-
结肠癌是消化系统中最为常见的恶性肿瘤之一，在我国结肠癌的发病率位于恶性肿瘤的第3位，严重威胁人类的健康[1]。研究[2]证实，长链非编码RNA(long chain non-coding RNA，lncRNA)参与组织的癌变、转移、细胞的增殖等过程。lncRNA牛磺酸上调基因1(TUG1)在多种肿瘤中高表达，并促进肿瘤的增殖、侵袭和转移[3]。lncRNA与miRNA均属于非编码RNA，它们在癌症发生发展中的作用已得到普遍认可[4]。miRNA-145具有阻止细胞癌变和抑制癌细胞生长等作用，miRNA-145表达的变化对肿瘤的发生、增殖、侵袭、凋亡等均有一定影响，有研究[5]发现，增强miRNA-145表达则可降低HCT116细胞增殖、侵袭活性和增加肿瘤细胞凋亡。但目前TUG1对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响以及是否与靶向miRNA-145有关，尚未见报道。因此，本研究探讨lncRNA TUG1和miRNA-145对结肠癌HCT116细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并探讨其潜在的作用机制。
-
人结肠癌细胞HCT116及人正常结肠黏膜上皮细胞株NCM460(购自美国ATCC)、胎牛血清(美国Gibco公司)、TRIzol、miRNA-145、U6引物(美国Invitrogen公司)、TUG1、GAPDH普通PCR上下游引物(上海生工公司)、SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)、DEPC(美国Sigma)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美国Thermo Scientific)、MTT试剂(北京索莱宝生物科技有限公司)、结晶紫染色液(北京华越洋生物科技有限公司)、荧光素酶活性检测试剂盒(美国GeneCopoeia公司)。
-
将细胞加入含体积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37 ℃，体积分数为5% CO2培养箱培养。
-
根据处理方法不同将结肠癌细胞HCT116分为6组，分为TUG1 siRNA阴性对照组(si-con组)、TUG1 siRNA组、miRNA-145阴性对照组(miRNA NC组)、miRNA-145 mimic组、si-TUG1+miRNA NC组和TUG1 siRNA+miRNA-145 inhibitor组。si-con组：细胞转染TUG1 siRNA阴性对照；TUG1 siRNA组：细胞转染TUG1 siRNA；miRNA-145阴性对照组(miRNA NC组)：细胞转染miRNA-145阴性对照；miRNA-145 mimic组：细胞转染miRNA-145模拟物；si-TUG1+miRNA NC组：细胞共转染TUG1 siRNA和miRNA-145阴性对照；TUG1 siRNA+miRNA-145 inhibitor组：细胞共转染TUG1 siRNA和miRNA-145抑制剂。分别于转染后收集各组细胞进行后续实验。
-
Trizol法提取细胞总RNA，逆转录获得cDNA，TUG1以GAPDH为内参，miRNA-145以U6为内参，采用qRT-PCR检测各组细胞TUG1基因及miRNA-145的表达水平。qRT-PCR反应体系和反应程序参照说明书。每组TUG1及miRNA-145基因的相对表达量按2-△△Ct法计算(见表 1)。
基因 引物序列(5′-3′) TUG1上游 TAG CAG TTC CCC AAT CCT TG TUG1下游 CAC AAA TTC CCA TCA TTC CC miRNA-145上游 GTC CAG TTT TCC CAG GAA TCC CT miRNA-145下游 GCT GTC AAC GAT ACG CTA CCT A GAPDH上游 TGG CAC CCA GCA CAA TGA A GAPDH下游 CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A U6上游 CTC GCT TCG GCA GCA CAT ATA CT U6下游 ACG CTT CAC GAA TTT GCG TGT C 表 1 qRT-PCR引物序列
-
将荧光素酶报告载体TUG1-野生型(WT)、TUG1-突变型(MUT)分别与miRNA-145 mimics、miRNA-NC用脂质体法转染HCT116细胞，培养5 h后，更换新鲜培养液继续培养，转染48 h。按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作步骤进行操作。结果以海参荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度的比值反映miRNA-145与TUG1的结合力。
-
细胞转染24 h后，以1×104个/孔的比例接种到96孔板中，然后培养48 h后每孔加入10 μL浓度为5% MTT试剂，正常培养4~6 h后将培养孔中上清液吸除，每孔加入100 μL二甲基亚砜，自由光照10 min。用酶标仪检测490 nm处的吸光度。实验重复3次。
-
将各组细胞培养于6孔板中，等细胞融合后用200 μL高压灭菌枪头在孔内轻轻划1~3道痕，划痕后和24 h在显微镜下观察细胞划痕修复情况，显微镜观察并统计划痕的间隙距离。
-
将过夜水化的Matrigel基质胶按1:4比例稀释，取40 μL加入预冷的Transwell小室，置于37℃培养30 min。用无血清培养基将细胞重悬至5×105/mL，取200 μL细胞悬液加入上室，下室加入含20%胎牛血清的1640培养基700 μL，于37 ℃培养24 h。将膜下面的细胞与1%多聚甲醛混合，用体积分数为0.2%结晶紫溶液染色15 min。用显微镜计数进入膜下的细胞数，随机取10个视野，计算平均值。实验重复3次。
