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carabin是2007年在人T细胞中发现的一个新的钙调磷酸酶(calcineurin,CaN)结合蛋白,主要表达于脾脏及血液中[1],同时可与Ras结合,基于其与CaN和Ras均能相互作用的特性,将其命名为carabin[1]。前期研究[1-4]表明,carabin作为CaN的内源性负反馈抑制蛋白,通过CaN和Ras信号通路负反馈抑制T细胞及B细胞的持续活化,在机体免疫中发挥着重要作用。最近研究[5-6]表明,carabin在心肌细胞中亦有表达,可通过负性调节CaN和Ras信号通路抑制心肌细胞的肥大,并有可能成为诊治心衰引起心肌肥厚的靶点。我们的前期研究[7]发现,carabin在小鼠梗死心脏及经缺血/缺氧处理的人心室肌细胞株AC16中表达均显著下调,提示carabin在心肌梗死及缺血中可能起到一定的作用,但目前尚无相关研究报道。本研究拟采用腺病毒载体系统,设计针对大鼠carabin基因的干扰序列,构建carabin腺病毒干扰载体(Ad-carabin-shRNA),感染H9C2心肌细胞筛选针对大鼠carabin基因干扰效果最佳的Ad-carabin-shRNA,为进一步观察carabin信号通路在心肌梗死及缺血中的作用奠定基础。
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经结构鉴定,carabin蛋白含有一个CaN结合区域和一个Ras结合区域:CaN结合区域位于羧基端,其最小结合区域为羧基末端的41个氨基酸残基(aa 406~446);Ras结合区域为氨基端的89位到294位氨基酸序(aa 89~294)[1]。经在体和离体实验的功能鉴定:(1)CaN结合区域,carabin的转录和表达依赖于CaN信号通路的活化,而产生的carabin可与CaN结合,进而抑制CaN信号通路,因此carabin是作为CaN的负反馈抑制蛋白来发挥其调节作用的;(2)Ras结合区域,具有Ras GAP活性,可特异性地抑制Ras/ERK1/2信号通路。前期研究[1-4]表明,在T细胞及B细胞中carabin作为CaN的内源性负反馈抑制蛋白通过CaN-NFAT和Ras/ERK1/2信号通路负反馈抑制T细胞及B细胞的持续活化,在机体免疫中发挥着重要作用。
分组 n carabin蛋白相对表达 carabin mRNA相对表达 对照组 3 1.15±0.13 1.05±0.04 Ad-carabin-shRNA-1 3 0.57±0.14* 0.61±0.12* Ad-carabin-shRNA-2 3 0.31±0.09* 0.26±0.11* Ad-carabin-shRNA-3 3 0.99±0.16 0.85±0.13* F — 25.27 30.80 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.018 0.012 q检验:与对照组比较*P < 0.01 表 1 Ad-carabin-shRNA在H9C2心肌细胞内的干扰效应(x±s)
最近研究[5-6]表明,carabin在心肌细胞中亦有表达,可抑制心脏肥厚,并有可能成为诊治心衰的新靶点。我们的前期研究[7]显示,在小鼠冠状动脉左前降支结扎诱导的心肌梗死动物模型中,术后7 d及14 d梗死区域carabin的mRNA及蛋白表达水平均显著下调(约7倍),同时经缺血/缺氧处理的人心室肌细胞株AC16中表达均亦显著下调。那么下调的carabin在心肌梗死中是否会起到一定的作用呢,目前尚无相关研究报道。carabin为一新发现的蛋白,目前尚未发现其特异性抑制剂,鉴于此,本研究利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,针对carabin蛋白构建相应干扰载体,以达到特异性抑制carabin的作用,为carabin的研究奠定基础。
RNAi技术是一种由外源性或内源性双链DNA介导的转绿后基因沉默技术。短发夹RNA(short-hairpin RNA, shRNA)是根据小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术设计的类似双链结构的RNA。相比于siRNA,shRNA随载体进入细胞后具有更高的内在稳定性,并且shRNA根据其特性可以在细胞内快速合成大量的shRNA,其沉默作用更加持久[9]。目前,用于目的基因转移的病毒载体主要包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和逆转录病毒载体。与其他病毒载体系统相比,腺病毒载体具有遗传毒性低、不整合基因组、寄主范围广、感染效率高、可感染分裂期和静止期细胞、理化性质稳定及包容量大等优点,在分子生物学领域应用广泛[10]。因考虑后期研究涉及动物及细胞实验,对干扰效率要求高,因此本研究采用腺病毒载体构建carabin干扰载体。
在Ad-carabin-shRNA构建过程中,我们首先合成3对carabin-shRNA寡核苷酸,退火形成双链后定向克隆至ADV4-U6-CMV穿梭质粒,经测序验证后与pGp-Ad-pac Vector骨架质粒共转染293A细胞,培养2周后收集病毒原液,再连续三代反复行病毒扩增。病毒滴度测定后,感染H9C2心肌细胞行Ad-carabin-shRNA功能鉴定,鉴定结果表明,AD-carabin-shRNA-1和AD-carabin-shRNA-2具有干扰效果。
大鼠carabin腺病毒干扰载体构建及功能鉴定
Construction and function identification of rat carabin adenovirus interference vector
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摘要:
目的构建高滴度大鼠carabin腺病毒干扰载体(Ad-carabin-shRNA)。 方法设计3对carabin-shRNA寡核苷酸序列,分别构建3个ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA腺病毒穿梭质粒,将构建好的ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA和pHBAd-BHG质粒共转染293A细胞,以包装Ad-carabin-shRNA,采用微量全细胞病变法检测病毒滴度。Ad-carabin-shRNA感染H9C2心肌细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting检测carabin mRNA及蛋白表达。 结果3个ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA干扰质粒构建成功,相对应的Ad-carabin-shRNA包装顺利,病毒滴度均为9×108 TU/mL。感染H9C2心肌细胞后,Ad-carabin-shRNA-1和Ad-carabin-shRNA-2均有显著干扰效果,carabin mRNA和蛋白表达明显下调(P < 0.01)。 结论Ad-carabin-shRNA构建成功,在心肌细胞中具有干扰carabin的效应。 