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血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的表型分化是众多心血管疾病的病理基础，包括高血压、动脉粥样硬化、肺动脉高压、脑卒中等。生物钟系统是生物为适应地球24 h的光暗循环而进化出来的一种内源性时钟系统，由一系列生物钟基因组成。多种生理状态或者行为如睡眠、免疫系统、心血管系统等均受生物钟系统调控。生物钟结构和功能的改变是导致多种疾病如睡眠呼吸暂停症、非杓型血压的病理学基础。研究[1-2]表明，VSMCs内生物钟基因，例如Bmal1、CLOCK、Per1、Cry1，对血管平滑肌的表型分化具有调控作用, 进而影响疾病的进程。在心血管疾病的高危因素中，高脂血症[1]、高胆固醇[3]等均对VSMCs内生物钟基因表达节律产生抑制作用，进而发展成动脉粥样硬化[4]。烟草中尼古丁是心血管疾病的头号杀手，促进VSMCs细胞表型分化[5]，导致不良的心血管事件发生。尼古丁对VSMCs细胞内生物钟基因的表达节律是否有影响尚未见文献报道。因此，本研究提取了原代大鼠主动脉VSMCs细胞，诱导VSMCs细胞表型分化的同时，检测VSMCs细胞内生物钟基因的表达节律，以期对心血管疾病发生发展的病理基础提供理论支持。
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胎牛血清(Sigma公司)；DMEM高糖培养基(Hyclone公司)；四氮唑蓝(MTT)(天根生化科技有限公司)；总RNA提取试剂Trizol(碧云天生物科技有限公司)；QuantScript RT Kit(天根生化科技有限公司)；SuperReal PreMix Plus(天根生化科技有限公司)；α-SMA抗体(Abcam公司)；引物序列(广州瑞博生物科技有限公司)。尼古丁(Sigma公司)。
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取体质量150~200 g左右的SD大鼠，使用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉大鼠，腹主动脉取血处死大鼠，随后放置在75%乙醇中浸泡5 min消毒。切开大鼠胸腔，可见与脊柱并行的主动脉血管，分离主动脉血管，放入预冷的PBS中，洗去主动脉血管表面的血迹。放入新的装满20%胎牛血清培养基的培养皿中。套袖法去除大鼠主动脉外的脂肪组织，用眼科剪沿血管中轴线将血管剪开，镊子轻轻刮血管内壁，除去血管内皮细胞。用镊子缓慢剥离血管中层，剪碎为大小1 mm×1 mm的组织块。均匀铺在T25培养瓶中，加入3~4 mL的20%胎牛血清培养基，倒置于培养箱(37 ℃，5% CO2)中30 min后，缓慢翻正培养瓶，使液体均匀覆盖在培养瓶底部。6~7 d后，VSMCs会从组织块周围爬出，用含EDTA的0.25%胰酶消化细胞传代，使用免疫荧光法对细胞表面标志性蛋白进行鉴定。6~8代细胞进行后续实验。
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VSMCs传代、生长、融合后，会出现明显的“峰”“谷”现象，从形态学角度被认为是VSMCs特征(见图 1A)。使用免疫荧光法检测VSMCs表面α-SMA蛋白。首先将细胞铺板于96孔板上，使用4%多聚甲醛固定15 min后，PBS洗2遍，每遍3 min；然后加入用PBS配置的0.1% TritonX-100通透20 min；再加入5%胎牛血清封闭1 h。洗去PBS，用PBS按1:200的比例稀释α-SMA一抗孵育过夜；最后加入荧光二抗，湿盒中避光1 h，DAPI染5 min，随即用封片液封闭，在荧光显微镜下拍照合成(见图 1B)。
图 1 VSMCs细胞鉴定与Nicotine促进增殖效果
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细胞90%融合后，消化、铺板于96孔板上，每孔3 000~5 000个细胞，加入梯度尼古丁(10、100、1 000 nmol/L)刺激，在24 h时间内检测细胞活力，确定尼古丁最佳给药剂量。确定剂量后，使用最佳剂量尼古丁分别刺激细胞24、48、72 h，使用MTT法检测细胞活力。在96孔中加入5 mg/L的MTT，在37 ℃孵育4 h，缓慢吸尽上层培养基后，加入150 μL的DMSO溶液，轻轻震荡15 min，使用酶标仪在单波长490 nm处检测各孔吸光度，计算增殖率。增殖率＝(QD实验组-OD对照组)/(OD对照组-OD空白组)×100%
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VSMCs于清晨8:00开始，用50%的胎牛血清授时2 h，授予细胞节律性，此时记为ZT 0[1]。然后洗去胎牛血清，加入尼古丁100 nmol/L，在28 h内每隔4 h提取一次样本。使用总RNA提取试剂Trizol提取细胞内RNA含量，使用Quant cDNA第一链合成试剂盒，按照说明书步骤按两步法将提取出的RNA逆转录cDNA。在2 μL的cDNA中加入0.25 μmol的上下游引物以及5 μL的荧光染料2×SuperReal PreMix Plus，预变性后在95 ℃中10 s，62 ℃中30 s循环40次，用所得数据Cq值，用2-△△Cq法进行相对定量分析。引物序列见表 1。
