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尼古丁调控血管平滑肌细胞内生物钟基因表达节律的研究

毕杨 林彤远

引用本文:
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尼古丁调控血管平滑肌细胞内生物钟基因表达节律的研究

    作者简介: 毕杨(1984-), 女, 主管药师.
  • 基金项目:

    中华医学会临床药学分会吴阶平青年基金 LCYX-Q010

  • 中图分类号: R540.4

Study on the nicotine regulating the circadian clock gene expression rhythm in vascular smooth muscle cells

  • CLC number: R540.4

  • 摘要: 目的研究尼古丁对原代大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)内生物钟基因表达节律的影响。方法使用贴壁法提取原代VSMCs,免疫荧光法检测VSMCs标志物α-SMA的表达,MTT法检测细胞活力,RT-PCR法检测VSMCs内生物钟基因Bmal1、CLOCK、Per1、Cry1的表达节律。数据使用余弦法拟合,计算昼夜节律参数。结果尼古丁在100 nmol/L浓度刺激48 h,诱导VSMCs增殖效果最好。Bmal1和CLOCK基因的中值相对于对照组下调(P < 0.05和P < 0.01),而Per1和Cry1基因表达的中值上调,CLOCK基因表达振幅相对于对照组下调,而Per1和Cry1的振幅上调,差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01);尼古丁使VSMCs内生物钟基因表达相位后移4~7 h。结论尼古丁在48 h内使VSMCs内生物钟基因表达变化的同时,使VSMCs特异性增殖,产生表型分化。
  • 图 1  VSMCs细胞鉴定与Nicotine促进增殖效果

    图 2  Nicotin对VSMCs细胞内生物钟基因表达节律的影响

    表 1  实验中上下游引物序列

    靶基因 引物 序列 引物长度/bp
    Bmal1
    Forward 3′-5′ GGA CTT CGC CTC TAC CTG TTC A 131
    Reverse 5′-3′ AAC CAT GTG CGA GTG CAG GCG C
    CLOCK
    Forward 3′-5′ GTC TCT CCG TTG GCA TGT CT 139
    Reverse 5′-3′ CCA AGT TCA TGG CGC TCT
    Cry1
    Forward 3′-5′ TCG CCG GCT CTT CCA A 167
    Reverse 5′-3′ TCA AGA CAC TGA AGC AAA AAT CG
    Per1
    Forward 3′-5′ GCC TTC AGA CTC ATG ATG ACA GA 108
    Reverse 5′-3′ TTT GTG TGC CTC AGC TTT GG
    β-Actin
    Forward 3′-5′ CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC 150
    Reverse 5′-3′ TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC
    下载: 导出CSV

    表 2  24h内Nicotine梯度对VSMCs促增殖浓度效应

    分组 OD值 增殖率/%
    对照组 1.19±0.02 0
    Nicotine组
      10 nmol/L 1.36±0.03* 14.80±3.58**
      100 nmol/L 1.66±0.07** 31.19±3.10**
      1000 nmol/L 1.16±0.06** -2.56±3.44**
        F 64.36 74.83
        P < 0.01 < 0.01
        MS组内 0.025 11.421
    下载: 导出CSV

    表 3  Nicotine(100 nmol/L)对VSMCs促增殖的时间效应

    分组 OD值 增殖率/%
    对照组 1.21±0.02 0
    Nicotine组
      24 h 1.49±0.07* 24.61±5.99**
      48 h 1.80±0.05** 51.11±6.24**
      72 h 1.86±0.03** 56.52±5.23**
      F 124.80 25.69
      P < 0.01 < 0.01
      MS组内 0.002 34.06
    与对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 4  生物钟基因表达节律参数(x±s)

