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雷公藤甲素对IgA肾病大鼠的肾保护作用及对NLRP3炎症小体的影响

周慧 曲颂扬 田立东

引用本文:
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雷公藤甲素对IgA肾病大鼠的肾保护作用及对NLRP3炎症小体的影响

    作者简介: 周慧(1980-), 女, 主管药师
    通讯作者: 田立东, tldlnzy@163.com
  • 基金项目:

    国家中医药管理局课题资助项目 SATCM-2015-BZ(283)

  • 中图分类号: R285.5

Effect of Triptolide on renal protection and NLRP3 inflammatome in IgA nephropathy rats

    Corresponding author: TIAN Li-dong, tldlnzy@163.com
  • CLC number: R285.5

  • 摘要: 目的探讨雷公藤甲素对IgA肾病(IgAN)大鼠的肾保护作用及其与NLRP3炎症小体的关系。方法40只SPF级SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组和雷公藤甲素低、高剂量组。采用口服牛γ-球蛋白(BGG)8周及尾静脉注射BGG方法建立IgAN大鼠模型。于造模完成后灌胃给予低、高剂量雷公藤甲素治疗8周。观察大鼠血清中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及24 h尿蛋白(24 h TUP)水平;血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-17A、γ干扰素(IFN-γ)及IL-4水平;肾组织中IgA沉积情况;肾脏中IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3的表达情况。结果与模型组相比,雷公藤甲素组血清Scr、BUN及尿液中24 h TUP含量明显降低(P < 0.05~P < 0.01);雷公藤甲素能降低血清中TNF-α、IL-17A、IFN-γ和L-4水平(P < 0.05~P < 0.01),减轻IgA的沉积(P < 0.01),抑制IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3的表达(P < 0.05~P < 0.01)。结论雷公藤甲素对IgA肾病大鼠肾脏具有保护作用,其作用机制可能是通过抑制NLRP3炎症小体的激活,进而抑制炎症反应。
  • 图 1  雷公藤甲素对IgA大鼠模型肾组织IgA沉积的影响

    图 2  各组大鼠肾组织中IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白电泳图

    表 1  生化指标及24 h UTP含量变化的比较(x±sni=10)

    指标 对照组 模型组 低剂量组 高剂量组 F P MS组内
    BUN/(mmol/L) 3.91±0.53 19.87±2.99** 12.37±2.65 11.52±2.01△△ 20.21 < 0.01 0.003
    Scr/(μmol/L) 41.02±3.58 66.83±11.02* 45.76±5.68 41.59±10.03 6.48 < 0.05 3.622
    TP/(g/L) 59.03±8.22 60.52±10.57 59.63±7.86 63.19±10.28 0.12 >0.05 0.004
    ALT/(U/L) 39.98±6.35 43.17±4.97 45.91±6.04 42.81±3.72 0.61 >0.05 0.005
    AST/(U/L) 88.04±10.85 91.48±10.35 87.59±9.28 85.64±7.96 0.19 >0.05 0.008
    24 h UTP/(mg/24 h) 1.98±0.14 46.92±9.95** 29.91±5.69△△ 24.68±3.73△△ 28.40 < 0.01 8.368
    与对照组比较* P < 0.05,**P < 0.01;与模型组比较△P < 0.05,△△P < 0.01
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    表 2  肾组织中炎症因子水平的比较(x±sni=10)

    指标 对照组 模型组 低剂量组 高剂量组 F P MS组内
    TNF-α/(ng/mL) 101.76±20.01 291.33±49.60** 199.62±25.54 168.68±21.05△△ 19.05 < 0.01 2.523
    IL-17A/(ng/mL) 7.58±1.45 28.04±4.50* 16.12±4.58 13.16±3.25 14.58 < 0.05 0.062
    IFN-γ/(ng/mL) 8.43±3.00 19.26±12.98** 12.51±3.20 11.77±4.65 4.75 < 0.05 4.732
    IL-4/(ng/mL) 3.63±0.61 11.20±1.31** 6.33±0.64△△ 5.83±1.12△△ 32.74 < 0.01 5.019
    IgA相对荧光强度 100±21.54 280.73±42.39** 171.69±41.02△△ 165.07±32.52△△ 13.64 < 0.01 0.000
    与对照组比较* P < 0.05,**P < 0.01;与模型组比较△P < 0.05,△△P < 0.01
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    表 3  肾组织中IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的相对表达(x±sni=10)

