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淫羊藿通过miR-19a-3p对高糖高脂诱导的胰岛β细胞损伤的影响及机制研究

陈朝琴 薛治乾 李文霞

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淫羊藿通过miR-19a-3p对高糖高脂诱导的胰岛β细胞损伤的影响及机制研究

    作者简介: 陈朝琴(1984-), 女, 主治医师
    通讯作者: 李文霞, z72qg0@163.com
  • 基金项目:

    海南省医药卫生科研项目 1521320241A2002

  • 中图分类号: R587.1

Effects of Epimedium herb through miR-19a-3p on islet β cells damage induced by high glucose and lipid and its mechanism

    Corresponding author: LI Wen-xia, z72qg0@163.com
  • CLC number: R587.1

  • 摘要: 目的探讨淫羊藿(Epimedium herb,EH)对高糖高脂诱导的胰岛β细胞损伤的影响及其分子机制。方法以胰岛β细胞RINm5F为研究对象,建立高糖高脂损伤模型,分为对照组(5 mmol/L葡萄糖)、高糖高脂组[25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L棕榈树酸(PA)]、低剂量EH组(25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L PA+10 μmol/L EH)和高剂量EH组(25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L PA+100 μmol/L EH),EH处理48 h后,分别采用噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术检测细胞增殖与凋亡,蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞中细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平,实时定量PCR(qPCR)检测RINm5F细胞中miR-19a-3p表达。在高糖高脂损伤的RINm5F细胞转染anti-miR-19a-3p或在高剂量EH组细胞转染miR-19a-3p,观察细胞的增殖和凋亡情况。结果与对照组比较,高糖高脂组第48 h、72 h细胞增殖活性和CyclinD1、Bcl-2蛋白水平明显下降(P < 0.05),细胞凋亡率、miR-19a-3p表达量、P21和Bax蛋白表达量提高(P < 0.05)。不同剂量的EH干预可以明显提高高糖高脂环境下的细胞增殖能力和CyclinD1、Bcl-2蛋白水平(P < 0.01),减少细胞凋亡率和P21、Bax蛋白表达量(P < 0.01),与抑制miR-19a-3p表达作用结果差异无统计学意义(P>0.05)。此外,过表达miR-19a-3p能逆转EH对高糖高脂刺激的RINm5F细胞增殖的促进作用和对细胞凋亡的抑制作用(P < 0.01)。结论EH通过miR-19a-3p保护高糖高脂诱导的胰岛β细胞损伤,提高细胞增殖活性,抑制细胞凋亡。
  • 图 1  EH对HGL刺激的RINm5F细胞增殖蛋白表达的影响

    图 2  EH对HGL刺激的RINm5F细胞凋亡的影响

    图 3  EH对HGL刺激的RINm5F凋亡蛋白表达的影响

    图 4  抑制miR-19a-3p表达对HGL刺激的RINm5F细胞增殖蛋白表达的影响

    图 5  抑制miR-19a-3p表达对HGL刺激的RINm5F细胞凋亡蛋白表达的影响

    图 6  过表达miR-19a-3p能逆转EH对HGL刺激的RINm5F细胞增殖、调亡蛋白的作用

    表 1  EH对HGL刺激的RINm5F细胞活性及CyclinD1、P21蛋白表达的影响(x±s)

    分组 OD值(24 h) OD值(48 h) OD值(72 h) CyclinD1 P21
    Con组 0.36±0.06 0.93±0.07 1.83±0.08 0.79±0.03 0.19±0.02
    HGL组 0.34±0.04 0.41±0.06* 0.58±0.06* 0.24±0.02* 0.67±0.02*
    低剂量EH组 0.35±0.03 0.53±0.05 0.78±0.06 0.37±0.02 0.50±0.01
    高剂量EH组 0.36±0.02 0.69±0.05 1.26±0.07 0.52±0.01 0.36±0.02
    F 0.169 44.919 201.227 372.000 384.615
    P >0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
    MS组内 0.002 0.003 0.005 0.000 0.000
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    表 2  EH对HGL刺激的RINm5F细胞凋亡的影响(x±s)

    分组 凋亡率/% Bax Bcl-2
    Con组 4.32±0.37 0.14±0.01 0.89±0.01
    HGL组 17.25±1.01* 0.76±0.02* 0.29±0.01*
    低剂量EH组 14.31±1.00 0.62±0.01 0.43±0.01
    高剂量EH组 10.03±0.58 0.45±0.01 0.57±0.01
    F 151.873 1 222.143 1 979.000
    P < 0.01 0.01 0.01
    MS组内 0.623 0.000 0.000
    与Con组比较*P < 0.05;与HGL组比较△P < 0.05
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    表 3  EH对HGL刺激的RINm5F细胞中miR-19a-3p表达的影响(x±s)