    基因表达 对照组(n= 3) 尼古丁刺激组(n= 3) t P
    中值
      Bmal1 1.63±0.07 1.02±0.13 7.16 < 0.01
      CLOCK 1.53±0.07 0.76±0.07 13.47 < 0.01
      Per1 0.65±0.05 1.02±0.11 5.30 < 0.01
      Cry1 0.61±0.06 2.03±0.18 12.96 < 0.01
    振幅
      Bmal1 0.71±0.10 0.52±0.18 1.59 >0.05
      CLOCK 0.65±0.10 0.30±0.10 4.29 < 0.05
      Per1 0.51±0.07 0.81±0.14 3.32 < 0.05
      Cry1 0.54±0.09 0.95±0.24 2.88 < 0.05
    相位/h
      Bmal1 10.58±0.55 17.43±1.33 8.24 < 0.01
      CLOCK 12.22±0.61 16.17±1.26 4.89 < 0.01
      Per1 22.74±0.53 26.03±0.11 10.53 < 0.01
      Cry1 23.38±0.63 26.85±1.03 4.98 < 0.01
    下载: 导出CSV
  • [1] CHEN SY, DING Y, ZHANG Z, et al.Hyperlipidaemia impairs the circadian clock and physiological homeostasis of vascular smooth muscle cells via the suppression of Smarcd1[J].J Pathol, 2014, 233(13):159.
    [2] CHEN LJ, WU XY, FALAK Z, et al.Acrolein-induced apoptosis of smooth muscle cells through NEAT1-Bmal1/Clock pathway and a protection from asparagus extract[J].Environ Pollut, 2019, 258(26):113735.
    [3] LIN CP, TANG X, XU LR, et al.Intracellular high cholesterol content disorders the clock genes, apoptosis-related genes and fibrinolytic-related genes rhythmic expressions in human plaque-derived vascular smooth muscle cells[J].Lipids Health Dis, 2017, 16(3):135.
    [4] LIN CP, TANG X, ZHU Z, et al.The rhythmic expression of clock genes attenuated in human plaque-derived vascular smooth muscle cells[J].Lipids Health Dis, 2014, 13(1):143. doi: 10.1186/1476-511X-13-143
    [5] YOSHIYAMA S, CHEN ZY, OKAGAKI T, et al.Nicotine exposure alters human vascular smooth muscle cell phenotype from a contractile to a synthetic type[J].Atherosclerosis, 2014, 237(31):464.
    [6] GRIGGS CA, MALM SCOTT W, JAIME-FRIAS R, et al.Valproic acid disrupts the oscillatory expression of core circadian rhythm transcription factors[J].Toxicol Appl Pharmacol, 2018, 339(22):110.
    [7] BASATEMUR GL, JØRGENSEN HF, CLARKE MCH, et al.Vascular smooth muscle cells in atherosclerosis[J].Nat Rev Cardiol, 2019, 16(2):727.
    [8] QI YX, HAN Y, JIANG ZL.Mechanobiology and vascular remodeling:from membrane to nucleus[J].Adv Exp Med Biol, 2018, 1097(40):69.
    [9] TAKAHIRO S, KANAE O, TAKANORI I, et al.Suppressive effect of ghrelin on nicotine-induced clock gene expression in the mouse pancreas[J].Endocr J, 2019, 10(4):9.
    [10] FUYUKI S, TSUYOSHI O, AKIRA K, et al.Smad3 suppresses epithelial cell migration and proliferation via the clock gene dec1, which negatively regulates the expression of clock genes Dec2 and Per1[J].Am J Pathol, 2019, 189(11):773.
    [11] ZHOU L, YU YM, SUN SW, et al.Cry 1 Regulates the clock gene network and promotes proliferation and migration via the Akt/P53/P21 pathway in human osteosarcoma cells[J].J Cancer, 2018, 9(3):2480.
    [12] 曲明娟, 徐伟艳, 王晓安, 等.尼古丁对大鼠血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响[J].解剖学报, 2011, 42(2):215. doi: 10.3969/j.issn.0529-1356.2011.02.015
    [13] NONAKA H, EMOTO N, IKEDA K, et al.Angiotensin Ⅱ induces circadian gene expression of clock genes in cultured vascular smooth muscle cells[J].Circulation, 2001, 104(4):1746.