靶基因 引物 序列 引物长度/bp Bmal1 Forward 3′-5′ GGA CTT CGC CTC TAC CTG TTC A 131 Reverse 5′-3′ AAC CAT GTG CGA GTG CAG GCG C CLOCK Forward 3′-5′ GTC TCT CCG TTG GCA TGT CT 139 Reverse 5′-3′ CCA AGT TCA TGG CGC TCT Cry1 Forward 3′-5′ TCG CCG GCT CTT CCA A 167 Reverse 5′-3′ TCA AGA CAC TGA AGC AAA AAT CG Per1 Forward 3′-5′ GCC TTC AGA CTC ATG ATG ACA GA 108 Reverse 5′-3′ TTT GTG TGC CTC AGC TTT GG β-Actin Forward 3′-5′ CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC 150 Reverse 5′-3′ TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC 表 1 实验中上下游引物序列
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采用方差分析、q检验和t检验。28 h内PCR实验所得的Cq值, 使用余弦法拟合。使用Graphpad prism软件将各组数据使用下列公式拟合：Y=Amplitude ×cos[(0.2618×(X-Phase)]+ Mesor。中值(Mesor)为24 h余弦曲线的均值，振幅(Amplitude)为24 h内余弦曲线最高值及最低值与中值的差值，相位(Phase)为24 h内余弦曲线的最高值所在的时间点[6]。
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使用梯度的尼古丁刺激VSMCs 24 h发现，当尼古丁浓度为100 nmol/L时刺激效果最好，增殖率可达25 %左右，且与对照组相比，差异均有统计学意义(P < 0.05)(见表 2、3)。随后用100 nmol/L尼古丁分别刺激24、48、72 h发现，在48 h时间点效果最好，增殖率可达50 %左右，与对照组相比，差异有统计学意义(P < 0.01)。
分组 OD值 增殖率/% 对照组 1.19±0.02 0 Nicotine组 10 nmol/L 1.36±0.03* 14.80±3.58** 100 nmol/L 1.66±0.07** 31.19±3.10** 1000 nmol/L 1.16±0.06** -2.56±3.44** F 64.36 74.83 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.025 11.421 表 2 24h内Nicotine梯度对VSMCs促增殖浓度效应
分组 OD值 增殖率/% 对照组 1.21±0.02 0 Nicotine组 24 h 1.49±0.07* 24.61±5.99** 48 h 1.80±0.05** 51.11±6.24** 72 h 1.86±0.03** 56.52±5.23** F 124.80 25.69 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.002 34.06 与对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01 表 3 Nicotine(100 nmol/L)对VSMCs促增殖的时间效应
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VSMCs加入尼古丁(100 nmol/L)刺激后，其细胞内生物钟基因表达节律明显改变。Bmal1和CLOCK基因的中值相对于对照组下调，Per1和Cry1基因表达上调，CLOCK基因表达相对于对照组下调，而Per1和Cry1上调，差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)，尼古丁使VSMCs内生物钟基因表达相位后移4~7 h(见图 2、表 4)。
图 2 Nicotin对VSMCs细胞内生物钟基因表达节律的影响
基因表达 对照组(n= 3) 尼古丁刺激组(n= 3) t P 中值 Bmal1 1.63±0.07 1.02±0.13 7.16 < 0.01 CLOCK 1.53±0.07 0.76±0.07 13.47 < 0.01 Per1 0.65±0.05 1.02±0.11 5.30 < 0.01 Cry1 0.61±0.06 2.03±0.18 12.96 < 0.01 振幅 Bmal1 0.71±0.10 0.52±0.18 1.59 >0.05 CLOCK 0.65±0.10 0.30±0.10 4.29 < 0.05 Per1 0.51±0.07 0.81±0.14 3.32 < 0.05 Cry1 0.54±0.09 0.95±0.24 2.88 < 0.05 相位/h Bmal1 10.58±0.55 17.43±1.33 8.24 < 0.01 CLOCK 12.22±0.61 16.17±1.26 4.89 < 0.01 Per1 22.74±0.53 26.03±0.11 10.53 < 0.01 Cry1 23.38±0.63 26.85±1.03 4.98 < 0.01 表 4 生物钟基因表达节律参数(x±s)
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当内皮细胞受损，VSMCs暴露在血浆营养因子下，获得了分化的能力，由静止的、收缩的状态发展成增殖的、分化的状态，称之为表型分化。研究[7-8]表明，VSMCs表型分化导致的血管壁增厚以及血管重构是众多心血管疾病的病理基础。因此，研究如何调控VSMCs表型分化一直是心血管领域研究热点。生物钟基因被报道可以调控血管平滑肌的表型分化，同时尼古丁作为心血管疾病的重要风险因素之一，是否通过调控生物钟基因的表达节律，进而影响VSMCs功能，从而导致心血管疾病的发生发展，尚未见文献报道。因此，本文提取了原代大鼠主动脉VSMCs，发现尼古丁在48 h内诱导细胞增殖的同时，对VSMCs内生物钟系统具有明显的调控作用，本文研究的结果将加深对VSMCs所致的心血管疾病的认识。
