• 中国科技论文统计源期刊
  • 中国科技核心期刊
  • 中国高校优秀期刊
  • 安徽省优秀科技期刊

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

精索静脉曲张的不育病人精子线粒体DNA片段缺失的调查

呼明闯 章宏祥 周发友 高攀 唐晓磊

引用本文:
Citation:

精索静脉曲张的不育病人精子线粒体DNA片段缺失的调查

    作者简介: 呼明闯(1983-), 男, 主管检验技师
    通讯作者: 唐晓磊, 278471655
  • 基金项目:

    国家自然科学基金资助项目 81601806

  • 中图分类号: R697.24

Investigation of the DNA fraction deficiency of sperm mitochondria in infertility patients with varicocele of spermatic cord

    Corresponding author: TANG Xiao-lei, 278471655
  • CLC number: R697.24

  • 摘要: 目的分析精索静脉曲张导致的不育病人的精子线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)中一个长为4 977 bp的片段缺失的情况。方法收集60例精索静脉曲张的不育病人和90名健康男性的精液标本,并抽提精子的总DNA,用Gap-PCR技术检测DNA 4 977 bp片段的缺失情况。结果在81.66%的患有精索静脉曲张的不育病人和4.44%的健康人对照中存在DNA 4 977 bp片段的缺失。患有精索静脉曲张的不育病人中DNA缺失频率更高(OR=139.80,95%CI=40.08~487.30,P < 0.01)。结论精索静脉曲张可能会导致一些男性精子DNA缺失,并导致不育。且精子线粒体DNA 4 977 bp片段缺失与精索静脉曲张所致不育症存在一定的相关性。
  • 图 1  琼脂糖凝胶电泳检测mtDNA4977基因片段缺失

