~133.30
      腺苷 Y=21 741.68X-28 602.50 0.999 9 12.50~200.00

      表 1  瓜蒌滴丸中4种成分的线性回归方程建立

    • 取瓜蒌滴丸(批号20170701)适量,按“1.3.1 ”项下方法制备供试品溶液,按“1.3.2”项下色谱条件,连续进样5次。尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷峰面积的RSD分别为0.55%、2.24%、2.32%、1.49%,表明仪器精密度良好[6]

    • 取瓜蒌滴丸(批号为20170701)适量,按“1.3.1 ”项下方法制备供试品溶液,按“1.3.2”项下色谱条件,分别在0、6、12、18、24 h进行测定。尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷峰面积的RSD分别为1.22%、0.89%、1.18%、4.23%,表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

    • 取同批瓜蒌滴丸6份,按“1.3.1 ”项下方法制备供试品溶液,按“1.3.2”项下色谱条件测定。尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷平均含量的RSD分别为3.55%、1.56%、0.95%、1.85%,表明方法重复性良好。

    • 取已知尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷含量的瓜蒌滴丸(批号为20170701)供试品溶液9份(每份10 mL),分为3组,每组3份,每份1 mL,每组分别按尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷已知含量的80%、100%、120%精密加入对照品。按“1.3.2 ”项下色谱条件进样测定。尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷平均含量的RSD分别为3.17%、4.44%、4.15%、3.32%,满足分析要求(见表 2)。

      对照品 样品中量/
      μg
      加入量/
      μg
      测得量/
      μg
      回收率/
      %
      平均
      回收率/%
      RSD/%
      15.24 34.71 102.7
      15.24 34.28 99.9
      15.24 33.36 93.8
      19.05 38.63 102.7
      尿嘧啶 19.05 19.05 37.60 97.3 100.3 3.17
      19.05 38.39 101.5
      22.86 42.86 104.1
      22.86 42.24 101.4
      22.86 41.78 99.4
      11.45 9.16 21.03
      9.16 20.38 97.5
      9.16 20.87 102.9
      次黄嘌呤 11.45 11.45 22.91 100.1
      11.45 22.77 98.9 98.5 4.44
      11.45 21.97 91.9
      13.74 24.01 91.4
      13.74 24.99 98.5
      13.74 25.24 100.4
      28.58 22.86 52.89
      22.86 53.77 110.1
      22.86 51.40 99.8
      28.58 58.87 105.9
      鸟苷 28.58 28.58 57.51 101.2 104.4 4.15
      28.58 56.54 97.8
      34.30 66.10 109.3
      34.30 64.73 105.3
      34.30 64.23 103.9
      45.80 36.64 83.97
      36.64 84.70 106.1
      36.64 81.73 98.1
      45.80 93.55 104.2
      腺苷 45.80 45.80 91.33 99.4 101.2 3.32
      45.80 92.59 102.1
      54.96 99.55 97.8
      54.96 99.00 96.8
      54.96 102.32 102.8

      表 2  瓜蒌滴丸中4种成分的加样回收率试验结果

    • 计算10批瓜蒌滴丸的指纹图谱与共有模式的相似度,结果显示,10批瓜蒌滴丸的相似度为0.99±0.01(Mark峰匹配)和0.97±0.02(全谱峰匹配)(见图 2)。瓜蒌滴丸中4种成分的定量分析结果显示,尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷的含量分别为(0.25±2.66)%、(0.15±4.98)%、(0.38±2.51)%、(0.61±1.86)%。

      图  2  10批瓜蒌滴丸的HPLC指纹图谱

    • 瓜蒌滴丸为瓜蒌的水提醇沉浓缩物加聚乙二醇4000、6000制备的滴丸制剂。从瓜蒌分离得到的皂苷类物质几乎全为新化合物,具有抑制炎症、抗肿瘤等活性[7], 瓜蒌中含有的腺苷也被证实具有较强的抗血小板聚集活性[8],且有紫外吸收[9-10],为此本研究采用HPLC-PDAD技术对瓜蒌滴丸的化学指纹特征及4种核苷类成分进行定量分析。

      实验过程中,考察了YMS-C18、ZorbaxC18、XB-CN等色谱柱,并对流动相甲醇、乙腈与水、0.1%磷酸水、0.1%醋酸水、0.1%三乙胺水溶液的联合应用进行了考察,结果发现YMS-C18色谱柱为固定相,甲醇-水作流动相分离效果较好。从实验结果可知,不同批次的瓜蒌滴丸化学指纹特征相似度较高,Mark峰和全谱峰匹配的相似度分别为0.99和0.97,故设定瓜蒌滴丸的化学指纹特征相似度阈值为0.95。本实验亦对瓜蒌滴丸中的尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、腺苷等成分进行了定量分析方法建立,结果显示,该方法精密度、重复性、稳定性及加样回收率试验的RSD最高值分别为2.24%、3.55%、4.23%和4.44%,可满足定量分析的要求。

      综上,瓜蒌滴丸的化学指纹特征及4种成分的定量分析,可用于瓜蒌滴丸的质量控制。结合瓜蒌滴丸的化学指纹特征及4种成分的定量分析及后期的药效学研究,可为深入进行瓜蒌滴丸的谱效关系研究奠定基础。

参考文献 (10)

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