    分组 miR-19a-3p
    Con组 0.18±0.01
    HGL组 0.75±0.05*
    低剂量EH组 0.60±0.04
    高剂量EH组 0.43±0.03
    F 140.706
    P < 0.01
    MS组内 0.001
    与Con组比较*P < 0.05;与HGL组比较△P < 0.05
    下载: 导出CSV

    表 4  抑制miR-19a-3p表达对HGL刺激的RINm5F细胞增殖的影响(x±s)

    分组 miR-19a-3p OD值(24 h) OD值(48 h) OD值(72 h) CyclinD1 P21
    HGL+anti-miR-NC 1.00±0.06 0.33±0.03 0.42±0.04 0.56±0.04 0.23±0.02 0.66±0.02
    HGL+anti-miR-19a-3p 0.31±0.03 0.34±0.03 0.55±0.05 0.87±0.05 0.43±0.04 0.41±0.03
    t 17.82 0.82 3.52 8.39 7.75 12.01
    P < 0.01 >0.05 < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01
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    表 5  抑制miR-19a-3p表达对HGL刺激的RINm5F细胞凋亡的影响(x±s)

    分组 凋亡率/% Bax Bcl-2
    HGL+anti-miR-NC 17.28±1.32 0.75±0.02 0.27±0.01
    HGL+anti-miR-19a-3p 12.92±0.92 0.54±0.02 0.47±0.02
    t 4.69 12.86 15.49
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01
    与HGL+anti-miR-NC组比较※P < 0.05
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    表 6  过表达miR-19a-3p能逆转EH对HGL刺激的RINm5F细胞增殖、凋亡的作用(x±s)

    分组 miR-19a-3p OD值(24 h) OD值(48 h) OD值(72 h) 凋亡率/%
    HGL+EH(100μmol/L)+miR-NC 1.02±0.06 0.36±0.02 0.72±0.05 1.30±0.05 9.67±0.52
    HGL+EH(100μmol/L)+miR-19a-3p 2.55±0.10 0.35±0.02 0.53±0.04 0.85±0.06 13.66±0.68
    t 22.72 0.61 5.14 9.98 8.07
    P < 0.01 >0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01
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    表 7  相关蛋白的表达(x±s)

    分组 CyclinD1 P21 Bax Bcl-2
    HGL+EH(100 μmol/L)+miR-NC 0.50±0.02 0.36±0.01 0.45±0.02 0.58±0.01
    HGL+EH(100 μmol/L)+miR-19a-3p 0.38±0.01 0.51±0.01 0.63±0.01 0.41±0.01
    t 9.30 18.37 13.94 20.82
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-11-13
  • 录用日期:  2020-05-22
  • 刊出日期:  2020-06-15

淫羊藿通过miR-19a-3p对高糖高脂诱导的胰岛β细胞损伤的影响及机制研究

    通讯作者: 李文霞, z72qg0@163.com
    作者简介: 陈朝琴(1984-), 女, 主治医师
  • 1. 海南省儋州市人民医院 内分泌科, 571700
  • 2. 海南省儋州市人民医院 病理科, 571700
基金项目:  海南省医药卫生科研项目 1521320241A2002

摘要: 目的探讨淫羊藿(Epimedium herb,EH)对高糖高脂诱导的胰岛β细胞损伤的影响及其分子机制。方法以胰岛β细胞RINm5F为研究对象,建立高糖高脂损伤模型,分为对照组(5 mmol/L葡萄糖)、高糖高脂组[25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L棕榈树酸(PA)]、低剂量EH组(25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L PA+10 μmol/L EH)和高剂量EH组(25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L PA+100 μmol/L EH),EH处理48 h后,分别采用噻唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术检测细胞增殖与凋亡,蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞中细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平,实时定量PCR(qPCR)检测RINm5F细胞中miR-19a-3p表达。在高糖高脂损伤的RINm5F细胞转染anti-miR-19a-3p或在高剂量EH组细胞转染miR-19a-3p,观察细胞的增殖和凋亡情况。结果与对照组比较,高糖高脂组第48 h、72 h细胞增殖活性和CyclinD1、Bcl-2蛋白水平明显下降(P < 0.05),细胞凋亡率、miR-19a-3p表达量、P21和Bax蛋白表达量提高(P < 0.05)。不同剂量的EH干预可以明显提高高糖高脂环境下的细胞增殖能力和CyclinD1、Bcl-2蛋白水平(P < 0.01),减少细胞凋亡率和P21、Bax蛋白表达量(P < 0.01),与抑制miR-19a-3p表达作用结果差异无统计学意义(P>0.05)。此外,过表达miR-19a-3p能逆转EH对高糖高脂刺激的RINm5F细胞增殖的促进作用和对细胞凋亡的抑制作用(P < 0.01)。结论EH通过miR-19a-3p保护高糖高脂诱导的胰岛β细胞损伤,提高细胞增殖活性,抑制细胞凋亡。