-
采用t检验、方差分析和q检验。
-
与人正常结肠黏膜上皮细胞株NCM460相比，结肠癌细胞株HCT116中TUG1相对表达水平均明显升高(P＜0.01)，miRNA-145相对表达水平均明显降低(P＜0.01)(见表 2)。
分组 TUG1 miRNA-145 NCM460组 1.00±0.05 1.00±0.09 HCT116组 2.39±0.16 0.40±0.07 t 14.71 9.34 P ＜0.01 ＜0.01 表 2 HCT116细胞中TUG1及miRNA-145表达水平(x±s; n=3)
-
运用miRcode数据库预测到miRNA-145与TUG1 3′-UTR存在结合位点(见图 1)；双荧光素酶活性检测结果显示，与miRNA NC组相比，miRNA-145组wt-TUG1细胞中荧光素酶活性降低(P＜0.05)，mut-TUG1细胞中荧光素酶活性不受影响(P＞0.05)(见表 3)。
分组 wt-TUG1 mut-TUG1 miRNA NC组 0.99±0.09 0.95±0.07 miRNA-145组 0.64±0.13 0.98±0.04 t 3.83 0.64 P ＜0.05 >0.05 表 3 双荧光素酶报告实验(x±s; ni=3)
-
与si-con组相比，TUG1 siRNA组HCT116细胞中TUG1表达水平明显降低(P < 0.01)，HCT116细胞增殖活性降低(P < 0.05)，细胞划痕相对宽度明显增宽，细胞侵袭数明显减少(P＜0.01)(见表 4)。
分组 TUG1 细胞活性/OD 细胞侵袭数/个 划痕相对宽度 si-con组 1.10±0.06 0.85±0.12 131.00±14.53 0.24±0.03 TUG1 siRNA组 0.39±0.08 0.56±0.09 61.33±7.51 0.56±0.04 t 12.30 3.35 7.38 11.56 P ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 表 4 抑制TUG1的表达对HCT116细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响(x±s；ni=3)
-
与miRNA NC组相比，miRNA-145 mimic组HCT116细胞中miRNA-145表达水平明显升高(P < 0.01)，HCT116细胞增殖活性降低(P < 0.05)，细胞划痕相对宽度明显增宽，细胞侵袭数明显减少(P＜0.01)(见表 5)。
分组 miRNA-145 细胞活性/OD 细胞侵袭数/个 划痕相对宽度 miRNA NC组 0.96±0.16 0.74±0.10 153.67±16.04 0.21±0.02 miRNA-145 mimic组 3.47±0.32 0.49±0.08 64.00±11.14 0.56±0.04 t 12.15 3.38 7.95 12.59 P ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 表 5 过表达miRNA-145对HCT116细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响(x±s；ni=3)
-
与si-con组相比，TUG1 siRNA组HCT116细胞中miRNA-145表达水平升高(P＜0.05)；与si-TUG1+miRNA NC组相比，TUG1 siRNA+miRNA-145 inhibitor组HCT116细胞中miRNA-145表达水平降低(P＜0.05)；HCT116细胞增殖活性增强，细胞划痕相对宽度减小，细胞侵袭数目增加(P＜0.05)(见表 6)。
分组 miRNA-145 细胞活性/OD 细胞侵袭数/个 划痕相对宽度 si-con组 0.88±0.05 0.85±0.12 147.33±19.60 0.19±0.02 TUG1 siRNA组 4.78±0.09* 0.56±0.09* 52.00±12.77* 0.58±0.04* si-TUG1+miRNA NC组 4.86±0.13* 0.52±0.10* 55.67±12.01* 0.63±0.06* TUG1 siRNA+miRNA-145 inhibitor组 2.17±0.10#▲ 0.77±0.11#▲ 86.33±11.24#▲ 0.32±0.04#▲ F 1247 6.90 54.08 293.40 P ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 0.009 0.011 0.003 0.001 q检验：与si-con组比较*P＜0.05；与TUG1 siRNA组比较#P＜0.05；与si-TUG1+miRNA NC组比较▲P < 0.05 表 6 各组HCT116细胞miRNA-145表达水平及增殖、侵袭、迁移能力的比较(x±s; n=3)
-
TUG1已被证明与多种肿瘤的发生发展密切相关，其在大部分恶性肿瘤中呈异常上调表达，发挥促癌因子的作用[6]。有研究[7]发现，TUG1在多种卵巢癌细胞系中高表达，干扰TUG1表达后卵巢癌细胞增殖和迁移能力显著下降，其机制可能与干扰TUG1表达后细胞能量代谢下降有关。另有研究[8]发现，TUG1可以通过EMT途径提高胰腺癌细胞的增殖和迁移能力。本实验研究结果发现，与人正常结肠黏膜上皮细胞株NCM460相比，结肠癌细胞株HCT116中TUG1相对表达水平均明显升高；与si-con组相比，TUG1 siRNA组HCT116细胞中TUG1表达水平显著降低；HCT116细胞增殖活性降低，划痕相对宽度显著增加，细胞侵袭数目明显减少，提示抑制TUG1的表达可抑制HCT116细胞增殖水平及迁移、侵袭能力。
