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肺炎克雷伯菌是临床常见的一种革兰阴性菌，CHINET监测数据显示其仅次于大肠埃希菌居于临床分离细菌的第二位，但耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant K.pneumoniae，CRKP)在耐碳青霉烯肠杆菌科细菌中所占比率最大，且近年来有迅速增加的趋势，给临床治疗和感染控制工作带来了很大的困难[1]。本研究收集2018年1-8月蚌埠市第三人民医院临床分离的14株CRKP，同时将其进行药敏试验、耐药表型筛查、基因检测和同源性分析，旨在为临床科室使用抗菌药物和医院感染防控部门提供实验依据。
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14株CRKP分离自本院临床送检标本(去除同一病人重复分离的菌株)，其中ICU病房5株，新生儿病房4株，神经外科3株，普外科和呼吸内科各1株。标本类型为痰液9例，尿液2例，血液1例，支气管和切口分泌物各1例。菌株的分离培养均严格参照《全国临床检验操作规程》(第三版)操作，菌株的鉴定使用生物梅里埃公司(法国)的VITEK Compact型全自动微生物分析仪鉴定分析至种。质控菌株(大肠埃希菌ATCC25922)购于卫生部临检中心，产KPC-2型肺炎克雷伯菌的阳性对照菌株由安徽医科大学第一附属医院微生物实验室惠赠。
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应用VITEK Compact型全自动微生物分析系统作药敏试验，参照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)2016年标准判断检测结果，药敏数据用WHONET 5.6软件比对分析。
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参照2016年CLSI标准操作改良Hodge试验，配制0.5麦氏浓度的大肠埃希菌ATCC25922菌液，用无菌0.9%氯化钠溶液作10倍稀释后涂布于M-H平板，平板正中贴10 μg的厄他培南药敏纸片，待测菌呈放射状从药敏纸片的边缘向平板边缘作划线，于35 ℃温箱中孵育，过夜。结果观察以抑菌圈处出现被检测菌生长增强者(矢状)为阳性，表示该检测菌株产碳青霉烯酶。将已知产KPC-2型肺炎克雷伯菌株作阳性对照菌株，ATCC25922作阴性对照菌株。
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挑取MH平板上适量菌落，用煮沸法提取细菌的DNA，应用PCR技术扩增blaKPC-2耐药基因。引物和扩增条件参照文献方法[2-3]。KPC-2引物：F5′-TCG CTA AAC TCG AAC AGG-3′，R5′-TTA CTG CCC GTT GAC GCC CAA TCC-3′。PCR反应体系：10 μmol/L上游和下游引物各1 μL，PCR Mix 12.5 μL，模板2.5 μL，加入双蒸水到25 μL。反应的条件：94 ℃预变性，时间5 min；94 ℃变性，时间15 s；55 ℃退火，时间30 s；72 ℃延伸，时间35 s；进行30个循环。最后72 ℃再延伸10 min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后置于成像系统观察、拍照并记录检测结果。
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对14株CRKP应用肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)进行同源性分析，参考文献[3-4]设计引物：R5′-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3′，F5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3′。扩增条件：94 ℃预变性，时间3 min；然后94 ℃，时间60 s；55 ℃，时间60 s；72 ℃，时间90 s，进行35个循环，最后72 ℃再延伸10 min。产物经琼脂糖凝胶电泳分析。检测结果判断标准：扩增条带数目和位置完全相同者为同一克隆株，主条带的位置相同，副带相差1~2条者为亚型或者密切相关，不符合以上条件者为不同基因型菌株。
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14株CRKP对临床多种抗菌药物均表现耐药，耐药率见表 1。
抗菌药物 耐药株数(n) 耐药率/% 氨苄西林 14 100.00 氨苄西林/舒巴坦 14 100.00 哌拉西林/他唑巴坦 13 92.86 头孢唑林 14 100.00 头孢替坦 11 78.57 头孢曲松 13 92.86 头孢他啶 14 100.00 头孢吡肟 13 92.86 亚胺培南 14 100.00 厄他培南 14 100.00 氨曲南 11 78.57 阿米卡星 8 57.14 庆大霉素 11 78.57 妥布霉素 10 71.43 复方新诺明 3 21.43 左氧氟沙星 7 50.00 环丙沙星 8 57.14 呋喃妥因 8 57.14 表 1 14株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药率(%)
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14株CRKP中改良Hodge试验11株阳性，阳性率为78.57%。改良Hodge试验的阳性待测菌株见图 1。