English Abstract

  • 糖尿病是一种常见的内分泌疾病,影响着全球4亿多人的健康[1]。随着发病率的逐年攀升,糖尿病被视为继肿瘤、心血管疾病之后的位于第三位威胁人类健康的慢性疾病[2],严重影响病人的生活质量。目前,糖尿病的发病机制尚未完全阐明,但越来越多的证据表明,胰岛β细胞功能受损与糖尿病的发生发展密切相关[3-4]。淫羊藿是小檗科植物淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿、箭叶淫羊藿或朝鲜淫羊藿的干燥地上部分[5],具益精气、补肾阳、强筋骨、祛风湿之功,用于肾阳虚衰、阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛[6]。资料显示,以EH、人参、黄精等多种药物配制而成的津力达颗粒对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞具有保护作用[7],黔产粗毛EH、黔岭EH可以改善四氧嘧啶诱发的2型糖尿病模型小鼠胰腺组织损伤[8],但EH对高糖高脂诱导胰岛β细胞影响方面的研究尚不多见。本研究拟从细胞学水平探索EH对高糖高脂诱导的胰岛β细胞RINm5F损伤的作用及其可能的分子机制,为EH在糖尿病的临床治疗提供新思路,同时也为糖尿病的诊治提供潜在的生物标志物。

    • 胰岛细胞系RINm5F购自美国ATCC细胞库,EH购自上海源叶生物公司,RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司,棕榈树酸(PA)、葡萄糖、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司,RIPA裂解液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore公司,miRNA提取试剂盒购自上海Qiagen公司,Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液(TBST)购自上海生工生物工程公司,胰酶、凋亡试剂盒购自上海碧云天生物有限公司,逆转录试剂盒、实时定量PCR(aPCR)试剂盒购自美国应用生物系统公司,Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司,辣根过氧化物酶标记二抗购自武汉博士德生物有限公司。细胞培养箱购自美国Thermo公司,7500实时定量PCR仪购自美国赛默飞世尔公司。台式离心机、酶标仪购自德国Eppendorf公司,流式细胞仪购自美国Beckman公司。

    • RINm5F细胞复苏后,置含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中,于37 ℃、5% CO2培养箱培养。每24 h更换培养液一次,使用0.25%胰酶进行消化传代。细胞同步化后随机分为对照组(Con组,5 mmol/L葡萄糖)、高糖高脂组(HGL组,25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L PA)、低剂量EH组(低剂量EH组,25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L PA+10 μmol/L EH)和高剂量EH组(高剂量EH组,25 mmol/L葡萄糖+0.25 mmol/L PA+100 μmol/L EH)。EH干预48 h后进行后续实验。

    • 按照miRNA提取试剂盒说明书的指示,提取RINm5F细胞中总miRNA,使用逆转录试剂盒合成cDNA。以制成的cDNA为模板,U6为参照,采用实时定量PCR试剂盒进行反应。反应条件为95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 8 min,循环40次,收集Ct值,以2-ΔΔCt法计算miR-19a-3p的相对表达量。

    • 收集HGL组和不同剂量EH组RINm5F细胞,以1×105个/毫升的密度接种于6孔板,待细胞融合度约为80%时进行转染。根据不同的实验目的,利用Lipofectamine 2000型试剂将miR-19a-3p和anti-miR-19a-3p质粒及相应的阴性对照转染入RINm5F细胞。转染48 h后,收集细胞用于后续实验。