    表 1  2组研究对象的基本资料比较

    分组n年龄
    (x±s)/岁
    婚史抽烟酗酒史腹部手术史
    精索静脉曲张组 60 31.32±8.5 53 7 33 3
    对照组 90 32.24±7.7 82 8 46 4
    χ2 0.69 0.31 0.22 0.02
    P > 0.05 > 0.05 > 0.05 > 0.05
    △示t
    下载: 导出CSV
  • [1] 李宏军.男性不育伴精索静脉曲张的治疗策略[J].中华男科学杂志, 2018, 24(3):195.
    [2] 符浩宋, 汶珂, 凌晓辉, 等.精索静脉曲张不育病人氧化应激水平和精子DNA完整性及精液参数的相关性分析[J].中华男科学杂志, 2016, 22(6):530.
    [3] AGARWAL A, SHARMA RK, DESAI NR, et al.Role of oxidative stress in pathogenesis of varicocele and infertility[J].Urology, 2009, 73(3):461. doi: 10.1016/j.urology.2008.07.053
    [4] GABRIEL MS, CHAN SW, ALHATHAL N, et al.Influence of microsurgical varicocelectomy on human spermmitochondrial DNAcopy number:a pilot study[J].J Assist Reprod Genet, 2012, 29(8):759. doi: 10.1007/s10815-012-9785-z
    [5] LAVIGNERA S, CONDORELLI R, VICARI E, et al.Effects of varicocelectomy on sperm DNA fragmentation, mitochondrial function, chromatin condensation, and apoptosis[J].J Androl, 2012, 33(3):389. doi: 10.2164/jandrol.111.013433
    [6] DADA R, KUMAR R, SHAMSI MB, et al.Azoospermia factor deletions in varicocele cases with severe oligozoospermia[J].Indian J Med Sci, 2007, 61(9):505. doi: 10.4103/0019-5359.34519
    [7] CHEN SS, CHIULP.The hOGG1 Ser326Cys polymorphism and male subfertility in Taiwanese patients withvaricocele[J].Andrologia, 2018, 50(5):e13007. doi: 10.1111/and.13007
    [8] GAO D, ZHU B, SUN H, et al.mitochondrial DNA methylation and related disease[J].Adv Exp Med Biol, 2017, 1038:117.
    [9] 梁爽, 王成彬.精子线粒体基因片段缺失及点突变与弱精症相关性研究进展[J].临床检验杂志, 2015, 4(1):818.
    [10] GUO H, GONG Y, HE B, et al.Relationships between mitochondrialDNA content, mitochondrial activity, and boar sperm motility[J].Theriogenology, 2017, 87:276. doi: 10.1016/j.theriogenology.2016.09.005
    [11] MUFTUOGLU M, MORI MP, DESOUZA-PINTO NC.Formation and repair of oxidative damage in the mitochondrial DNA[J].Mitochondrion, 2014, 17:164. doi: 10.1016/j.mito.2014.03.007
    [12] 梁爽, 王成彬.精子线粒体基因片段缺失及点突变与弱精症相关性研究进展[J].临床检验杂志, 2015, 26(1):818.
    [13] PETROS JA, BAUMANN AK, RUIZ-PESINI E, et al.mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(3):719. doi: 10.1073/pnas.0408894102
    [14] ISHIKAWA T, KONDO Y, YAMAGUCHI K, et al.Effect of varicocelectomy on patients with unobstructive azoospermia and severe oligospermia[J].BJU Int, 2008, 101(2):216.
    [15] DIEAMANT F, PETERSEN CG, MAURI AL, et al.Semen parameters in men with varicocele:DNA fragmentation, chromatin packaging, mitochondrial membrane potential, and apoptosis[J].JBRA Assist Reprod, 2017, 21(4):295.
    [16] MALIK AN, CZAJKA A, CUNNINGHAM P.Accurate quantification of mouse mitochondrial DNA without co-amplification of nuclear mitochondrial insertion sequences[J].Mitochondrion, 2016, 29:59. doi: 10.1016/j.mito.2016.05.003
    [17] AGARWAL A, SHARMA R, SAMANTA L, et al.Proteomic signatures of infertile men with clinical varicocele and their validation studies reveal mitochondrial dysfunction leading to infertility[J].Asian J Androl, 2016, 18(2):282. doi: 10.4103/1008-682X.170445
    [18] PABÓN D, MESEGUER M, SEVILLANO G, et al.A new system of sperm cryopreservation:evaluation of survival, motility, DNA oxidation, and mitochondrial activity[J].Andrology, 2019, 7(3):293. doi: 10.1111/andr.12607
  • [1] 黎晋宇金明昱袁少英吴琴芙覃湛唐文志耿立果 . 彩色多普勒高频超声在精索静脉曲张不育症检查中的价值. 蚌埠医学院学报, 2018, 43(3): 371-373,378. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2018.03.027
    [2] 徐鹏琛孙超 . 精索静脉曲张病人血清8-羟基脱氧鸟苷水平的临床价值. 蚌埠医学院学报, 2019, 44(3): 350-352. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2019.03.020
    [3] 魏彪罗甘霖杜围张新明徐华郭德迎 . 腹腔镜手术治疗精索静脉曲张113例分析. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(3): 297-298.
    [4] 胡宗亚王勤甫王飞 . 2种高位结扎术治疗精索静脉曲张疗效比较. 蚌埠医学院学报, 2012, 36(9): 1080-1081.
    [5] 彭光生陈怡 . 彩色多普勒超声在诊断精索静脉曲张中的价值. 蚌埠医学院学报, 2014, 39(9): 1262-1264.
    [6] 徐峰汪泓郝宝金 . 亚临床型精索静脉曲张对精液质量的影响. 蚌埠医学院学报, 2013, 37(11): 1448-1449.
    [7] 赵华萌 . 少精及无精不育患者血清性激素水平分析. 蚌埠医学院学报, 2014, 38(4): 492-493.
    [8] 王昌兵顾恒董章霞李博余同辉 . 两孔法腹腔镜精索静脉高位结扎术治疗精索静脉曲张76例分析. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(10): 1007-1008.
    [9] 石松山赵先诚田闯于杰陈泰安吴凯 . 腹腔镜精索静脉高位结扎术联合复方玄驹胶囊治疗精索静脉曲张引起男性不育症的临床研究. 蚌埠医学院学报, 2017, 42(6): 772-773,777. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2017.06.024
    [10] 李培生贲大刚褚亮孙发缔 . 激光结合高位结扎治疗下肢静脉曲张6例. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(5): 474-476.
    [11] 孙刚江永强徐友标张军曹辉 . 腔内激光治疗大隐静脉曲张138例临床分析. 蚌埠医学院学报, 2014, 39(8): 1039-1041.
    [12] 司春强 . 泡沫硬化剂治疗大隐静脉曲张的疗效分析. 蚌埠医学院学报, 2014, 38(3): 329-331.
    [13] 唐晓燕章菊夏俊陈俊霞崔秀云 . 核糖核酸酶抑制因子与人乳腺癌细胞恶性增殖的相关性研究. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(6): 731-735.
    [14] 郭劲松唐军建倪良宏王长春 . 微创刨吸、电凝及股静脉瓣环缩术治疗下肢浅静脉曲张. 蚌埠医学院学报, 2007, 32(1): 38-39.
    [15] 郑以山顾勤刘宁 . 控制性低中心静脉压在肝硬化静脉曲张出血中的应用价值. 蚌埠医学院学报, 2009, 34(2): 133-135.
    [16] 吴冬会金强姚晓玲杨晓双 . 小红细胞对血小板参数缺失的影响. 蚌埠医学院学报, 2019, 44(1): 111-112. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2019.01.031
    [17] 贲大刚李培生张杰孙发娣 . 腔内激光闭合术结合高位结扎和点状抽剥治疗大隐静脉曲张. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(2): 137-138,141.
    [18] 杨清峰张旭江泳周磊张爽房玉亮黄敏 . 无痛胃镜下套扎治疗食管静脉曲张的疗效及安全性分析. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(12): 1309-1311.
    [19] 闻静邵明孙娟 . 老年人急性非静脉曲张性上消化道出血病因及相关因素分析. 蚌埠医学院学报, 2013, 37(7): 806-808.
    [20] 马沙沙高春明 . PC、SD、PC/SD、FIB-4对肝硬化食管静脉曲张的诊断价值. 蚌埠医学院学报, 2020, 45(10): 1344-1347. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2020.10.008
  • 加载中
图(1)表(1)
计量
  • 文章访问数:  3465
  • HTML全文浏览量:  1896
  • PDF下载量:  6
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2019-09-06
  • 录用日期:  2020-01-31
  • 刊出日期:  2020-06-15