    [14] WANG R, XIAO M, ZHANG Y, et al.RNA-sequencing analysis reveals l-theanine regulating transcriptional rhythm alteration in vascular smooth muscle cells induced by dexamethasone[J].J Agric Food Chem, 2019, 67(19):5413. doi: 10.1021/acs.jafc.8b05057
    [15] LACOLLEY P, REGNAULT V, SEGERS P, et al.Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening:relevance in development, aging, and disease[J].Physiol Rev, 2017, 97(4):1555. doi: 10.1152/physrev.00003.2017
    [16] XIE Z, SU W, LIU S, et al.Smooth-muscle BMAL1 participates in blood pressure circadian rhythm regulation[J].J Clin Invest, 2015, 125(1):324. doi: 10.1172/JCI76881
    [17] WEST AC, SMITH L, RAY DW, et al.Misalignmol/Lent with the external light environmol/Lent drives metabolic and cardiac dysfunction[J].Nat Commun, 2017, 8(1):417. doi: 10.1038/s41467-017-00462-2
    [18] DEPNER CM, MELANSON EL, MCHILL AW, et al.Mistimed food intake and sleep alters 24-hour time-of-day patterns of the human plasma proteome[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2018, 115(23):5390. doi: 10.1073/pnas.1714813115
  • [1] 叶俊荣李格王焱 . 北京市765例机关干部心血管疾病可控危险因素调查. 蚌埠医学院学报, 2014, 39(8): 1097-1099.
    [2] 李斌 . 维持性血液透析患者发生心血管疾病危险因素分析. 蚌埠医学院学报, 2013, 37(8): 967-969.
    [3] 王慧 . 门诊护理管理在糖尿病合并动脉粥样硬化性心血管疾病防治中的应用. 蚌埠医学院学报, 2017, 42(6): 832-834. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2017.06.044
    [4] 张燕常保超王静 . 慢性肾脏病患者血尿酸、C反应蛋白的变化及其对心血管事件的影响. 蚌埠医学院学报, 2012, 36(7): 769-772.
    [5] 唐丽君张晶张明明黄传君丁翠王金婉 . 护理风险管理在心血管科的应用效果. 蚌埠医学院学报, 2015, 40(12): 1745-1746. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2015.12.048
    [6] 徐巧余蓓王静 . 心内科老年患者476例院外护理体会. 蚌埠医学院学报, 2012, 36(11): 1366-1367.
    [7] 程霞孙悝刘晓云陶象男金齐力 . 幽门螺杆菌感染对同型半胱氨酸及血脂的影响探讨. 蚌埠医学院学报, 2019, 44(4): 503-505. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2019.04.024
    [8] 张然蓉龙寿斌李江程琼 . 体检人群高尿酸血症患病情况及影响因素分析. 蚌埠医学院学报, 2016, 41(7): 948-949. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.07.039
    [9] 任永凤王洲陈飞李建张伟丽蒋爱清殷延华刘晓燕 . 床旁超声心动图在急诊心血管疾病中的应用价值. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(5): 510-512.
    [10] 崔桂霞王宇 . 心血管专科护理记录存在问题及对策. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(3): 371-373.
    [11] 赵武丁周志 . 以问题为基础的教学法在儿科心血管系统疾病理论课教学中的应用评价. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(6): 647-649.
    [12] 任凤东范小方任国光杨架林 . 2型糖尿病患者尿微量白蛋白与心血管疾病危险因素的关系. 蚌埠医学院学报, 2006, 31(4): 397-398.
    [13] 张惠洁刘卉芳张晓娜陈凤玲 . 人骨生成诱导因子基因慢病毒载体构建及在人主动脉平滑肌细胞中稳定过表达. 蚌埠医学院学报, 2012, 36(11): 1273-1276.
    [14] 宗巧凤李正红 . 内吗啡肽对心血管系统作用的研究进展. 蚌埠医学院学报, 2016, 41(1): 132-134. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.01.043
    [15] 王继宏 . 心血管神经性晕厥的心率变异性分析. 蚌埠医学院学报, 2015, 40(2): 236-237. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2015.02.034
    [16] 朱晓雷张恒 . 脂联素对心血管系统作用的研究现状. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(4): 424-426.
    [17] 吴宣沈勤肖建军 . 靶控输注瑞芬太尼对全麻苏醒期心血管反应的影响. 蚌埠医学院学报, 2015, 40(4): 464-466. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2015.04.015
    [18] 郑立东李家宽彭晓东 . 三磷腺苷对全身麻醉苏醒拔管期心血管反应的影响. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(1): 52-53,56.
    [19] 邓雪峰 . 三药联合诱导对气管插管心血管反应的预防作用. 蚌埠医学院学报, 2004, 29(3): 254-257.
    [20] 疏树华方才 . 曲马多减轻全麻患者拔管期间心血管反应的临床观察. 蚌埠医学院学报, 2006, 31(2): 140-141.
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-01-30
  • 录用日期:  2020-08-30
  • 刊出日期:  2020-11-15