    • 采用Western blotting分析各种蛋白的表达情况。收集Con组、HGL组和不同浓度EH组(10、100 μmol/L)RINm5F细胞,加入RIPA裂解液获得总蛋白,用10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(DS-PAGE)分离蛋白,之后将蛋白转移到PVDF膜上,并于5%脱脂奶粉封闭1 h。将膜与相应的一抗4 ℃孵育过夜,加入TBST充分洗涤,与辣根过氧化物标记二抗室温孵育1 h,加入TBST充分洗涤。利用化学发光液中显色、显影,以GAPDH为对照,计算蛋白相对表达量。

    • 收集各组RINm5F细胞,使用胰酶消化,调整细胞密度为1×104个/孔,接种于96孔细胞板,每组处理设置3个复孔,分别培养24、48、72 h后加入100 μL的MTT溶液(5 mg/mL),37 ℃孵育4 h,弃上清液,每孔加入200 μL DMSO,37 ℃摇床振荡10 min,在酶标仪490 nm波长处测定细胞吸光值(OD490nm值)。以时间为横坐标,各组细胞OD490nm值为纵坐标,绘制生存曲线。其中,OD490nm值越高,细胞增殖活性越强。

    • 各处理RINm5F细胞进入对数生长期后,使用胰酶消化,调整细胞密度为1×106个/毫升,加入500 μL Annexin V缓冲液重悬细胞,随后将细胞转移至EP管,在室温黑暗条件下用5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI孵育30 min,上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

    • 采用t检验、单因素方差分析和q检验。

    • MTT对HGL刺激的RINm5F细胞增殖能力检测结果显示,与对照组相比,HGL组细胞增殖活性有所下降,24 h时差异无统计学意义(P>0.05),48 h和72 h差异有统计学意义(P < 0.05);与HGL组相比,不同浓度EH处理后,RINm5F细胞增殖活性逐渐上升,24 h时差异无统计学意义(P>0.05),48 h和72 h差异均有统计学意义(P < 0.05)(见表 1)。

      分组 OD值(24 h) OD值(48 h) OD值(72 h) CyclinD1 P21
      Con组 0.36±0.06 0.93±0.07 1.83±0.08 0.79±0.03 0.19±0.02
      HGL组 0.34±0.04 0.41±0.06* 0.58±0.06* 0.24±0.02* 0.67±0.02*
      低剂量EH组 0.35±0.03 0.53±0.05 0.78±0.06 0.37±0.02 0.50±0.01
      高剂量EH组 0.36±0.02 0.69±0.05 1.26±0.07 0.52±0.01 0.36±0.02
      F 0.169 44.919 201.227 372.000 384.615
      P >0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
      MS组内 0.002 0.003 0.005 0.000 0.000

      表 1  EH对HGL刺激的RINm5F细胞活性及CyclinD1、P21蛋白表达的影响(x±s)

      Western blotting检测增殖相关蛋白表达的结果显示,与对照组相比,HGL组细胞中CyclinD1表达量骤减(P < 0.05),P21表达量增加显著(P < 0.05);与HGL组相比,不同剂量的EH组干预后,细胞CyclinD1水平明显提高(P < 0.05),P21水平明显降低(P < 0.05)(见图 1表 1)。

      图  1  EH对HGL刺激的RINm5F细胞增殖蛋白表达的影响

    • 对HGL诱导RINm5F细胞凋亡和相关蛋白表达的检测结果显示,与Con组比较,HGL作用于RINm5F细胞后,细胞凋亡率大幅增加(P < 0.05)(见图 2表 2),Bax表达量明显提高(P < 0.05),Bcl-2表达量明显减少(P < 0.05)(见图 3表 2)。与HGL组比较,不同剂量的EH处理RINm5F细胞后,细胞凋亡率明显减少(P < 0.05)(见图 2表 2),Bax水平有所降低(P < 0.05),Bcl-2表达量增加(P < 0.05)(见图 3表 2)。

      图  2  EH对HGL刺激的RINm5F细胞凋亡的影响

      图  3  EH对HGL刺激的RINm5F凋亡蛋白表达的影响

      分组 凋亡率/% Bax Bcl-2
      Con组 4.32±0.37 0.14±0.01 0.89±0.01
      HGL组 17.25±1.01* 0.76±0.02* 0.29±0.01*
      低剂量EH组 14.31±1.00 0.62±0.01 0.43±0.01
      高剂量EH组 10.03±0.58 0.45±0.01 0.57±0.01
      F 151.873 1 222.143 1 979.000
      P < 0.01 0.01 0.01
      MS组内 0.623 0.000 0.000
      与Con组比较*P < 0.05;与HGL组比较△P < 0.05

      表 2  EH对HGL刺激的RINm5F细胞凋亡的影响(x±s)