精索静脉曲张的不育病人精子线粒体DNA片段缺失的调查

    通讯作者: 唐晓磊, 278471655
    作者简介: 呼明闯(1983-), 男, 主管检验技师
  • 1. 安徽省血吸虫病防治研究所, 安徽 合肥 230061
  • 2. 皖南医学院第二附属医院 基础实验室, 安徽 芜湖 241000
  • 3. 皖南医学院第二附属医院 血管性疾病研究中心, 安徽 芜湖 241000
基金项目:  国家自然科学基金资助项目 81601806

摘要: 目的分析精索静脉曲张导致的不育病人的精子线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)中一个长为4 977 bp的片段缺失的情况。方法收集60例精索静脉曲张的不育病人和90名健康男性的精液标本,并抽提精子的总DNA,用Gap-PCR技术检测DNA 4 977 bp片段的缺失情况。结果在81.66%的患有精索静脉曲张的不育病人和4.44%的健康人对照中存在DNA 4 977 bp片段的缺失。患有精索静脉曲张的不育病人中DNA缺失频率更高(OR=139.80,95%CI=40.08~487.30,P < 0.01)。结论精索静脉曲张可能会导致一些男性精子DNA缺失,并导致不育。且精子线粒体DNA 4 977 bp片段缺失与精索静脉曲张所致不育症存在一定的相关性。

English Abstract

  • 精索静脉曲张是指精索静脉丛的静脉发生异常曲折和扩张,是导致男性不育的因素之一。正常男性人群中精索静脉曲张的发生率约15%,其中40%导致不育[1]。精索静脉曲张可导致精子中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平增加,从而产生氧化应激。许多研究[2-3]均表明精索静脉曲张病人的血清、精液、睾丸组织中的氧化应激水平升高。当然还有一些其他因素,如微量元素、Y染色体微缺失等[4-7]

