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卵巢癌发病隐匿、不易察觉，多数病人发现时处于中晚期且伴随转移[1]，导致多数病人预后不佳[2]。因此提高卵巢癌的早期诊断极为重要。但由于卵巢癌发病机制不明确，要提高早期诊断，还需从卵巢癌的发生机制入手。炎症在卵巢癌发生、发展中发挥重要作用[3]。白细胞介素(interleukin，IL)是炎性细胞因子重要组成部分，对免疫细胞成熟、增殖、分化等一系列过程具有调节作用。IL-33是IL-1的家族成员，以前体蛋白的形式存在于多种组织细胞核中，磺基转移酶(sulfotransferase，ST2)是IL-33的高亲和力受体[4]。IL-33/ST2信号通路可诱导免疫效应细胞活化，使促癌或抗癌细胞向肿瘤微环境中募集[5]。然而，IL-33在卵巢癌发生、发展的进程机制仍未清楚，是否通过ST2受体发挥作用也未明确。本研究从IL-33从发，探究IL-33/ST2对卵巢癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，旨在进一步揭示卵巢癌发生、发展的分子机制，为卵巢癌的临床基础研究提供参考。
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人卵巢癌细胞系ES-2细胞购自上海生命科学研究院细胞所；IL-33购自英国Abcam公司；DMEM培养基和胎牛血清均购自美国GIBCO公司；胰蛋白酶、脂质体2000均购自赛默飞世尔有限公司；二甲基亚砜购自美国sigma公司；MTT、Transwell小室、Matrigel基质胶均购自美国Millipore公司；双染细胞凋亡检测试剂购自美国Biolegend公司；青链霉素双抗溶液购自江苏恩莫阿赛生物公司；多聚甲醛和结晶紫染色液均购自碧云天生物公司。
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将卵巢癌ES-2细胞培养于DMEM培养基(含10%胎牛血清-青链霉素双抗溶液)，置于5%CO2、37 ℃的培养箱内培养，据细胞的生长速率每2天更换培养基，用0.25%的胰蛋白酶每隔2~3 d进行消化、传代，收集对数生长期ES-2细胞。
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MTT法检测IL-33和si-ST2对ES-2人卵巢癌细胞后的存活率的影响：取处于对数生长期ES-2细胞，用0.25%胰酶消化后，细胞计数，将ES-2细胞种到6板孔中，密度为3×105/孔，分组为：对照组、IL-33组、IL-33+si-ST2组、si-ST2组，IL-33质量浓度60 ng/L、si-ST2用量为每孔50 pmol。转染的步骤按照Lipofectamine 2000的说明书进行操作，24 h后消化细胞，计数，将细胞铺板到96孔板，加入浓度为60 ng/L的IL-33，在检测时间点时，每孔加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养4 h，避免吸去紫色结晶，每孔加150 μL二甲基亚砜，进行10 min低速振荡，使结晶物充分溶解，采用酶联免疫监测仪对波长490 nm时每个孔的吸光度实施测定，每组重复3次，取平均值。
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取对数生长期ES-2细胞，0.25%胰蛋白酶消化细胞，调整细胞密度，将ES-2细胞种到6孔板中，孔密度2.5×105，按照分组进行转染si-ST2，转染的步骤按照Lipofectamine 2000的说明书进行操作。转染24 h后，加入60 ng/L的IL-33。48 h后收集细胞，4 ℃预冷PBS洗涤2次，然后用500 μL结合缓冲液重悬细胞，调节其浓度为106/mL，取100 μL细胞悬浮于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-APC混匀后，加入5 μL Propidiμm Iodide(PI)混匀，于室温避光孵育15 min，采用流式细胞术检测细胞凋亡率。
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接种ES-2细胞至24孔板，待细胞贴壁铺满后利用枪头划痕，分别加入IL-33(60 ng/L)、si-ST2(每孔50 pmol)刺激后，分别在0、24 h时间点取样，拍照。在Adobe Illustrator(AI)软件里面量出不同时间不同分组划痕的宽度；细胞迁移率=(0 h细胞间距-24 h细胞间距)/0 h细胞间距×100%。
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接种ES-2细胞至Matrigel基质胶(9:1)，Matrigel稀释液平铺于Transwell小室上室，下室加入含有10%胎牛血清的培养液(600 μL)，上室分别加入IL-33(60 ng/L)、si-ST2(每孔50 pmol)刺激10 h后，去除上层未穿过滤膜的细胞，保留滤膜下层细胞，甲醇固定，结晶紫染色，显微镜视野下拍照细胞计数。
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采用t检验和方差分析。
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IL-33组、si-ST2组、IL-33+si-ST2组以及对照组的细胞存活率的比较，差异有统计学意义(P < 0.01)。其中IL-33组细胞存活率高于对照组(P < 0.01)，si-ST2组细胞存活率低于对照组(P < 0.01)；但IL-33+si-ST2组细胞存活率与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。IL-33+si-ST2组细胞存活率显著高于si-ST2组；IL-33组细胞存活率显著高于si-ST2组(P < 0.01)(见表 1)。