    • HGL诱导RINm5F细胞损伤后,细胞中miR-19a-3p表达量明显高于Con组(P < 0.05);加入不同剂量的EH,miR-19a-3p表达水平低于HGL组(P < 0.05),高剂量EH组miR-19a-3p表达量差异最显著(见表 3),故选择高剂量EH组进行后续研究。

      分组 miR-19a-3p
      Con组 0.18±0.01
      HGL组 0.75±0.05*
      低剂量EH组 0.60±0.04
      高剂量EH组 0.43±0.03
      F 140.706
      P < 0.01
      MS组内 0.001
      与Con组比较*P < 0.05;与HGL组比较△P < 0.05

      表 3  EH对HGL刺激的RINm5F细胞中miR-19a-3p表达的影响(x±s)

    • 在HGL损伤的RINm5F细胞中转染anti-miR-19a-3p,miR-19a-3p表达明显下调(P < 0.01),说明anti-miR-19a-3p载体成功转染入RINm5F细胞。观察抑制miR-19a-3p表达对细胞增殖的影响显示,抑制miR-19a-3p表达组24 h时的细胞增殖活性无明显变化(P>0.05),48 h和72 h时,细胞增殖活性显著高于HGL+anti-miR-NC组(P < 0.05),CyclinD1蛋白水平明显高于HGL+anti-miR-NC组(P < 0.01),P21蛋白表达量则显著减少(P < 0.01)(见表 4图 4)。

      分组 miR-19a-3p OD值(24 h) OD值(48 h) OD值(72 h) CyclinD1 P21
      HGL+anti-miR-NC 1.00±0.06 0.33±0.03 0.42±0.04 0.56±0.04 0.23±0.02 0.66±0.02
      HGL+anti-miR-19a-3p 0.31±0.03 0.34±0.03 0.55±0.05 0.87±0.05 0.43±0.04 0.41±0.03
      t 17.82 0.82 3.52 8.39 7.75 12.01
      P < 0.01 >0.05 < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01

      表 4  抑制miR-19a-3p表达对HGL刺激的RINm5F细胞增殖的影响(x±s)

      图  4  抑制miR-19a-3p表达对HGL刺激的RINm5F细胞增殖蛋白表达的影响

    • 抑制miR-19a-3p表达较HGL+anti-miR-NC组降低HGL所致的RINm5F细胞凋亡率(P < 0.01)和Bax蛋白水平(P < 0.01), 提升Bcl-2蛋白水平(P < 0.01)(见表 5图 5)。

      分组 凋亡率/% Bax Bcl-2
      HGL+anti-miR-NC 17.28±1.32 0.75±0.02 0.27±0.01
      HGL+anti-miR-19a-3p 12.92±0.92 0.54±0.02 0.47±0.02
      t 4.69 12.86 15.49
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01
      与HGL+anti-miR-NC组比较※P < 0.05

      表 5  抑制miR-19a-3p表达对HGL刺激的RINm5F细胞凋亡的影响(x±s)

      图  5  抑制miR-19a-3p表达对HGL刺激的RINm5F细胞凋亡蛋白表达的影响

    • 在高剂量EH组RINm5F细胞中转染miR-19a-3p,发现miR-19a-3p表达量高于对照HGL+EH(100 μmol/L)+miR-NC组(P < 0.01)。与HGL+EH(100 μmol/L)+miR-NC组相比,过表达miR-19a-3p组48 h和72 h时的细胞增殖能力下降(P < 0.01),细胞凋亡率增加(P < 0.01),同时,CyclinD1和Bcl-2蛋白表达量减少(P < 0.01),P21和Bax蛋白水平提高(P < 0.01)(见表 6~7图 6)。

      分组 miR-19a-3p OD值(24 h) OD值(48 h) OD值(72 h) 凋亡率/%
      HGL+EH(100μmol/L)+miR-NC 1.02±0.06 0.36±0.02 0.72±0.05 1.30±0.05 9.67±0.52
      HGL+EH(100μmol/L)+miR-19a-3p 2.55±0.10 0.35±0.02 0.53±0.04 0.85±0.06 13.66±0.68
      t 22.72 0.61 5.14 9.98 8.07
      P < 0.01 >0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01

      表 6  过表达miR-19a-3p能逆转EH对HGL刺激的RINm5F细胞增殖、凋亡的作用(x±s)