    蛋白指标 对照组 模型组 低剂量组 高剂量组 F P MS组内
    IL-1β 1.00±0.36 1.97±0.50* 1.32±0.21 1.36±0.15△△ 4.47 < 0.05 0.003
    Caspase-1 1.00±0.19 2.91±0.33** 1.99±0.38△△ 1.83±1.23△△ 22.35 < 0.01 0.008
    IL-18 1.00±0.17 2.32±0.12** 1.71±0.13△△ 1.76±1.13△△ 41.95 < 0.01 0.187
    NLRP3 1.00±0.21 2.53±0.55** 1.90±0.29△△ 1.76±0.28△△ 9.24 < 0.01 1.732
    与对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与模型组比较△P < 0.05,△△P < 0.01
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-04-02
  • 录用日期:  2020-05-12
  • 刊出日期:  2020-12-15

雷公藤甲素对IgA肾病大鼠的肾保护作用及对NLRP3炎症小体的影响

    通讯作者: 田立东, tldlnzy@163.com
    作者简介: 周慧(1980-), 女, 主管药师
  • 1. 辽宁中医药大学附属医院 药剂科, 辽宁 沈阳 110032
  • 2. 辽宁中医药大学附属医院 儿科, 辽宁 沈阳 110032
基金项目:  国家中医药管理局课题资助项目 SATCM-2015-BZ(283)

摘要: 目的探讨雷公藤甲素对IgA肾病(IgAN)大鼠的肾保护作用及其与NLRP3炎症小体的关系。方法40只SPF级SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组和雷公藤甲素低、高剂量组。采用口服牛γ-球蛋白(BGG)8周及尾静脉注射BGG方法建立IgAN大鼠模型。于造模完成后灌胃给予低、高剂量雷公藤甲素治疗8周。观察大鼠血清中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及24 h尿蛋白(24 h TUP)水平;血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-17A、γ干扰素(IFN-γ)及IL-4水平;肾组织中IgA沉积情况;肾脏中IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3的表达情况。结果与模型组相比,雷公藤甲素组血清Scr、BUN及尿液中24 h TUP含量明显降低(P < 0.05~P < 0.01);雷公藤甲素能降低血清中TNF-α、IL-17A、IFN-γ和L-4水平(P < 0.05~P < 0.01),减轻IgA的沉积(P < 0.01),抑制IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3的表达(P < 0.05~P < 0.01)。结论雷公藤甲素对IgA肾病大鼠肾脏具有保护作用,其作用机制可能是通过抑制NLRP3炎症小体的激活,进而抑制炎症反应。

English Abstract

  • 免疫球蛋白A肾病(IgAN)是世界上最常见的肾小球肾炎形式之一,也是终末期肾病的主要原因[1]。25%~30%的IgAN病人需要在20~25年内进行肾脏替代治疗,另外20%~40%的病人在发病后20年内会发生终末期肾病[2-3]。其以血尿和蛋白尿为主要临床表现,病理特征包括肾小球系膜细胞增生并伴有以IgA为主的免疫复合物的沉积[4]。肾移植和透析的成本已成为病人和社会的巨大财务负担[5]。因此,开发用于治疗IgAN的有效药物是十分重要的。雷公藤甲素(triptolide, TR)是中药雷公藤的主要活性成分之一,具有抗炎、抗凋亡及免疫调节等作用[6],对大鼠肾缺血再灌注损伤、糖尿病肾损伤及慢性肾衰均具有保护作用[7-9]。并且其对于IgAN及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的治疗效果也较为突出,但是其具体治疗机制目前尚不明确。NLRP3是近几年发现的重要的炎症复合体之一,其能触发Caspase-1、白细胞介素(IL)-1β和IL-18的成熟以执行炎症反应[10-11]。并且有研究[12-13]已经证实,IL-1β和IL-18是NLRP3炎症小体激活的两个关键标志物,在IgAN病人血清和尿液中表达升高,提示NLRP3炎症小体可能通过调节炎症在IgAN中发挥重要作用。本研究通过建立IgAN大鼠模型,观察雷公藤甲素对IgAN大鼠的治疗作用,并且从NLRP3炎症小体方面探讨其可能的作用机制。