    有研究[2, 8-11]表明,线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的缺陷与男性不育有关,某些线粒体基因中单核苷酸多态性和缺失与精子质量低下有关。mtDNA最常见的病理变化是4 977 bp片段的重排或缺失,其中有研究[12-13]报道在前列腺癌等疾病中存在4 977 bp片段的缺失,4 977 bp片段缺失还是衰老和线粒体功能障碍的标志。随着机体老化,4 977 bp片段的缺失也在人类的组织中逐渐累积,并与人类精子的死亡率增加、生育能力下降有关联[14-15]。线粒体DNA中4 977 bp片段基因发生缺失的位置在8 483~13 459 bp之间,而该片DNA中包涵了ATPase 6/8、COⅢ、ND3、ND4L和ND4等许多结构基因和6个tRNA基因。这些DNA片段编码的蛋白是呼吸酶,其DNA缺失会导致ATP生成缺陷。因此, 本研究拟对精索静脉曲张在不育病人的精子mtDNA 4 977 bp片段缺失中的分布情况加以研究,以期验证其与不育的关系。

    • HAM′S F10液清洗(购自Sigma公司);DNA试剂盒(购自Tiangen公司);引物由上海生工生物工程有限公司合成、纯化;DNA ladder、PCR mix扩增试剂(购自赛默飞公司);琼脂糖和TAE电泳缓冲液均购自索莱宝公司。

    • 选取皖南医学院第二附属医院2015年3月至2017年8月泌尿男科门诊病人,其中经筛选60例患有精索静脉曲张的不育病人(精索静脉曲张组)和90名健康人(对照组)纳入研究。2组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)(见表 1),具有可比性。精索静脉曲张根据其彩超特点进行分级:Ⅲ级(大,从病人阴囊表皮处可观察到),Ⅱ级(中等大小,无需用瓦尔萨尔试验就可探及),Ⅰ级(小,需用瓦尔萨尔试验才可探及)[16]。收集所有病人和对照组具体的既往史,包括职业、吸烟酗酒史、腹部手术史。所有病人和对照组禁欲5 d后手淫法收集精液样本。所有纳入研究的对象均书面知情同意。本研究获得皖南医学院第二附属医院单位伦理委员会批准。

      分组n年龄
      (x±s)/岁
      婚史抽烟酗酒史腹部手术史
      精索静脉曲张组 60 31.32±8.5 53 7 33 3
      对照组 90 32.24±7.7 82 8 46 4
      χ2 0.69 0.31 0.22 0.02
      P > 0.05 > 0.05 > 0.05 > 0.05
      △示t

      表 1  2组研究对象的基本资料比较

    • 精液样本在37 ℃液化,然后分成体积为一次射精量的等份试样,根据WHO 1999年的标准检测精子的浓度和形态。等待至少30 min直到精液液化,梯度离心收获精子。收获的精子用HAM′S F10液清洗,后再3 000 r/min离心5 min,弃上清液,即得精子。

    • 用哺乳动物细胞DNA试剂盒抽提每份精子标本的总DNA,所得的DNA须符合最佳光密度比A260/A280=1.8及以上,然后储存于-20 ℃备用。

    • 为检测在总DNA中有mtDNA,而且存在4 977 bp片段的mtDNA缺失,设计了2对引物。引物序列为MT1 (1 257~1 279):5′ -TAT ACC GCC ATC TTC AGC AAA C-3′,MT2 (1 433~1 411):5′ -TAC TGC TAA ATC CAC CTT CGA C-3′和D1(8 416~8 437):5′-CCT TAC ACT ATT CCT CAT CAC C-3 ′,D2 (13 519~13 498):5′-TGT GGT CTT TGG AGT AGA AAC C-3 ′,分别用于检测有无mtDNA和有无4 977 bp片段DNA缺失[17]。通过位于高度保守的12S区域的一个177 bp长的序列的扩增可确定总DNA中存在mtDNA,通过缺失区域侧翼的一个127 bp长的产物可确定存在4 977 bp片段DNA缺失。PCR的反应体系为:20 ng的基因组DNA,25 μL 2×PCR mix、10 pmol上下游引物各1 μL, 补足水至总反应体积50 μL。PCR运行体系为:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s、60.5 ℃退火45 s、72 ℃延伸30 s,此三步30个循环,最后72 ℃延伸10 min。扩增完成后,取6 μL PCR产物,加1 μL 6×Loading buffer,在缓冲液为1×TAE、2.5 %琼脂糖中电泳。然后在紫外灯下显影。所有存在模糊不清的标本均进行重复以保证结果质量。