      分组 CyclinD1 P21 Bax Bcl-2
      HGL+EH(100 μmol/L)+miR-NC 0.50±0.02 0.36±0.01 0.45±0.02 0.58±0.01
      HGL+EH(100 μmol/L)+miR-19a-3p 0.38±0.01 0.51±0.01 0.63±0.01 0.41±0.01
      t 9.30 18.37 13.94 20.82
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01

      表 7  相关蛋白的表达(x±s)

      图  6  过表达miR-19a-3p能逆转EH对HGL刺激的RINm5F细胞增殖、调亡蛋白的作用

    • EH始载于《神农本草经》,作为补益药,距今已有2 000多年的药用历史[9]。EH是我国传统中药,主要活性成分包括EH苷、EH次苷、EH总黄酮、EH多糖以及一些微量元素等[10],在心血管、生殖、免疫、骨骼和神经系统等多种疾病的治疗中拥有广泛的应用价值[11]。此外,EH还可降血糖,用于糖尿病及其并发症的治疗[12-14]。糖尿病是由遗传和环境因素综合作用所致,血糖、血脂异常升高是糖尿病重要的临床特征[15]。胰岛的β细胞分泌胰岛素,在整个代谢中发挥着核心作用,而胰岛素是人体唯一能降低血糖的激素,当β细胞分泌胰岛素的能力与机体对胰岛素的需求不匹配,会引发糖尿病,最初,面对胰岛素的抵抗,β细胞会增加胰岛素数量,但随着β细胞功能的下降,最终导致高血糖[16]。β细胞异质性已成为胰岛功能的重要贡献者,对糖尿病产生潜在影响[17]。近年来,有学者[18]利用高糖高脂诱导胰岛β细胞损伤模型,研究糖尿病的相关机制。本实验中,利用胰岛β细胞RINm5F进行研究,以葡萄糖和棕榈树酸构建高糖高脂损伤模型,结果发现高糖高脂刺激的RINm5F细胞增殖活性和Bcl-2表达水平显著低于对照,而细胞凋亡率和Bax表达高于对照,这与张萌等[19]的研究结果一致。另外,高糖高脂增加了细胞中P21表达而降低CyclinD1表达量。不同剂量的EH处理后,细胞增殖能力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表达明显高于模型组,细胞凋亡率、P21和Bax蛋白水平则显著低于模型组,说明EH可以减轻高糖高脂对RINm5F细胞的损伤,抑制细胞凋亡。

      微小RNAs(MicroRNAs, miRNAs/miR)是一种内源性短链(长度为21~24个核苷酸)非编码RNA,参与细胞分化、增殖和凋亡等过程,影响许多疾病的发生发展,包括糖尿病及其并发症[20-22]。研究[23]表明,miRNA-19a在胰腺癌合并糖尿病病人中表达上调,可作为有效的血清标志物[23],miR-19a在冠心病合并糖尿病病人循环血中明显高于健康人员[24],利拉鲁肽对新诊断2型糖尿病胰岛β细胞功能的改善作用可能与血清中miR-19a表达下调有关[25]。本研究中,miR-19a-3p在高糖高脂损伤和不同剂量EH干预的细胞中表达量异常。在HGL损伤的RINm5F细胞转染anti-miR-19a-3p,发现抑制miR-19a-3p表达较相应对照显著提高HGL诱导的RINm5F细胞增殖活性、CyclinD1和Bcl-2蛋白表达,降低细胞凋亡、P21和Bax蛋白水平,与EH对高糖高脂环境中RINm5F细胞的作用结果相似。

      为了进一步观察EH是否通过miR-19a-3p来影响高糖高脂损伤的RINm5F细胞,将miR-19a-3p转染至高剂量EH组RINm5F细胞,发现过表达miR-19a-3p可以逆转EH对高糖高脂刺激下RINm5F细胞增殖、CyclinD1和Bcl-2蛋白表达的促进作用,以及逆转EH对高糖高脂刺激下RINm5F细胞凋亡、P21和Bax蛋白表达的抑制作用。由此可见,EH保护高糖高脂刺激的胰岛β细胞损伤与miR-19a-3p表达有关。

      综上所述,高糖高脂会导致胰岛β细胞损伤,影响细胞增殖和凋亡,而EH能够减轻高糖高脂刺激的胰岛β细胞损伤,改善细胞活性,促进细胞增殖能力,抑制细胞凋亡,其作用机制与调节miR-19a-3p表达有关。这将为EH和miR-19a-3p在糖尿病中的运用提供理论参考。

参考文献 (25)

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