图 1 改良Hodge试验(阳性对照:已知产KPC-2型肺炎克雷伯菌，阴性对照: ATCC25922)
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以已知产KPC-2型的肺炎克雷伯菌为阳性对照，双蒸水为阴性对照，PCR扩增产物电泳结果显示有12株CRKP经基因扩增后与阳性对照的电泳条带位置相同，表明检出KPC-2基因，其阳性率为85.71%，扩增产物电泳图见图 2。
图 2 KPC-2基因扩增电泳图(M:DNA Marker; P:已知IKPC-2基因阳性肺炎克雷伯菌菌株; N:阴性对照; 1~14:待测菌株)
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14株CRKP的指纹图谱见图 3，其扩增条带数多为3~7条，根据ERIC-PCR产物电泳指纹图谱将其分为3个亚型，其中A型11株(ICU病房5株，神经外科3株，新生儿病房2株，普外科1株)，B型2株(新生儿病房2株)，C型1株(呼吸内科1株)。
图 3 ERIC-PCR扩增产物电泳图(M: DNA Marker; 1~14:1~14号CRKP株指纹图谱)
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CRKP是一种常见的多重耐药菌，属于医院感染监测的目标细菌之一。CRKP的出现常造成临床抗菌药物治疗的失败和病人医疗费用及病死率的增加。本研究14株CRKP的药敏结果显示，菌株对包括一至四代头孢、酶抑制剂复合物及碳青霉烯类在内的所有β-内酰胺类药物耐药率都比较高，对头孢替坦及氨曲南的耐药率稍低。对氟喹诺酮类及氨基糖苷类药物的耐药率也比较高，仅对磺胺类稍为敏感，表明本院分离的CRKP均表现为高水平耐药的多重耐药菌。肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物最常见的耐药机制是产KPC酶，主要为KPC-2型。继浙江地区最早报道后全国多个地区均有陆续发现[5]。改良Hodge试验(MHT)是CLSI推荐检测碳青霉烯酶表型的方法，本文中11株MHT阳性的菌株在后续的PCR实验中均检测到表达blaKPC-2基因。本研究中尚有2株菌未检测到KPC-2基因，接下来的研究我们将增加检测除KPC-2以外的碳青霉烯酶如金属酶NDM-1、IMP、VIM及OXA-48的基因，编码这些酶的基因多通过质粒介导，可依靠转座子、插入序列等多种基因元件在不同菌株间转移，引起菌株间耐药基因的水平传播，易导致耐药菌引起的医院感染暴发流行[6]。
由于多重耐药菌株的耐药表型、基因型及流行分布情况会因时间、地域的不同而变化，故了解本医院CRKP菌株的分子流行病学特征对阻断此类多重耐药菌传播和防控医院感染具有重要意义。ERIC-PCR方法快速简便，可作为实验室菌株同源性分析的方法[7]。本研究显示本院内有产KPC-2型的克隆菌株流行趋势，主要集中在ICU、神经外科和新生儿病房，涉及到的临床科室应积极做好消毒隔离和防护措施，对医务工作者加强培训，增强一线工作人员对多重耐药菌医院感染控制工作的重视，可以有效防止CRKP的进一步传播和扩散。
综上所述，在检验科微生物室准确鉴定耐碳青霉烯类菌株并深入研究其相关耐药机制，临床医生规范使用碳青霉烯类抗生素的前提下，医院感染控制部门还应建立更全面的干预机制，开展相关的感染控制措施：尽可能减少对病人不必要的侵袭性操作；规定在使用抗菌药物治疗前必须做药敏试验；保持环境的清洁和消毒；强化医务工作者手卫生意识；制订严格的接触隔离预防措施，为CRKP感染的病人提供单独的隔离空间；同时在高危病房建立积极有效的监控机制等。总之，医院感染管理科、微生物室和临床科室应加强联系，共同监测、联合督查，才能力争尽早发现和阻断CRKP在院内的传播，预防多重耐药菌导致医院感染的流行。
耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药率及同源性分析
Analysis of drug resistance rate and homology of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae
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摘要:
目的分析耐碳氢酶烯肺炎克雷伯菌的耐药基因及流行病学特征。 方法收集2018年1-8月临床分离出的14株耐碳氢酶烯类肺炎克雷伯菌，使用VITEK Compact微生物系统进行菌株鉴定和药敏试验，改良Hodge试验检测碳青霉烯酶，PCR试验检测耐药基因，肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应（ERIC-PCR）分析菌株同源性。 结果14株耐碳氢酶烯类肺炎克雷伯菌对青霉素类、碳青霉烯类、氨曲南和头孢菌素类等抗菌药物表现出较高的耐药性。11株肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶表型阳性，PCR检测发现12株肺炎克雷伯菌KPC-2基因阳性，14株肺炎克雷伯菌根据ERIC-PCR结果分成3型，其中A型为主，集中在ICU病房和神经外科。 结论耐碳氢酶烯类肺炎克雷伯菌表现为严重的多重耐药性，以产生KPC酶和A型为主。 