病人男，51岁，肝病引起消化道出血入院。根据病情需输血治疗，输血前血型鉴定发现病人ABO正反定型不相符：正定型为A型，样本红细胞与单克隆抗-A反应弱阳性，样本反定型为O型。遂抽取病人血样本5 mL(EDTA抗凝)进一步鉴定分析。

ABODE血型检测卡，ABO血型反定型试剂红细胞，不规则抗体检测试剂红细胞(长春博迅生物技术有限责任公司)；单克隆抗-A，抗-A1，A2试剂细胞(上海血液生物医药有限责任公司)；TD-A型血型血清学用离心机、FYQ型免疫微柱孵育器(长春博研科学仪器有限责任公司)；LDZ4-1.2低速自动平衡离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)。

TransStart ® FastPfu DNA polymerase快速PCR扩增高保真DNA聚合酶(北京全式金生物技术有限公司)、AxyPrep基因组DNA小量试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)、QIAquick胶体DNA回收试剂盒、高速离心机(Centrifuge 5415D型，德国Eppendorf)；Mastercycler nexus GX2梯度PCR仪(德国Eppendorf)、凝胶成像系统(Bio-Rad Gel Doc XR+型，美国伯乐)；电泳仪(DYY-8C型，北京市六一仪器厂)；引物合成与基因测序均由吉林省库美生物科技有限公司完成。

病人ABO血型鉴定按血型检测卡试剂说明书操作和判读。样本红细胞与抗-A1抗体反应、血清盐水不规则抗体筛查均采用试管法，均按《全国临床检验操作规程》第四版进行操作与判读。

DNA提取按照试剂盒说明书提取血液标本基因组。引物设计：ABO基因编码区共有7个外显子，其中最大的2个外显子6和7构成全部编码区的77%，故在第6、7外显子设计2对通用引物对目的基因进行扩增，参照美国国立生物技术信息中心GenBank中ABO基因第6、7外显子编码区碱基序列在IDT网站设计引物(见表 1)，PCR反应条件为95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min，延伸结束后，将上述PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后分析，将目的片段进行胶回收实验，并以胶回收产物为模板继续进行PCR扩增，将目的片段送测序，结果以A101(ABO*A1.01)等位基因序列做为参考序列，DNAStar软件进行序列比对。

病人样本血清学结果正定型为A型，样本红细胞与单克隆抗-A反应弱阳性(≤2+)，但其红细胞与抗-A1抗体反应阴性；样本反定型为O型，血清与A1试剂红细胞反应弱阳性(≤2+)、与A2试剂细胞反应阴性，其血清盐水不规则抗体筛查阴性，证实样本血清存在抗-A1意外抗体(见表 2)。

ABO基因外显子6、7序列扩增，琼脂糖凝胶电泳显示，第3、4孔在750 bp条带分别为外显子7、6扩增条带(见图 1)。将目的条带切下并进行胶回收DNA纯化后，经过琼脂糖凝胶电泳检测结果(见图 2)，第3、4孔条带分别为外显子7、6扩增条带。ABO血型基因直接测序以公认的A101(ABO*A1.01)等位基因序列做为参考序列比对：样本ABO基因6号外显子的c.297A＞G(见图 3)，氨基酸编码没有改变；7号外显子的c.646 A＞T(见图 4)，氨基酸p.Phe216Ile改变；以及c.771T＞C(见图 5)，氨基酸编码没有改变(见表 3)。经过分析该样本基因型为ABO*AW.30.01。

图  1  ABO基因外显子6、7扩增序列

图  2  ABO基因外显子6、7 DNA纯化后扩增序列

图  3  样本ABO血型基因6号外显子的c.297A>G突变

图  4  样本ABO血型基因7号外显子的c.646T>A突变

图  5  样本ABO血型基因7号外显子的e.771 C>T突变

病人ABO血型的正确鉴定是输血相容性检测的最重要环节，关系着病人的用血安全，病人在输血前应常规血清学检测ABO正定型和反定型，只有正反定型结果一致，才能确定红细胞ABO血型^[4]。但病人ABO血型鉴定会受到年龄、疾病、遗传等诸多因素的影响，如传统ABO亚型检测的血清学方法是通过血清学检测来确定血型抗原或红细胞表型，血清学检测的基础是检测可见的血凝或溶血。然而，由于某些药物暴露于病人红细胞或存在其他可能改变红细胞膜的疾病，或是虽然常规单克隆抗体试剂可以识别和凝集弱的亚型，但仍存在定型错误的风险。如错定病人血型，或Ax型供者错定为O型向O型病人输血时可能会产生不良后果。另外，如要准确地确定病人ABO血型，或在临床检测中出现正反定型不相符，仍需借助分子生物学方法确定病人血型^[5-6]。