    • 采用χ2检验和t检验。

    • 结果显示,有2条条带,大小分别为127 bp和177 bp(见图 1)。所有DNA样本用mtDNA12S区域引物扩增均成功得到产物,大小为177 bp的条带证实了在总DNA中有mtDNA的存在,大小为127 bp的条带扩增自mtDNA缺失的4 977 bp片段。电泳结果显示,60例精索静脉曲张组病人中有52例病人的精子mtDNA存在4 977 bp片段的缺失,而90例对照组中4例存在4 977 bp片段的缺失(χ2=104.03,P < 0.01)。在81.66%的患有精索静脉曲张的不育病人和4.44%的健康人存在DNA 4 977 bp片段的缺失,结果显示,mtDNA 4 977 bp片段的缺失与精索静脉曲张导致的不育有关联(OR=139.80,95%CI=40.08~487.30,P < 0.01)。

      图  1  琼脂糖凝胶电泳检测mtDNA4977基因片段缺失

    • 本次研究表明,精索静脉曲张病人中精子mtDNA 4 977 bp片段缺失的频率比健康人更高,而且精子中这一DNA片段的缺失可能会导致病人不育。CHEN等[7]研究表明,患有精索静脉曲张的不育病人、亚临床精索静脉曲张的不育病人和健康年轻男性的精子mtDNA 4 977 bp片段的缺失频率分别为41.3%、17.7%和1.67%。

      精子功能障碍被认为是导致男性不育的最主要的原因。mtDNA中ATP生成基因的突变会影响精子的活动能力,而精子的活动能力低下是不育的重要影响因素,因此mtDNA的突变可能会损害精子的活动能力[18]。线粒体最早被发现与男性不育存在关联始于20世纪90年代早期,当时的研究者报道在精子活动能力降低的男性中存在线粒体结构缺陷[18]。mtDNA突变在男性精液的病理变化中发生了重要作用,在精子活动能力低下和不育的男性病人的精子中存在更多的mtDNA基因缺失[8]。感染、不良生活习惯(如吸烟)和环境因素(如环境污染、辐射)等许多因素会增加ROS的生成。由于精索静脉曲张病人的睾丸静脉中白细胞DNA 8-OHdG的水平比外周静脉中的水平高,从而睾丸经脉中会产生更多的活性自由基[7]

      DNA对氧化损伤很敏感,精子的DNA遭受严重氧化损伤时可能会导致不育[17-18]。精子的膜表面富含多聚不饱和脂肪酸,因此极易受到氧化损伤。过量的ROS会诱导氧化应激,从而同时损伤精子的核DNA和mtDNA。

      mtDNA的缺失可能会导致多重呼吸链的缺陷[2, 17]。有缺陷的呼吸酶,包括由缺失的DNA片段编码的蛋白亚基可能会促进活性自由基的生成。mtDNA中缺失的4977bp片段中包括了多个编码呼吸酶的基因,这些基因的缺失可能与精子活动能力的降低和男性不育有关联。精索静脉曲张,同时ROS生成增加,会导致精子mtDNA的突变,最终导致不育。由于精索静脉曲张恢复正常后,会促进抗氧化剂的生成,并减少精子中的氧化应激,从而可能会促进男性的生育力。

      综上所述,本研究发现精子mtDNA中4 977 bp片段的缺失与精索静脉曲张导致的不育存在一定程度的相关。佐证了精子线粒体DNA片段缺失是精索静脉曲张导致不育的一种重要因素。然而,尚需更大样本量的研究来确认精子mtDNA中4 977 bp片段的缺失与精索静脉曲张导致的不育的关联。

参考文献 (18)

目录

    /

    返回文章
    返回