Abstract:ObjectiveTo analyze the drug-resistant genes and epidemiological characteristics of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae. MethodsFourteen strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae were collected from January to August 2018, and the strain identification and drug susceptibility test were implemented using the VITEK Compact system.The modified Hodge test was used to detect the carbapenems, the PCR test was used to detect the drug-resistant genes, and the homology of the strains was analyzed using intergene repeated sequence polymerase chain reaction(ERIC-PCR). ResultsFourteen strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae were highly resistant to penicillins, carbapenems, aztreonam and cephalosporins.Eleven strains of Klebsiella pneumoniae were positive in the modified Hodge test.The positive KPC-2 gene in 12 strains of Klebsiella pneumoniae were identified by PCR.The 14 strains could be classified into 3 genotypes, the type A was main, which was mainly isolated from ICU and neurosurgery. ConclusionsThe carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae shows the severe multi-drug resistance, mainly producing KPC enzyme and type A. -
Key words:
- Klebsiella pneumoniae /
- carbapenemase /
- modified Hodge test
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表 1 14株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药率(%)
抗菌药物 耐药株数(n) 耐药率/% 氨苄西林 14 100.00 氨苄西林/舒巴坦 14 100.00 哌拉西林/他唑巴坦 13 92.86 头孢唑林 14 100.00 头孢替坦 11 78.57 头孢曲松 13 92.86 头孢他啶 14 100.00 头孢吡肟 13 92.86 亚胺培南 14 100.00 厄他培南 14 100.00 氨曲南 11 78.57 阿米卡星 8 57.14 庆大霉素 11 78.57 妥布霉素 10 71.43 复方新诺明 3 21.43 左氧氟沙星 7 50.00 环丙沙星 8 57.14 呋喃妥因 8 57.14 
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[1] 胡付品, 朱德妹, 汪复, 等.2015年CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志, 2016, 16(6):685. [2] 姚欣, 冯莉, 朱艮苗.碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌分子流行病学及耐药机制[J].中国抗生素杂志, 2018, 43(1):85. [3] 李睿, 辛力华, 张青, 等.碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌ERIC-PCR指纹图谱分型的研究[J].解放军医药杂志, 2018, 30(11):102. [4] 储雯雯, 刘周, 杨凯, 等.碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌耐药机制及分子流行病学研究[J].安徽医科大学学报, 2016, 51(6):809. [5] 王健, 潘亚萍, 徐元宏, 等.耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌药物敏感性和耐药基因研究[J].安徽医科大学学报, 2018, 53(8):1231. [6] 李秀清, 高磊, 崔兰卿, 等.急诊重症监护室患者感染碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌分子流行病学的研究[J].中华医院感染学杂志, 2017, 27(15):3404. [7] 苏珊珊, 宫雪, 张吉生, 等.重症监护室流行耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制及同源性分析[J].中国感染与化疗杂志, 2018, 18(5):508. -
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图(3)表(1)
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