    • SPF级雄性SD大鼠40只,体质量(200±10)g,购于辽宁长生生物有限公司[SCXK(辽):2012-0001],动物分笼饲养,室温维持在20~25 ℃,每日光照12 h。大鼠被随机分为4组:对照组、模型组、雷公藤甲素低剂量组(100 μg/kg)及雷公藤甲素高剂量组(200 μg/kg),每组10只大鼠。

    • 雷公藤甲素标准品购自成都普菲德生物技术有限公司,肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-17A、γ干扰素(IFN-γ)和IL-4 ELISA试剂盒购自上海朗顿生物技术公司,鼠抗β-actin、兔抗IL-1β、Caspase-1、IL-18、NLRP3、IgA及β-actin抗体购自Abcam公司,辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鼠、HRP标记羊抗兔二抗购自北京博奥森有限公司,Cy3标记羊抗兔二抗购自Jackson公司,全蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物有限公司,BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物有限公司,其他试剂均为国产分析纯试剂。

    • 石蜡切片机(德国徕卡公司),AV5800型全自动生化分析仪(Beckman Coulter公司),紫外可见分光光度计(上海元析公司),Nikon荧光倒置显微镜(日本尼康公司),酶标仪(深圳迈瑞公司),水平核酸电泳仪、半干式蛋白转膜仪(Bio-Rad)。

    • 按文献[14-15]报道的方法建立IgAN大鼠模型,通过连续8周口服0.1%牛γ-球蛋白(BGG)溶液及连续3 d尾静脉注射1 mg BGG的方法制备IgAN模型。对照组大鼠给予等体积0.9%氯化钠溶液。随后将模型制备成功的大鼠随机分为模型组、雷公藤甲素低剂量(100 μg/kg)及高剂量(200 μg/kg)组,每组10只。各组大鼠连续灌胃给药8周,每天1次,对照组及模型组给予等体积的0.9%氯化钠溶液[16-17]

    • 将大鼠置于代谢笼内收集24 h尿液,5 000 r/min离心10 min,取上清液检测24 h UTP。末次给药1 h后各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉,经腹主动脉采血,10 000 r/min离心10 min分离血清,利用自动生化分析仪检测鼠血清中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)含量和尿液中24 h尿蛋白(24h UTP)水平。

    • ELISA法检测血清中TNF-α、IL-17A、IFN-γ及IL-4水平,按照试剂盒说明书进行操作。加入样品、生物素标记的抗体、链霉亲和素-HRP,37 ℃孵育30 min。加入显色液,37 ℃避光显色30 min,终止显色;以酶标仪在450 nm波长下检测吸光度值,根据不同浓度标准品的OD值绘制标准曲线,得到回归方程,根据回归方程计算样品中TNF-α、IL-17A、IFN-γ及IL-4水平。

    • 石蜡切片经过二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水,经过高温抗原修复后,1% Triton X-100透化30 min,PBS洗涤;滴加适量5% BSA溶液封闭60 min;滴加兔抗IgA抗体稀释液(1:500),4℃孵育过夜,PBS洗涤;滴加Cy3标记的羊抗兔二抗稀释液(1:500)室温避光孵育1 h,PBS洗涤,倒置荧光显微镜下观察并拍照。