Abstract:ObjectiveTo construct rat carabin adenovirus interference vectors (Ad-carabin-shRNA) with high titers. MethodsThree pairs of carabin-shRNA oligonucleotide sequences were synthesized to construct ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA shuttle plasmid.The ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA shuttle plasmid and pHBAd-BHG plasmid were co-transfected into 293A cells to pack the Ad-carabin-shRNA.Viral titer was detected by whole-cell microlesion assay.H9C2 myocardial cells were infected with the Ad-carabin-shRNA, and the expression of carabin mRNA and protein was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting, respectively. ResultsThree ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA interference plasmids were successfully constructed, and the package of ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA was successful.The titer of Ad-carabin-shRNA was 9×108 TU/mL.The expression of carabin mRNA and protein was significantly downregulated in H9C2 myocardial cells after infected by Ad-carabin-shRNA-1 and Ad-carabin-shRNA-2 (P < 0.01). ConclusionsThe construction of Ad-carabin-shRNA is successful, which exhibits interfering effect on carabin in H9C2 myocardial cells. -
Key words:
- adenovirus /
- carabin /
- interference vector /
- myocardial infarction /
- myocardial ischemia
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表 1 Ad-carabin-shRNA在H9C2心肌细胞内的干扰效应(x±s)
分组 n carabin蛋白相对表达 carabin mRNA相对表达 对照组 3 1.15±0.13 1.05±0.04 Ad-carabin-shRNA-1 3 0.57±0.14* 0.61±0.12* Ad-carabin-shRNA-2 3 0.31±0.09* 0.26±0.11* Ad-carabin-shRNA-3 3 0.99±0.16 0.85±0.13* F — 25.27 30.80 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.018 0.012 q检验:与对照组比较*P < 0.01 -
[1] PAN F, SUN L, KARDIAN DB, et al. Feedback inhibition of calcineurin and Ras by a dual inhibitory protein Carabin[J]. Nature, 2007, 445(7126): 433. doi: 10.1038/nature05476 [2] SCHICHEL JN, PASQUALI JL, ANNE S, et al. Carabin deficiency in B cells increases BCR-TLR9 costimulation-induced autoimmunity[J]. EMBO Molec Med, 2012, 4(12): 1261 doi: 10.1002/emmm.201201595 [3] JIANG W, ZHOU XY, LI ZX, et al. Prolyl 4-hydroxylase 2 promotes B-cell lymphoma progression via hydroxylation of carabin[J]. Blood, 2018, 131(12): 1325. doi: 10.1182/blood-2017-07-794875 [4] HSU C, MOROHASHI Y, YOSHIMURA S, et al. Regulation of exosome secretion by Rab35 and its GTPase-activating proteins TBC1D10AC[J]. J Cell Biol, 2010, 189(2): 223. doi: 10.1083/jcb.200911018 [5] BISSERIER M, BERTHOUZE DM, BRECKLER M, et al. Carabin protects against cardiac hypertrophy by blocking calcineurin, Ras, and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ signaling[J]. Circulation, 2015, 131(4): 390. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.114.010686 [6] YI X, LI XY, JIANG XJ. Carabin: Endogenous Calcineurin inhibitor, a potential diagnostic and therapeutic target for cardiac hypertrophy in heart failure[J]. Int J Cardiol, 2016, 212: 57. doi: 10.1016/j.ijcard.2016.03.028 [7] 吴庆, 姚浩旗, 程阔菊, 等. Carabin过表达对人心室肌细胞AC16氧糖剥夺后凋亡的影响[J]. 第三军医大学学报, 2018, 40(22): 2068. [8] 卢大儒, 邱信芳, 郑冰, 等. 带有人凝血因子Ⅸ cDNA的反转录病毒载体的构建及其在离体细胞中的高效表达[J]. 中国科学(B辑化学生命科学地学), 1994, 24(11): 1183. [9] 蔡春梅, 范思均, 梁歌, 等. 质粒载体介导的短发夹RNA对RPE细胞转染效率及毒性研究[J]. 解剖科学进展, 2018, 24(6): 614. [10] 刘根梅, 陈瑞爱, 罗满林. 腺病毒载体的研究进展[J]. 广东农业科学, 2010, 37(4): 188.