尼古丁调控血管平滑肌细胞内生物钟基因表达节律的研究

    作者简介: 毕杨(1984-), 女, 主管药师
  • 安徽省芜湖市第一人民医院 药剂科, 241000
基金项目:  中华医学会临床药学分会吴阶平青年基金 LCYX-Q010

摘要: 目的研究尼古丁对原代大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)内生物钟基因表达节律的影响。方法使用贴壁法提取原代VSMCs,免疫荧光法检测VSMCs标志物α-SMA的表达,MTT法检测细胞活力,RT-PCR法检测VSMCs内生物钟基因Bmal1、CLOCK、Per1、Cry1的表达节律。数据使用余弦法拟合,计算昼夜节律参数。结果尼古丁在100 nmol/L浓度刺激48 h,诱导VSMCs增殖效果最好。Bmal1和CLOCK基因的中值相对于对照组下调(P < 0.05和P < 0.01),而Per1和Cry1基因表达的中值上调,CLOCK基因表达振幅相对于对照组下调,而Per1和Cry1的振幅上调,差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01);尼古丁使VSMCs内生物钟基因表达相位后移4~7 h。结论尼古丁在48 h内使VSMCs内生物钟基因表达变化的同时,使VSMCs特异性增殖,产生表型分化。

English Abstract

  • 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的表型分化是众多心血管疾病的病理基础,包括高血压、动脉粥样硬化、肺动脉高压、脑卒中等。生物钟系统是生物为适应地球24 h的光暗循环而进化出来的一种内源性时钟系统,由一系列生物钟基因组成。多种生理状态或者行为如睡眠、免疫系统、心血管系统等均受生物钟系统调控。生物钟结构和功能的改变是导致多种疾病如睡眠呼吸暂停症、非杓型血压的病理学基础。研究[1-2]表明,VSMCs内生物钟基因,例如Bmal1、CLOCK、Per1、Cry1,对血管平滑肌的表型分化具有调控作用, 进而影响疾病的进程。在心血管疾病的高危因素中,高脂血症[1]、高胆固醇[3]等均对VSMCs内生物钟基因表达节律产生抑制作用,进而发展成动脉粥样硬化[4]。烟草中尼古丁是心血管疾病的头号杀手,促进VSMCs细胞表型分化[5],导致不良的心血管事件发生。尼古丁对VSMCs细胞内生物钟基因的表达节律是否有影响尚未见文献报道。因此,本研究提取了原代大鼠主动脉VSMCs细胞,诱导VSMCs细胞表型分化的同时,检测VSMCs细胞内生物钟基因的表达节律,以期对心血管疾病发生发展的病理基础提供理论支持。

    • 胎牛血清(Sigma公司);DMEM高糖培养基(Hyclone公司);四氮唑蓝(MTT)(天根生化科技有限公司);总RNA提取试剂Trizol(碧云天生物科技有限公司);QuantScript RT Kit(天根生化科技有限公司);SuperReal PreMix Plus(天根生化科技有限公司);α-SMA抗体(Abcam公司);引物序列(广州瑞博生物科技有限公司)。尼古丁(Sigma公司)。