分组 n OD值 对照组 3 0.75±0.08 IL-33组 3 1.36±0.04** si-ST2组 3 0.43±0.04**△△ IL-33+si-ST2组 3 0.75±0.02△△## F — 181.40 P — < 0.01 MS组内 — 0.003 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与IL-33组比较△△P < 0.01；与si-ST2组比较##P < 0.01 表 1 不同组间细胞存活比较(x±s)
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对照组、IL-33组、si-ST2组以及IL-33+si-ST2组流式细胞仪结果显示，在ES-2细胞中，IL-33组细胞凋亡率低于对照组；si-ST2组细胞凋亡率高于对照组和IL-33组；IL-33+si-ST2组细胞凋亡率低于si-ST2组，高于IL-33组(见图 1、表 2)。
图 1 ES-2细胞凋亡分析
分组 LL
(活细胞)UL
(碎片及损伤细胞)UR
(晚期凋亡)LR
(早期凋亡)凋亡率 对照组 91.62 1.72 2.44 4.23 6.67 IL-33组 94.82 1.19 1.47 2.52 3.99** si-ST2组 84.97 4.03 5.05 5.95 10.90**△△ IL-33+si-ST2组 90.47 1.59 2.80 5.14 7.90**△△## 注：与对照组比较**P < 0.01;与IL-33组比较△△P < 0.01;与si-ST2组比较##P < 0.01 表 2 ES-2凋亡数据表(%)
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IL-33组、si-ST2组、IL-33+si-ST2组以及对照组的细胞迁移率、侵袭率的比较，差异有统计学意义(P < 0.01)，其中IL-33组细胞迁移率、侵袭率均低于对照组，si-ST2组迁移、侵袭均高于对照组，IL-33+si-ST2组迁移、侵袭均高于IL-33组，低于si-ST2组，差异均有统计学意义(P < 0.01)(见图 2、图 3及表 3)。
图 2 ES-2细胞迁移分析
图 3 ES-2细胞侵袭分析
分组 n 细胞迁移率/% 细胞侵袭率/% 对照组 3 45.83±4.15 43.06±2.64 IL-33组 3 22.88±2.36** 13.68±2.46** si-ST2组 3 73.71±3.08**△△ 66.59±1.78**△△ IL-33+si-ST2组 3 56.04±2.82**△△## 49.99±4.19**△△## F — 134.30 173.60 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 10.058 8.436 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与IL-33组比较△△P < 0.01；与si-ST2组比较##P < 0.01 表 3 不同组间细胞迁移率、侵袭率的比较(x±s)
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肿瘤发展不仅包括癌细胞本身，还有其他相关组成部分，如基质细胞、炎症细胞，特别在卵巢癌腹水和基质交换过程中，会伴随淋巴细胞群的相关因子变化，促进癌细胞生长、扩散[6]。另外癌细胞本身产生的炎性细胞因子也能通过自分泌方式，促进其本身增长，抑制凋亡。可见，炎症似乎和肿瘤的每一步都有关联，包括肿瘤细胞增殖、调亡、迁移、侵袭[7]。因为炎性因子的刺激，会造成线粒体损伤，降低细胞内的抗氧化活性，增加活性氧的产生，破坏生物大分子(DNA、蛋白质)，导致正常细胞转化为恶性细胞[8]，当细胞的基因发生点突变、缺失或重组，即可诱发肿瘤[9]。IL-33作为新发现的促炎细胞因子，可通过IL-33/ST2信号通路，作用于含有ST2受体的细胞，诱导其分泌相关细胞因子和趋化因子，发挥促增殖作用。有文献[10]表明IL-33和ST2在卵巢肿瘤中表达上调。胡霞等[11]研究表明IL-33可促进食管腺癌细胞的增殖，其机制是IL-33通过IL-33/ST2信号通路，作用于含有ST2受体的细胞，诱导其分泌相关炎性因子，发挥促癌细胞增殖、迁移作用。LI等[12]研究表明IL-33可促进大肠癌细胞的增殖，其机制是IL-33通过其受体ST2发挥作用，同时经NF-κB信号上调环氧化酶2的表达，促进大肠癌细胞的增殖、迁移。这些研究均表明IL-33是通过ST2通路发挥促癌细胞发展作用, 但其在卵巢癌的作用尚不清楚。
本研究采用MTT实验发现IL-33组细胞存活率高于对照组，si-ST2组细胞存活率低于对照组，IL-33+si-ST2组细胞存活率显著高于si-ST2组；IL-33组细胞存活率显著高于si-ST2组(P < 0.01)。表明了IL-33促进ES-2卵巢癌细胞增殖，si-ST2抑制增殖，转染si-ST2后再加入IL-33处理后，细胞增殖能力恢复。在流式细胞术检测IL-33和si-ST2对ES-2卵巢癌细胞凋亡的影响结果发现，IL-33处理组细胞凋亡率低于对照组；si-ST2组细胞凋亡率高于对照组和IL-33组；IL-33+si-ST2组细胞凋亡率低于si-ST2组，高于IL-33组(P < 0.01)。表明了在卵巢癌ES-2细胞中，IL-33抑制细胞凋亡，si-ST2促进细胞凋亡。本研究的迁移、侵袭实验发现IL-33组细胞迁移率、侵袭率均低于对照组，si-ST2组迁移、侵袭均高于对照组，IL-33处理+si-ST2组迁移、侵袭均高于IL-33处理组，低于si-ST2组(P < 0.01)。IL-33可促进卵巢癌细胞增殖，并可抑制卵巢癌细胞凋亡、迁移和侵袭能力。而沉默ST2可抑制细胞增殖，并促进卵巢癌细胞凋亡、迁移和侵袭能力，ST2沉默处理后再加入IL-33处理，细胞增殖能力恢复，而细胞凋亡、迁移和侵袭能力受到抑制。说明在卵巢癌ES-2细胞中，IL-33对其生物学特性的影响是通过ST2受体途径而实现的。究其原因：IL-33在肿瘤微环境下，被分泌到胞外与受体ST2结合，通过IL-33/ST2信号通路作用于肿瘤微环境中的含有ST2受体的细胞，诱导其分泌相关细胞因子和趋化因子[13]。同时将信号转到细胞内，把MyD88蛋白招募过来[14]，并通过MyD88通路的IRAK1、IRAK4和TRAF6，降解IκB蛋白(NF-κB的抑制性蛋白)，随后激活NF-κB、MAPK、p38以及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)和细胞外调节激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)[13, 15]，同时激活下游转录因子激活子蛋白-1(Activator protein 1, AP-1)。