    • 提取各组大鼠肾组织总蛋白,12 000 r/min离心10 min,使用考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量分析,100 ℃加热10 min对蛋白进行变性,随后进行SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳,使用PVDF膜转膜,5%脱脂奶粉封闭液封闭,TBST洗膜,分别加入β-actin、兔抗IL-1β、Caspase-1、IL-18、NLRP3及β-actin一抗(1:1 000),4 ℃孵育过夜,TBST洗膜,加入相应HRP标记二抗稀释浓度为1:1 000,室温避光孵育1 h。TBST洗膜,ECL发光试剂盒发光,凝胶成像系统成像,Image J软件计算灰度值,统计分析目的条带与内参蛋白条带光密度的比值。

    • 采用单因素方差分析和q检验。

    • 与对照组相比,模型组血清中Scr、BUN及尿液中24 h TUP含量明显升高(P < 0.05~P < 0.01);经不同剂量雷公藤甲素治疗后,血清中Scr、BUN及尿液中24 h TUP含量均明显降低(P < 0.05~P < 0.01);但各组大鼠血清中TP、ALT及AST水平无明显变化(P>0.05)(见表 1)。

      指标 对照组 模型组 低剂量组 高剂量组 F P MS组内
      BUN/(mmol/L) 3.91±0.53 19.87±2.99** 12.37±2.65 11.52±2.01△△ 20.21 < 0.01 0.003
      Scr/(μmol/L) 41.02±3.58 66.83±11.02* 45.76±5.68 41.59±10.03 6.48 < 0.05 3.622
      TP/(g/L) 59.03±8.22 60.52±10.57 59.63±7.86 63.19±10.28 0.12 >0.05 0.004
      ALT/(U/L) 39.98±6.35 43.17±4.97 45.91±6.04 42.81±3.72 0.61 >0.05 0.005
      AST/(U/L) 88.04±10.85 91.48±10.35 87.59±9.28 85.64±7.96 0.19 >0.05 0.008
      24 h UTP/(mg/24 h) 1.98±0.14 46.92±9.95** 29.91±5.69△△ 24.68±3.73△△ 28.40 < 0.01 8.368
      与对照组比较* P < 0.05,**P < 0.01;与模型组比较△P < 0.05,△△P < 0.01

      表 1  生化指标及24 h UTP含量变化的比较(x±sni=10)

    • 与对照组相比,模型组IgAN大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-17A、IFN-γ和IL-4水平明显升高(P < 0.05~P < 0.01);雷公藤甲素低、高剂量组均能不同程度的降低大鼠血清中TNF-α、IL-17A、IFN-γ和IL-4水平(P < 0.05~P < 0.01)(见表 2)。对照组少见IgA免疫球蛋白的沉积,而模型组肾小球IgA免疫球蛋白沉积明显(P < 0.01),雷公藤甲素治疗组IgA免疫球蛋白的沉积情况明显减轻(P < 0.01)(见图 1)。

      指标 对照组 模型组 低剂量组 高剂量组 F P MS组内
      TNF-α/(ng/mL) 101.76±20.01 291.33±49.60** 199.62±25.54 168.68±21.05△△ 19.05 < 0.01 2.523
      IL-17A/(ng/mL) 7.58±1.45 28.04±4.50* 16.12±4.58 13.16±3.25 14.58 < 0.05 0.062
      IFN-γ/(ng/mL) 8.43±3.00 19.26±12.98** 12.51±3.20 11.77±4.65 4.75 < 0.05 4.732
      IL-4/(ng/mL) 3.63±0.61 11.20±1.31** 6.33±0.64△△ 5.83±1.12△△ 32.74 < 0.01 5.019
      IgA相对荧光强度 100±21.54 280.73±42.39** 171.69±41.02△△ 165.07±32.52△△ 13.64 < 0.01 0.000
      与对照组比较* P < 0.05,**P < 0.01;与模型组比较△P < 0.05,△△P < 0.01