    • 取体质量150~200 g左右的SD大鼠,使用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉大鼠,腹主动脉取血处死大鼠,随后放置在75%乙醇中浸泡5 min消毒。切开大鼠胸腔,可见与脊柱并行的主动脉血管,分离主动脉血管,放入预冷的PBS中,洗去主动脉血管表面的血迹。放入新的装满20%胎牛血清培养基的培养皿中。套袖法去除大鼠主动脉外的脂肪组织,用眼科剪沿血管中轴线将血管剪开,镊子轻轻刮血管内壁,除去血管内皮细胞。用镊子缓慢剥离血管中层,剪碎为大小1 mm×1 mm的组织块。均匀铺在T25培养瓶中,加入3~4 mL的20%胎牛血清培养基,倒置于培养箱(37 ℃,5% CO2)中30 min后,缓慢翻正培养瓶,使液体均匀覆盖在培养瓶底部。6~7 d后,VSMCs会从组织块周围爬出,用含EDTA的0.25%胰酶消化细胞传代,使用免疫荧光法对细胞表面标志性蛋白进行鉴定。6~8代细胞进行后续实验。

    • VSMCs传代、生长、融合后,会出现明显的“峰”“谷”现象,从形态学角度被认为是VSMCs特征(见图 1A)。使用免疫荧光法检测VSMCs表面α-SMA蛋白。首先将细胞铺板于96孔板上,使用4%多聚甲醛固定15 min后,PBS洗2遍,每遍3 min;然后加入用PBS配置的0.1% TritonX-100通透20 min;再加入5%胎牛血清封闭1 h。洗去PBS,用PBS按1:200的比例稀释α-SMA一抗孵育过夜;最后加入荧光二抗,湿盒中避光1 h,DAPI染5 min,随即用封片液封闭,在荧光显微镜下拍照合成(见图 1B)。

      图  1  VSMCs细胞鉴定与Nicotine促进增殖效果

    • 细胞90%融合后,消化、铺板于96孔板上,每孔3 000~5 000个细胞,加入梯度尼古丁(10、100、1 000 nmol/L)刺激,在24 h时间内检测细胞活力,确定尼古丁最佳给药剂量。确定剂量后,使用最佳剂量尼古丁分别刺激细胞24、48、72 h,使用MTT法检测细胞活力。在96孔中加入5 mg/L的MTT,在37 ℃孵育4 h,缓慢吸尽上层培养基后,加入150 μL的DMSO溶液,轻轻震荡15 min,使用酶标仪在单波长490 nm处检测各孔吸光度,计算增殖率。增殖率=(QD实验组-OD对照组)/(OD对照组-OD空白组)×100%

    • VSMCs于清晨8:00开始,用50%的胎牛血清授时2 h,授予细胞节律性,此时记为ZT 0[1]。然后洗去胎牛血清,加入尼古丁100 nmol/L,在28 h内每隔4 h提取一次样本。使用总RNA提取试剂Trizol提取细胞内RNA含量,使用Quant cDNA第一链合成试剂盒,按照说明书步骤按两步法将提取出的RNA逆转录cDNA。在2 μL的cDNA中加入0.25 μmol的上下游引物以及5 μL的荧光染料2×SuperReal PreMix Plus,预变性后在95 ℃中10 s,62 ℃中30 s循环40次,用所得数据Cq值,用2-△△Cq法进行相对定量分析。引物序列见表 1

      靶基因 引物 序列 引物长度/bp
      Bmal1
      Forward 3′-5′ GGA CTT CGC CTC TAC CTG TTC A 131
      Reverse 5′-3′ AAC CAT GTG CGA GTG CAG GCG C
      CLOCK
      Forward 3′-5′ GTC TCT CCG TTG GCA TGT CT 139
      Reverse 5′-3′ CCA AGT TCA TGG CGC TCT
      Cry1
      Forward 3′-5′ TCG CCG GCT CTT CCA A 167
      Reverse 5′-3′ TCA AGA CAC TGA AGC AAA AAT CG
      Per1
      Forward 3′-5′ GCC TTC AGA CTC ATG ATG ACA GA 108
      Reverse 5′-3′ TTT GTG TGC CTC AGC TTT GG
      β-Actin
      Forward 3′-5′ CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC 150
      Reverse 5′-3′ TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC

      表 1  实验中上下游引物序列

    • 采用方差分析、q检验和t检验。28 h内PCR实验所得的Cq值, 使用余弦法拟合。使用Graphpad prism软件将各组数据使用下列公式拟合:Y=Amplitude ×cos[(0.2618×(X-Phase)]+ Mesor。中值(Mesor)为24 h余弦曲线的均值,振幅(Amplitude)为24 h内余弦曲线最高值及最低值与中值的差值,相位(Phase)为24 h内余弦曲线的最高值所在的时间点[6]

    • 使用梯度的尼古丁刺激VSMCs 24 h发现,当尼古丁浓度为100 nmol/L时刺激效果最好,增殖率可达25 %左右,且与对照组相比,差异均有统计学意义(P < 0.05)(见表 23)。随后用100 nmol/L尼古丁分别刺激24、48、72 h发现,在48 h时间点效果最好,增殖率可达50 %左右,与对照组相比,差异有统计学意义(P < 0.01)。

      分组 OD值 增殖率/%
      对照组 1.19±0.02 0
      Nicotine组
        10 nmol/L 1.36±0.03* 14.80±3.58**
        100 nmol/L 1.66±0.07** 31.19±3.10**
        1000 nmol/L 1.16±0.06** -2.56±3.44**
          F 64.36 74.83
          P < 0.01 < 0.01
          MS组内 0.025 11.421

      表 2  24h内Nicotine梯度对VSMCs促增殖浓度效应

      分组 OD值 增殖率/%
      对照组 1.21±0.02 0
      Nicotine组
        24 h 1.49±0.07* 24.61±5.99**
        48 h 1.80±0.05** 51.11±6.24**
        72 h 1.86±0.03** 56.52±5.23**
        F 124.80 25.69
        P < 0.01 < 0.01
        MS组内 0.002 34.06
      与对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01

      表 3  Nicotine(100 nmol/L)对VSMCs促增殖的时间效应

    • VSMCs加入尼古丁(100 nmol/L)刺激后,其细胞内生物钟基因表达节律明显改变。Bmal1和CLOCK基因的中值相对于对照组下调,Per1和Cry1基因表达上调,CLOCK基因表达相对于对照组下调,而Per1和Cry1上调,差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01),尼古丁使VSMCs内生物钟基因表达相位后移4~7 h(见图 2表 4)。

      图  2  Nicotin对VSMCs细胞内生物钟基因表达节律的影响

      基因表达 对照组(n= 3) 尼古丁刺激组(n= 3) t P
      中值
        Bmal1 1.63±0.07 1.02±0.13 7.16 < 0.01
        CLOCK 1.53±0.07 0.76±0.07 13.47 < 0.01
        Per1 0.65±0.05 1.02±0.11 5.30 < 0.01
        Cry1 0.61±0.06 2.03±0.18 12.96 < 0.01
      振幅
        Bmal1 0.71±0.10 0.52±0.18 1.59 >0.05
        CLOCK 0.65±0.10 0.30±0.10 4.29 < 0.05
        Per1 0.51±0.07 0.81±0.14 3.32 < 0.05
        Cry1 0.54±0.09 0.95±0.24 2.88 < 0.05
      相位/h
        Bmal1 10.58±0.55 17.43±1.33 8.24 < 0.01
        CLOCK 12.22±0.61 16.17±1.26 4.89 < 0.01
        Per1 22.74±0.53 26.03±0.11 10.53 < 0.01
        Cry1 23.38±0.63 26.85±1.03 4.98 < 0.01

      表 4  生物钟基因表达节律参数(x±s)