miRNA在肿瘤进展中发挥重要作用，有研究[9]表明，miRNA-145低表达可能与卵巢癌的发生、发展有关，过表达miRNA-145能够抑制卵巢癌细胞株的增殖、迁移和侵袭。另有研究[10]发现，过表达miRNA-145能够降低肺癌细胞系A549的迁移、侵袭的能力，miRNA-145可能成为未来肺癌生物治疗的新靶点。本研究对比人正常结肠黏膜上皮细胞株NCM460与结肠癌细胞株HCT116，结果发现HCT116细胞中miRNA-145相对表达水平明显降低；过表达miRNA-145后，与miRNA NC组相比，miRNA-145 mimic组HCT116细胞中miRNA-145表达水平显著升高；HCT116细胞增殖活性降低，划痕相对宽度显著增加，细胞侵袭数目明显减少，提示过表达miRNA-145可抑制HCT116细胞增殖水平及迁移、侵袭能力。
lncRNA可以通过与靶基因mRNA竞争性结合miRNA的应答元件，从而抑制miRNA的表达，间接增高靶基因的表达水平[11]。有研究[12]发现，结肠癌细胞中lncRNA FoxD2-AS1表达上调，miR-324-5p表达下调，FoxD2-AS1通过靶向负调控miR-324-5p的表达抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。另有研究[13]发现，HOTAIR与miR-101直接相互作用，miR-101可以直接与lncRNA HOTAIR结合位点结合并影响荧光素酶活性，lncRNA HOTAIR通过调控miR-101的表达促进食管癌细胞的恶性生物学行为的发生。本研究采用双荧光素酶活性检测TUG1与miRNA-145的靶向关系，结果显示miRNA-145与TUG1 3′-UTR存在结合位点，与si-con组相比，TUG1 siRNA组HCT116细胞中miRNA-145表达水平升高；在HCT116细胞中沉默TUG1表达并抑制miRNA-145表达后，结果发现，与si-TUG1+miRNA NC组相比，TUG1 siRNA+miRNA-145 inhibitor组HCT116细胞中miRNA-145表达水平降低；HCT116细胞增殖活性增强, 划痕相对宽度减小, 细胞侵袭数目增加，提示TUG1对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用可能是通过靶向抑制miRNA-145的表达实现的。
综上所述，结肠癌HCT116细胞中TUG1表达上调，miRNA-145表达下调，干扰TUG1表达可通过靶向上调miRNA-145的表达，抑制结肠癌HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭，为TUG1和miRNA-145在结肠癌诊断、治疗及预后提供了实验依据。
lncRNA TUG1调控miRNA-145促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭
Effect of lncRNA TUG1 regulating miRNA-145 expression on the proliferation, migration and invasion of colon cancer cells
-
摘要:
目的探讨lncRNA TUG1调控miRNA-145促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。 方法选择人结肠癌细胞HCT116，并将细胞分为6组，培养48 h后进行后续实验；采用qRT-PCR法检测各组细胞TUG1与miRNA-145的表达水平；采用MTT检测各组细胞的增殖情况；采用划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力；采用双荧光素酶报告基因实验验证TUG1与miRNA-145的靶向关系。 结果与人正常结肠黏膜上皮细胞株NCM460相比，结肠癌细胞株HCT116中TUG1相对表达水平明显升高，miRNA-145相对表达水平明显降低（P < 0.01）；miRNA-145与TUG1 3'-UTR存在结合位点。与TUG1 siRNA阴性对照组相比，TUG1 siRNA组HCT116细胞中TUG1表达水平明显降低（P < 0.01），HCT116细胞增殖活性降低（P < 0.05），细胞划痕相对宽度明显增加，细胞侵袭数目明显减少（P < 0.05）；与miRNA NC组相比，miRNA-145 mimic组HCT116细胞中miRNA-145表达水平明显升高，HCT116细胞增殖活性降低（P < 0.05），细胞划痕相对宽度明显增加，细胞侵袭数目明显减少（P < 0.01）；与TUG1 siRNA阴性对照组相比，TUG1 siRNA组HCT116细胞中miRNA-145表达水平升高（P < 0.05）；与si-TUG1+miRNA NC组相比，TUG1 siRNA+miRNA-145 inhibitor组HCT116细胞中miRNA-145表达水平降低（P < 0.05），HCT116细胞增殖活性增强，细胞划痕相对宽度减小，细胞侵袭数目增加（P < 0.05）。 结论结肠癌HCT116细胞中TUG1表达上调，miRNA-145表达下调，干扰TUG1表达可通过靶向上调miRNA-145的表达，抑制结肠癌HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭。 