      表 2  肾组织中炎症因子水平的比较(x±sni=10)

      图  1  雷公藤甲素对IgA大鼠模型肾组织IgA沉积的影响

    • 与对照组相比,模型组肾组织中IL-1β、Caspase-1、IL-8及NLRP3蛋白的表达明显升高(P < 0.05~P < 0.01);雷公藤甲素治疗后,肾组织中IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的表达明显降低(P < 0.05~P < 0.01)(见图 2表 3)。

      图  2  各组大鼠肾组织中IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白电泳图

      蛋白指标 对照组 模型组 低剂量组 高剂量组 F P MS组内
      IL-1β 1.00±0.36 1.97±0.50* 1.32±0.21 1.36±0.15△△ 4.47 < 0.05 0.003
      Caspase-1 1.00±0.19 2.91±0.33** 1.99±0.38△△ 1.83±1.23△△ 22.35 < 0.01 0.008
      IL-18 1.00±0.17 2.32±0.12** 1.71±0.13△△ 1.76±1.13△△ 41.95 < 0.01 0.187
      NLRP3 1.00±0.21 2.53±0.55** 1.90±0.29△△ 1.76±0.28△△ 9.24 < 0.01 1.732
      与对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与模型组比较△P < 0.05,△△P < 0.01

      表 3  肾组织中IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的相对表达(x±sni=10)

    • IgAN是全球公认的引起肾小球肾炎的最常见的免疫复合物,IgAN的唯一诊断特征是在肾活检中发现肾小球系膜内主要含有聚合IgA的免疫沉积物[18]。IgAN的发病机制目前还不十分明确,大量的临床数据及基础研究均表明,IgAN主要以IgA为主的免疫复合物在肾小球系膜细胞及基质沉积后,通过激活多种细胞因子及信号通路,引发免疫反应过程,导致肾小球硬化、肾小管间质纤维化等,最终造成肾功能衰竭[19]。因此,如何抑制IgA的沉积是缓解IgAN进展、改善预后的关键靶点。

      近几年,中医中药在IgAN中的作用逐渐被重视,王骞等[20]利用滋阴凉血汤治疗IgAN大鼠模型,滋阴凉血汤能减少IgA肾病大鼠尿液中红细胞数量、尿蛋白,改善肾小球内系膜基质、细胞增生和肾小管萎缩及炎症反应等病理改变。活血通络清热利湿方能够抑制IgA肾病大鼠肾组织IL-13、IL-4 mRNA的表达及血清循环免疫复合物的分泌,延缓疾病发展,保护肾功能[21]。潘立军等[22]发现补肾调肝化瘀法联合西医基础治疗气阴两虚型IgAN,与单独西医基础治疗相比可更有效减轻中医症候,改善病人临床症状。YANG等[23]发现中药蝉蜕能够通过抑制炎症和细胞凋亡来改善IgAN大鼠的肾脏炎症和纤维化。

      中药雷公藤为卫矛科雷公藤属木质藤本植物,主要功效为祛风除湿、活血通络、清热解毒等。雷公藤甲素为其主要药理成分,具有广泛的药理作用,已经证实其具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤等作用。研究[24]表明雷公藤甲素能够抑制α平滑肌肌动蛋白、TGF-β1的表达来抑制肾纤维化的进展。雷公藤甲素能有效降低IgAN病人外周血单个核细胞中TNF-α、IL-6、一氧化氮的含量并促进其凋亡,发挥改善作用[25]。但是对于雷公藤甲素改善IgAN的具体作用机制,还未见报道。本研究利用BGG溶液及给予BGG的方法制备IgAN模型,观察雷公藤甲素对IgAN大鼠的保护作用并对其作用机制进行了探讨。