吸烟可以导致高血压、脑血栓和动脉粥样硬化等多种心血管疾病的发生，尼古丁是烟草的主要成分，且已被证实可以改变多种血管壁相关细胞的功能，造成内皮细胞损伤、VSMCs增殖等。现有研究中，多种因素包括高脂血症[1]、高胆固醇[3]、棕榈酸[6]均使生物钟基因表达节律的中值下调，造成细胞内生物钟系统的紊乱。在其他细胞系中，尼古丁可以显著抑制多种生物钟基因的表达[9]，但是该研究未在连续的时间变量下监测生物钟基因的表达。本研究中，100 nmol/L的尼古丁在48 h内引起VSMCs的增殖的同时，Bmal1和CLOCK基因的中值相对于对照组显著下调。不同于以上研究，Per1、Cry1基因的表达节律的中值明显上调。这可能是因为在生物钟反馈环路中，Per1、Cry1基因的表达上调会明显抑制Bmal1和CLOCK基因，使Bmal1和CLOCK基因的表达下调，呈现动态的周期性反应，而Per1、Cry1基因表达上调参与细胞的生长[10-11]。因此可以推测，虽然尼古丁使Bmal1和CLOCK基因表达中值下调，但是并没有破坏细胞内部的生物钟反馈环路，使Per1、Cry1基因的表达中值上调的同时促进细胞增殖。这可能由于所使用的尼古丁的浓度较小，研究[12]表明，在大剂量100 μmol/L时，尼古丁可以使VSMCs产生明显的细胞凋亡。但是在这种条件下，对VSMCs内生物钟基因表达的影响尚不可知，需要未来实验的进一步验证。
振幅体现细胞节律的波动情况。研究表明，血管紧张素Ⅱ[13]、氨茶碱[14]均能引起VSMCs内生物钟基因表达振幅的上调，表明氨茶碱引起的生物钟基因振幅表达上调可以预防心血管疾病的发生发展。在本研究中，虽然Per1、Cry1基因表达振幅上调，但是致使Bmal1和CLOCK基因的表达振幅下调，Bmal1和CLOCK作为调控细胞昼夜节律的核心基因，振幅的下调意味着细胞的衰老[15]以及伸缩性[16]的下降, 从而造成不良的心血管疾病。另一方面，尼古丁可以使VSMCs生物钟基因的表达相位显著后移4~7 h。现有研究中，不规律光照以及不规律饮食可以使生物钟基因表达产生明显的相位后移，其结果是与环境信号的昼夜节律不匹配，称为昼夜节律失调[17-18]。而昼夜节律失调是心血管疾病的重要风险因素。因此，本研究中VSMCs生物钟基因的表达相位显著后移，增加了心血管疾病风险，为尼古丁致心血管风险提供了生物节律方面的证据。
综上所述，尼古丁在48 h内，使VSMCs内生物钟基因Bmal1和CLOCK的表达节律中值、振幅显著下调；Per1和Cry1基因表达节律中值与振幅明显上调，同时使VSMCs内生物钟基因表达相位后约4~7 h，从而使VSMCs特异性增殖，进而可能引发不良的心血管疾病。本文研究的结果加深了对尼古丁使VSMCs表型分化，继而所致心血管疾病的认识。
尼古丁调控血管平滑肌细胞内生物钟基因表达节律的研究
Study on the nicotine regulating the circadian clock gene expression rhythm in vascular smooth muscle cells
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摘要:
目的研究尼古丁对原代大鼠主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs）内生物钟基因表达节律的影响。 方法使用贴壁法提取原代VSMCs，免疫荧光法检测VSMCs标志物α-SMA的表达，MTT法检测细胞活力，RT-PCR法检测VSMCs内生物钟基因Bmal1、CLOCK、Per1、Cry1的表达节律。数据使用余弦法拟合，计算昼夜节律参数。 结果尼古丁在100 nmol/L浓度刺激48 h，诱导VSMCs增殖效果最好。Bmal1和CLOCK基因的中值相对于对照组下调（P < 0.05和P < 0.01），而Per1和Cry1基因表达的中值上调，CLOCK基因表达振幅相对于对照组下调，而Per1和Cry1的振幅上调，差异均有统计学意义（P < 0.05~P < 0.01）；尼古丁使VSMCs内生物钟基因表达相位后移4~7 h。 结论尼古丁在48 h内使VSMCs内生物钟基因表达变化的同时，使VSMCs特异性增殖，产生表型分化。 Abstract:ObjectiveTo study the effects of nicotine on the circadian clock gene expression rhythm in primary rat aortic vascular smooth muscle cells(VSMCs). MethodsThe primary VSMCs were extracted using adherent method.The expression level of marker α-SMA of VSMCs was detected using immunofluorescence method, the viability was detected using MTT assay, and the expression rhythm of Bmal1, CLOCK, Per1 and Cry1 genes in VSMCs cells was detected using RT-PCR.The data were fitted using the cosine method to calculate circadian parameters. ResultsThe 100 nmol/L of nicotine could induce the best proliferation of VSMCs for 48 hours.Compared with the control group, the median value of