NF-κB是一种可与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异性结合的核蛋白因子[16]，具有多向性转录调节作用，当活化的NF-κB与相应κB序列结合后，启动和调节增殖相关基因的转录；MAPK通路是细胞增殖、凋亡等信号的转导途径；而p38途径通过上调某些转录因子基因的表达，则会影响癌细胞的增殖，JNK途径中活化的JNK与激活转录因子2(ATF2)及c-Jun的氨基末端区域结合，使转录因子的活性区域发生磷酸化[17]，JNK的同二聚体或异二聚体与基因启动子上的AP-1位点结合，提高AP-1转录活性，促进基因表达和蛋白质的合成，使内皮细胞活化，肿瘤细胞更容易穿透内皮，介导细胞与细胞间、或细胞与基质间相互接触或结合，从而参与肿瘤迁移、侵袭等过程。这也说明了IL-33是可促进卵巢癌细胞增殖，但ST2沉默后，IL-33无法与ST2受体结合发挥促增殖作用，因此si-ST2属促进卵巢癌细胞凋亡。
综上，IL-33可促进卵巢癌ES-2细胞增殖并抑制其凋亡、迁移、侵袭，沉默ST2可抑制卵巢癌ES-2细胞增殖并促进其凋亡, 使其迁移和侵袭能力下降，ST2沉默处理后再加入IL-33处理，细胞增殖能力恢复，但细胞凋亡、迁移和侵袭能力受到抑制。IL-33通过ST2途径参与影响卵巢癌ES-2细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭。
IL-33及其受体ST2对人卵巢癌ES-2细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响
Effect of IL-33 and its receptor ST2 on the proliferation, apoptosis, migration and invasion of human ovarian cancer ES-2 cells
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摘要:
目的探讨白细胞介素-33（IL-33）及其受体磺基转移酶（ST2）对人卵巢癌ES-2细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。 方法采用MTT实验检测IL-33和si-ST2对ES-2人卵巢癌细胞存活率的影响；分为对照组、IL-33组、si-ST2组以及IL-33+si-ST2组，检测各组吸光度值；用流式细胞术检测IL-33和si-ST2对ES-2人卵巢癌细胞凋亡的影响，统计各组细胞凋亡数目；用细胞迁移和侵袭实验检测IL-33和si-ST2对ES-2人卵巢癌细胞迁移、侵袭的影响。 结果IL-33组、si-ST2组、IL-33+si-ST2组以及对照组的细胞存活率的比较差异有统计学意义（P < 0.01）。其中IL-33组细胞存活率高于对照组，si-ST2组细胞存活率低于对照组，IL-33+si-ST2组细胞存活率显著高于si-ST2组，IL-33组细胞存活率显著高于si-ST2组，差异均有统计学意义（P < 0.01）。IL-33组细胞凋亡率低于对照组；si-ST2组细胞凋亡率高于对照组和IL-33组；IL-33+si-ST2组细胞凋亡率低于si-ST2组，高于IL-33组。IL-33组、si-ST2组、IL-33+si-ST2组以及对照组的细胞迁移率、侵袭率的比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。其中IL-33组细胞迁移、侵袭均低于对照组，si-ST2组迁移、侵袭均高于空白对照组，IL-33+si-ST2组迁移、侵袭均高于IL-33组，低于si-ST2组，差异均有统计学意义（P < 0.01）。 结论IL-33可促进卵巢癌ES-2细胞增殖并抑制其凋亡、迁移、侵袭；沉默ST2可抑制卵巢癌ES-2细胞增殖并促进其凋亡，使其迁移和侵袭能力下降；IL-33通过ST2途径参与影响卵巢癌ES-2细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭。 Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of interleukin-33(IL-33) and its receptor sulfotransferase(ST2) on the proliferation, apoptosis, migration and invasion of human ovarian cancer ES-2 cells. MethodsThe effects of IL-33 and si-ST2 on the survival rate of ES-2 cells were detected using MTT assay, and the cells were divided into the control group, IL-33 group, si-ST2 group and IL-33+si-ST2 group.The OD value in each group was detected.The effects of IL-33 and si-ST2 on the apoptosis of ES-2 cells were detected using flow cytometry, and the number of apoptotic cells in each group was counted.The effects of IL-33 and si-ST2 on the migration and invasion of ES-2 cells were detected using the cell migration and invasion experiments. ResultsThe differences of cell survival rates among the IL-33 group, si-ST2 group, IL-33+si-ST2 and control group