    • 当内皮细胞受损,VSMCs暴露在血浆营养因子下,获得了分化的能力,由静止的、收缩的状态发展成增殖的、分化的状态,称之为表型分化。研究[7-8]表明,VSMCs表型分化导致的血管壁增厚以及血管重构是众多心血管疾病的病理基础。因此,研究如何调控VSMCs表型分化一直是心血管领域研究热点。生物钟基因被报道可以调控血管平滑肌的表型分化,同时尼古丁作为心血管疾病的重要风险因素之一,是否通过调控生物钟基因的表达节律,进而影响VSMCs功能,从而导致心血管疾病的发生发展,尚未见文献报道。因此,本文提取了原代大鼠主动脉VSMCs,发现尼古丁在48 h内诱导细胞增殖的同时,对VSMCs内生物钟系统具有明显的调控作用,本文研究的结果将加深对VSMCs所致的心血管疾病的认识。

      吸烟可以导致高血压、脑血栓和动脉粥样硬化等多种心血管疾病的发生,尼古丁是烟草的主要成分,且已被证实可以改变多种血管壁相关细胞的功能,造成内皮细胞损伤、VSMCs增殖等。现有研究中,多种因素包括高脂血症[1]、高胆固醇[3]、棕榈酸[6]均使生物钟基因表达节律的中值下调,造成细胞内生物钟系统的紊乱。在其他细胞系中,尼古丁可以显著抑制多种生物钟基因的表达[9],但是该研究未在连续的时间变量下监测生物钟基因的表达。本研究中,100 nmol/L的尼古丁在48 h内引起VSMCs的增殖的同时,Bmal1和CLOCK基因的中值相对于对照组显著下调。不同于以上研究,Per1、Cry1基因的表达节律的中值明显上调。这可能是因为在生物钟反馈环路中,Per1、Cry1基因的表达上调会明显抑制Bmal1和CLOCK基因,使Bmal1和CLOCK基因的表达下调,呈现动态的周期性反应,而Per1、Cry1基因表达上调参与细胞的生长[10-11]。因此可以推测,虽然尼古丁使Bmal1和CLOCK基因表达中值下调,但是并没有破坏细胞内部的生物钟反馈环路,使Per1、Cry1基因的表达中值上调的同时促进细胞增殖。这可能由于所使用的尼古丁的浓度较小,研究[12]表明,在大剂量100 μmol/L时,尼古丁可以使VSMCs产生明显的细胞凋亡。但是在这种条件下,对VSMCs内生物钟基因表达的影响尚不可知,需要未来实验的进一步验证。

      振幅体现细胞节律的波动情况。研究表明,血管紧张素Ⅱ[13]、氨茶碱[14]均能引起VSMCs内生物钟基因表达振幅的上调,表明氨茶碱引起的生物钟基因振幅表达上调可以预防心血管疾病的发生发展。在本研究中,虽然Per1、Cry1基因表达振幅上调,但是致使Bmal1和CLOCK基因的表达振幅下调,Bmal1和CLOCK作为调控细胞昼夜节律的核心基因,振幅的下调意味着细胞的衰老[15]以及伸缩性[16]的下降, 从而造成不良的心血管疾病。另一方面,尼古丁可以使VSMCs生物钟基因的表达相位显著后移4~7 h。现有研究中,不规律光照以及不规律饮食可以使生物钟基因表达产生明显的相位后移,其结果是与环境信号的昼夜节律不匹配,称为昼夜节律失调[17-18]。而昼夜节律失调是心血管疾病的重要风险因素。因此,本研究中VSMCs生物钟基因的表达相位显著后移,增加了心血管疾病风险,为尼古丁致心血管风险提供了生物节律方面的证据。

      综上所述,尼古丁在48 h内,使VSMCs内生物钟基因Bmal1和CLOCK的表达节律中值、振幅显著下调;Per1和Cry1基因表达节律中值与振幅明显上调,同时使VSMCs内生物钟基因表达相位后约4~7 h,从而使VSMCs特异性增殖,进而可能引发不良的心血管疾病。本文研究的结果加深了对尼古丁使VSMCs表型分化,继而所致心血管疾病的认识。

参考文献 (18)

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