Abstract:ObjectiveTo explore the effects of lincRNA TUG1 regulating miRNA-145 on the proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. MethodsHuman colon cancer cell line HCT116 was divided into 6 groups, and cultured for 48 h.The expression levels of TUG1 and miRNA-145 in each group were detected using qRT-PCR.The proliferation of cells was detected using MTT assay, and the ability of cell migration and invasion were detected using scratch test and Transwell invasion test.The targeting relationship between TUG1 and miRNA-145 was verified by dual-luciferase reporter gene assay. ResultsCompared with human normal colonic mucosal epithelial cell line NCM460, the relative expression level of TUG1 in colon cancer cell line HCT116 significantly increased, while the relative expression level of miRNA-145 significantly decreased(P < 0.01).There were binding sites for miRNA-145 and TUG1 3'-UTR.Compared with the si-con group, the TUG1 expression level and proliferation activity of HCT116 cells in the TUG1 siRNA group significantly decreased, the relative width of cell scratch significantly increased, and the number of invaded cells significantly decreased(P < 0.05).Compared with the miRNA NC group, the miRNA-145 expression level in the miRNA-145 mimic group significantly increased, the proliferation activity of HCT116 cells significantly decreased, the relative width of cell scratch significantly increased, and the number of invaded cells significantly decreased(P < 0.05).Compared with the SI-CON group, the expression level of miRNA-145 in TUG1 siRNA group significantly increased(P < 0.05).Compared with the si-TUG1+miRNA NC group, the expression level of miRNA-145 in the TUG1 siRNA+ mirNA-145 inhibitor group significantly reduced(P < 0.05), the proliferation activity of HCT116 cells significantly enhanced, the relative width of cell scratche significantly reduced, and the number of invaded cell significantly increased(P < 0.05). ConclusionsThe expression level of TUG1 is up-regulated and the expression level of miRNA-145 is down-regulated in colon cancer HCT116 cells.Interfering with the expression of TUG1 can inhibit the proliferation, migration and invasion of colon cancer HCT116 cells by targeting up-regulation of miRNA-145 expression. -
Key words:
- colon neoplasms /
- proliferation /
- migration /
- invasion /
- long chain non-coding RNA TUG1 /
- miRNA-145
-
表 1 qRT-PCR引物序列
基因 引物序列(5′-3′) TUG1上游 TAG CAG TTC CCC AAT CCT TG TUG1下游 CAC AAA TTC CCA TCA TTC CC miRNA-145上游 GTC CAG TTT TCC CAG GAA TCC CT miRNA-145下游 GCT GTC AAC GAT ACG CTA CCT A GAPDH上游 TGG CAC CCA GCA CAA TGA A GAPDH下游 CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A U6上游 CTC GCT TCG GCA GCA CAT ATA CT U6下游 ACG CTT CAC GAA TTT GCG TGT C 
下载: 导出CSV
表 2 HCT116细胞中TUG1及miRNA-145表达水平(x±s; n=3)