Bmal1 and CLOCK genes expression were down-regulated(P < 0.05 and P < 0.01), the median value of Per1 and Cry1 genes expression were up-regulated, the amplitude of Per1 and Cry1 genes expression were down-regulated, the amplitude of Per1 and Cry1 genes expression were up-regulated, and the differences of which were statistically significant(P < 0.05 to P < 0.01). ConclusionsNicotine can change the circadian clock gene expression in VSMCs within 48 hours, and induce specific proliferation of VSMCs, and produce phenotypic differentiation. -
Key words:
- cardiovascular disease /
- nicotine /
- circadian clock gene /
- vascular smooth muscle cells
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表 1 实验中上下游引物序列
靶基因 引物 序列 引物长度/bp Bmal1 Forward 3′-5′ GGA CTT CGC CTC TAC CTG TTC A 131 Reverse 5′-3′ AAC CAT GTG CGA GTG CAG GCG C CLOCK Forward 3′-5′ GTC TCT CCG TTG GCA TGT CT 139 Reverse 5′-3′ CCA AGT TCA TGG CGC TCT Cry1 Forward 3′-5′ TCG CCG GCT CTT CCA A 167 Reverse 5′-3′ TCA AGA CAC TGA AGC AAA AAT CG Per1 Forward 3′-5′ GCC TTC AGA CTC ATG ATG ACA GA 108 Reverse 5′-3′ TTT GTG TGC CTC AGC TTT GG β-Actin Forward 3′-5′ CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC 150 Reverse 5′-3′ TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC 
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表 2 24h内Nicotine梯度对VSMCs促增殖浓度效应
分组 OD值 增殖率/% 对照组 1.19±0.02 0 Nicotine组 10 nmol/L 1.36±0.03* 14.80±3.58** 100 nmol/L 1.66±0.07** 31.19±3.10** 1000 nmol/L 1.16±0.06** -2.56±3.44** F 64.36 74.83 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.025 11.421
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表 3 Nicotine(100 nmol/L)对VSMCs促增殖的时间效应
分组 OD值 增殖率/% 对照组 1.21±0.02 0 Nicotine组 24 h 1.49±0.07* 24.61±5.99** 48 h 1.80±0.05** 51.11±6.24** 72 h 1.86±0.03** 56.52±5.23** F 124.80 25.69 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.002 34.06 与对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01
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表 4 生物钟基因表达节律参数(x±s)
基因表达 对照组(n= 3) 尼古丁刺激组(n= 3) t P 中值 Bmal1 1.63±0.07 1.02±0.13 7.16 < 0.01 CLOCK 1.53±0.07 0.76±0.07 13.47 < 0.01 Per1 0.65±0.05 1.02±0.11 5.30 < 0.01 Cry1 0.61±0.06 2.03±0.18 12.96 < 0.01 振幅 Bmal1 0.71±0.10 0.52±0.18 1.59 >0.05 CLOCK 0.65±0.10 0.30±0.10 4.29 < 0.05 Per1 0.51±0.07 0.81±0.14 3.32 < 0.05 Cry1 0.54±0.09 0.95±0.24 2.88 < 0.05 相位/h Bmal1 10.58±0.55 17.43±1.33 8.24 < 0.01 CLOCK 12.22±0.61 16.17±1.26 4.89 < 0.01 Per1 22.74±0.53 26.03±0.11 10.53 < 0.01 Cry1 23.38±0.63 26.85±1.03 4.98 < 0.01
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