本文病人样本正反定型不符为疑难血型，血清学结果正定型为A型，样本红细胞与单克隆IgM抗-A反应弱阳性，但其红细胞与抗-A1抗体反应阴性；样本反定型为O型，血清与A1试剂红细胞反应弱阳性、与A2试剂细胞反应阴性，其血清盐水不规则抗体筛查阴性，证实样本血清存在抗-A1意外抗体。因此，血清学方法确定为A亚型，疑似为Ax表型。Ax表型的主要血清学特征为：红细胞与B型人血浆中抗-A不凝集，大多数红细胞与O型人血浆中抗-AB凝集，与IgM抗-A试剂反应弱；红细胞只能呈现弱凝集反应，没有混合凝集；血清中含有抗-A1，可能含有抗-A，血清可与A1细胞反应，也许个别能与A2细胞反应^[7-8]。本例样本ABO血型正反定型不符，疑似亚型，作为病人若按照正定型结果定型为A型，输入正常A型红细胞，则病人血浆中存在的抗-A1抗体可能会与输入的A型供者红细胞反应，进而有发生严重溶血反应的风险，威胁病人输血安全。

为进一步准确确定病人ABO血型亚型，本研究应用分子生物学检测进行判定。每一种A亚型的抗原基因都是由多个基因突变后产生的多态性基因，不同A等位基因编码翻译出不同的糖基转移酶，其作用底物都是N-乙酰半乳糖，但所合成的糖链其抗原性具有一定差异。目前已发现的A等位基因超过200个，最常见的A基因是ABO*A1.01(A1表型)、ABO*A2.01(A2表型)，主要的基因突变发生在外显子6、7上^[7]。本例ABO血型基因直接测序以公认的A101(ABO*A1.01)等位基因序列做为参考序列比对，样本测序结果显示病人在ABO基因第6外显子出现c.297A＞G(ACA>ACG)、第7外显子出现c.771C＞T(CCC>CCT)及c.646T＞A(AGT>AGA)出现共3个特异性等位基因突变。ABO基因6号外显子的c.297A＞G及7号外显子的c.771C＞T突变，氨基酸编码并无改变，属于无义突变^[3]。而通过比对血型抗原基因突变资料库注册的ABO表型，分析病人为Ax表型，该表型基因ABO*AW.30.01第7外显子的c.646T＞A突变(导致氨基酸p.Phe216Ile改变)是其表型形成的分子基础^{[3, 9]}。Ax在A型中的频率分布为法国人约1/77 000，中国人约1/50 000^[4]。中国上海CAI等^[10]共筛选了322个ABO亚型个体，A型相关表型包括了A3、Aint、Ax、Ael等，得出中国上海检出率约为0.015%。2018年王鹤^[8]分析1例Ax04亚型的血清学特性及分子机制，发现该例正反定型不一致的Ax亚型，其α-1，3-N-乙酰半乳糖胺转移酶基因c.646T＞A突变导致A抗原表达减弱，与本例样本血清学及分子生物学检测结果相仿。对于临床需要输血的病人而言，准确鉴定ABO血型具有重要意义，Ax亚型往往由于抗原表达极弱血型鉴定困难而导致误判血型。且Ax亚型病人血浆中常含有抗-A1抗体，可能会导致病人发生溶血性输血反应，需在确认该抗-A1抗体在37 ℃无反应情况下才能输入正常A型红细胞或输入O型红细胞，以防止发生输血不良后果^[11]。

根据已有报道^[8-9]及本例样本的鉴定说明，在临床输血中包括疑难血型鉴定、红细胞直抗阳性和多次输血病人的血型鉴定等诸多方面，仅依靠血清学结果难于确定病人准确血型。因此, 有学者建议应用分子生物学的血型基因分型^[6]，并认为有助于预防输血的同种免疫反应，提高输血的安全性，推动精准医学的发展。