分组 TUG1 miRNA-145 NCM460组 1.00±0.05 1.00±0.09 HCT116组 2.39±0.16 0.40±0.07 t 14.71 9.34 P ＜0.01 ＜0.01
下载: 导出CSV
表 3 双荧光素酶报告实验(x±s; ni=3)
分组 wt-TUG1 mut-TUG1 miRNA NC组 0.99±0.09 0.95±0.07 miRNA-145组 0.64±0.13 0.98±0.04 t 3.83 0.64 P ＜0.05 >0.05
下载: 导出CSV
表 4 抑制TUG1的表达对HCT116细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响(x±s；ni=3)
分组 TUG1 细胞活性/OD 细胞侵袭数/个 划痕相对宽度 si-con组 1.10±0.06 0.85±0.12 131.00±14.53 0.24±0.03 TUG1 siRNA组 0.39±0.08 0.56±0.09 61.33±7.51 0.56±0.04 t 12.30 3.35 7.38 11.56 P ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01
下载: 导出CSV
表 5 过表达miRNA-145对HCT116细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响(x±s；ni=3)
分组 miRNA-145 细胞活性/OD 细胞侵袭数/个 划痕相对宽度 miRNA NC组 0.96±0.16 0.74±0.10 153.67±16.04 0.21±0.02 miRNA-145 mimic组 3.47±0.32 0.49±0.08 64.00±11.14 0.56±0.04 t 12.15 3.38 7.95 12.59 P ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01
下载: 导出CSV
表 6 各组HCT116细胞miRNA-145表达水平及增殖、侵袭、迁移能力的比较(x±s; n=3)
分组 miRNA-145 细胞活性/OD 细胞侵袭数/个 划痕相对宽度 si-con组 0.88±0.05 0.85±0.12 147.33±19.60 0.19±0.02 TUG1 siRNA组 4.78±0.09* 0.56±0.09* 52.00±12.77* 0.58±0.04* si-TUG1+miRNA NC组 4.86±0.13* 0.52±0.10* 55.67±12.01* 0.63±0.06* TUG1 siRNA+miRNA-145 inhibitor组 2.17±0.10#▲ 0.77±0.11#▲ 86.33±11.24#▲ 0.32±0.04#▲ F 1247 6.90 54.08 293.40 P ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 0.009 0.011 0.003 0.001 q检验：与si-con组比较*P＜0.05；与TUG1 siRNA组比较#P＜0.05；与si-TUG1+miRNA NC组比较▲P < 0.05
下载: 导出CSV
-
[1] 程钧, 李汛.微小RNA对结肠癌调控机制的研究进展[J].西部医学, 2018, 30(1):154. [2] 李孝敏, 赵浩亮, 马鹏, 等.lncRNA GAS5通过下调miR-223的表达提高结肠癌细胞的放射敏感性[J].中华放射医学与防护杂志, 2018, 38(10):734. [3] 张桓瑜, 张虹, 姜忠, 等.长链非编码RNA牛磺酸上调基因1对人神经母细胞瘤侵袭和转移能力的影响[J].中华实验外科杂志, 2018, 35(12):2284. [4] 胡春艳, 朱根海, 邢艾文, 等.LncRNA LUCAT1通过靶向miR-199a-5p调控宫颈癌细胞活性、侵袭迁移及其分子机制[J].中国老年学杂志, 2019, 39(7):3257. [5] 祝磊, 李炳强, 陈晨.miRNA-145对结肠癌细胞体外增殖、侵袭、凋亡的影响[J].中国免疫学杂志, 2019, 35(5):575. [6] 姜兴明, 王志东, 李景林, 等.牛磺酸上调基因1对肿瘤发生发展的调控作用[J].中国病理生理杂志, 2017, 33(7):1332. [7] 徐苏娟, 付子毅, 刘丝雨, 等.lncRNA TUG1对卵巢癌细胞OVCAR3的增殖迁移及能量代谢的影响[J].临床肿瘤学杂志, 2019, 24(1):26. [8] QIN CF, ZHAO FL.Long non-coding RNA TUG1 can promote proliferation and migration of pancreatic cancer via EMT pathway[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2017, 21(10):2377. [9] 陈梅.miRNA-145在卵巢癌组织中的表达及其对增殖、迁移与侵袭的影响[J].肿瘤学杂志, 2019, 25(7):607. [10] 徐驰, 汪栋, 苏长青, 等.miRNA-145抑制肺癌细胞系A549迁移侵袭的研究[J].肿瘤学杂志, 2015, 21(9):742. [11] 马超群, 张岩.miRNA及lncRNA在胃癌中作用机制的研究进展[J].实用检验医师杂志, 2017, 9(4):246. [12] 彭科瑜, 岳芙蓉, 张力.LncRNA FoxD2-AS1靶向miR-324-5p对结肠癌SW480细胞增殖和迁移侵袭的影响[J].临床和实验医学杂志, 2019, 18(16):1724. [13] 毛广显, 鲁建军, 刘继先.长链非编码RNA HOX转录反义RNA通过影响微小RNA-101的表达影响食管癌细胞的生物学行为[J].中华实验外科杂志, 2018, 35(12):2286. -