      Scr是人体肌肉终产物,BUN是体内的一种含氮化合物,在正常生理状态下,Scr和BUN由肾小球滤过而排出体外,体内Scr和BUN含量处于低水平状态,而在IgAN病人或其他肾功能不全疾病状态下,肾小球滤功能障碍,因此血清中Scr和BUN含量将明显升高[26]。当肾小球功能及泌尿功能受损后,将造成大量蛋白质漏出,导致尿中出现大量蛋白质,因此检测24 h UTP也可反映出肾小球功能是否正常[27]。本研究发现雷公藤甲素治疗后,大鼠血清中Scr、BUN及尿液中24 h UTP水平明显降低,而对TP、ALT及AST水平无影响,说明雷公藤甲素能够改善IgAN大鼠肾小球滤过功能。

      近年来,普遍认为IgAN的发生发展与辅助性T淋巴细胞1与辅助性T淋巴细胞2的比例(Th1/Th2)失衡有关。Th1细胞主要分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子,促进B细胞分泌产生可强烈激活补体的IgG亚型,Th2细胞主要分泌IL-4、IL-17等细胞因子,可激活嗜酸性粒细胞,促进B细胞分泌不激活补体的IgG亚型[28]。NAGAKI等[29]发现在自发性产生IgA的小鼠中,幼鼠主要以Th1为主,而随着IgA产生沉积增加,Th2则呈现出优势地位,因此认为IgA的产生可能与Th1/Th2平衡向Th2偏靠有关。有研究[30]证实IFN- γ、TNF-α及IL-4等细胞因子在IgA肾病模型中表达增多,且中晚期IgAN病人的炎症因子表达水平较早期病人高,提示Th1/Th2分泌的细胞因子参与了IgAN特异的炎症反应和免疫损伤过程,并且炎症因子的水平可以直观反映IgAN的病情。本研究利用ELISA检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-17A、IFN-γ和IL-4的表达,结果显示,雷公藤甲素能够显著降低大鼠血清中TNF-α、IL-17A、IFN-γ和IL-4水平;同时免疫荧光染色结果发现,雷公藤甲素能够降低大鼠肾组织中IgA的荧光强度,减少IgA的沉积,以上结果说明雷公藤甲素能够通过调节Th1/Th2平衡来抑制肾组织中IgA的沉积,改善肾功能。

      NLRP3炎症小体是炎症反应的核心复合物之一,IgA作为NLRP3炎症小体激动剂,可通过线粒体损伤释放活性氧进而激活NLRP3引起炎症级联反应[31],在动脉粥样硬化、阿尔茨海默病及糖尿病肾病等自身免疫性疾病中发挥重要作用。NLRP3炎症小体主要通过溶酶体破裂方式、半通道方式及活性氧方式激活。活化后的NLRP3炎症小体可招募ASC、Caspase-1形成NLRP3炎症复合体,进而活化Caspase-1,活化后的Caspase-1可以使无活性的IL-1β、IL-18前体加工成为有活性的细胞因子,并分泌到细胞外,参与一系列的炎症反应[31]。有研究[32-34]表明,淫羊藿苷可通过抑制NF-κB介导的NLRP3炎症小体激活来改善IgAN大鼠的肾损伤;白藜芦醇还可以通过保持线粒体完整性和增强自噬来抑制NLRP3炎性体激活,从而改善IgAN大鼠的肾功能。为了探讨雷公藤甲素改善IgAN大鼠的肾功能的机制,我们利用Western blotting检测了肾组织中IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的表达,结果发现,雷公藤甲素能够显著降低IL-1β、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的表达,说明雷公藤甲素改善IgAN大鼠的肾功能可能与抑制NLRP3炎症小体的活化有关。

      综上所述,雷公藤甲素改善IgAN大鼠的肾功能、抑制IgA沉积,可能与抑制NLRP3炎症小体的活化有关,为雷公藤甲素用于IgAN临床治疗提供了理论和实验依据。本研究虽初步探讨了雷公藤甲素治疗IgAN大鼠的可能机制,但并未深入利用基因敲除或者抑制剂等手段加以证明,本课题组将在后续的实验中对雷公藤甲素的治疗机制进行深入探讨。

参考文献 (33)

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