were statistically significant(P < 0.01).The cell survival rate in IL-33 group was higher than that in control group, the cell survival rate in si-ST2 group was lower than that in control group, the cell survival rate in IL-33+si-ST2 group was significantly higher than that in si-ST2 group, and the cell survival rate in IL-33 group was significantly higher than that in si-ST2 group(P < 0.01).The cell apoptosis rate in IL-33 group was lower than that in control group, the cell apoptosis rate in si-ST2 group was higher than that in control group and IL-33 group, and the cell apoptosis rate in IL-33+si-ST2 group was lower than that in si-ST2 group, and higher than that in IL-33 group(P < 0.01).The differences of the cell migration rate and invasion rate among the IL-33 group, si-ST2 group, IL-33+si-ST2 group and control group were statistically significant(P < 0.01).The migration and invasion rates of cells in IL-33 group were lower than those in control group, the migration and invasion rates of cells in si-ST2 group were higher than those in control group, and the migration and invasion rates of cells in IL-33+si-ST2 group were higher than those in IL-33 group, and lower than those in si-ST2 group(P < 0.01). ConclusionsIL-33 can promote the proliferation, and inhibit the apoptosis, migration and invasion of ES-2 cells.Silencing ST2 can inhibit the proliferation, and promote the apoptosis, migration and invasion of ES-2 cells.IL-33 affects the proliferation, apoptosis, migration and invasion of ES-2 cells through ST2 pathway. -
Key words:
- ovarian neoplasms /
- interleukin-33 /
- sulfotransferase /
- ES-2 cells
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表 1 不同组间细胞存活比较(x±s)
分组 n OD值 对照组 3 0.75±0.08 IL-33组 3 1.36±0.04** si-ST2组 3 0.43±0.04**△△ IL-33+si-ST2组 3 0.75±0.02△△## F — 181.40 P — < 0.01 MS组内 — 0.003 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与IL-33组比较△△P < 0.01；与si-ST2组比较##P < 0.01 
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表 2 ES-2凋亡数据表(%)
分组 LL
(活细胞)UL
(碎片及损伤细胞)UR
(晚期凋亡)LR
(早期凋亡)凋亡率 对照组 91.62 1.72 2.44 4.23 6.67 IL-33组 94.82 1.19 1.47 2.52 3.99** si-ST2组 84.97 4.03 5.05 5.95 10.90**△△ IL-33+si-ST2组 90.47 1.59 2.80 5.14 7.90**△△## 注：与对照组比较**P < 0.01;与IL-33组比较△△P < 0.01;与si-ST2组比较##P < 0.01
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表 3 不同组间细胞迁移率、侵袭率的比较(x±s)
分组 n 细胞迁移率/% 细胞侵袭率/% 对照组 3 45.83±4.15 43.06±2.64 IL-33组 3 22.88±2.36** 13.68±2.46** si-ST2组 3 73.71±3.08**△△ 66.59±1.78**△△ IL-33+si-ST2组 3 56.04±2.82**△△## 49.99±4.19**△△## F — 134.30 173.60 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 10.058 8.436 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与IL-33组比较△△P < 0.01；与si-ST2组比较##P < 0.01
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