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儿童急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是临床常见的危急重症，多由严重感染、创伤等因素诱发，主要以难治性低氧血症为特征。由于病死率较高，已成为严重威胁重症患儿生命的主要原因。研究[1-2]表明，各种炎性细胞活化，导致促炎与抗炎因子的失衡，所诱发的免疫炎症反应是ARDS产生的重要原因。其中，Th17/Treg细胞之间的平衡在免疫炎症性疾病的发生发展中发挥重要作用[3-4]。研究[5]发现，ARDS病人肺泡灌洗能够减少外周血中性粒细胞的凋亡，上述过程与肿瘤坏死因子-α、白细胞介素(IL)-10、IL-8、粒细胞集落刺激因子等促炎因子有关，调控着CD4+T细胞，Th17和Treg细胞的增殖、分化，而Th17、Treg细胞成熟并被激活后又进一步产生相应炎症因子，促进了ARDS的发生发展，上述过程形成了一个相互作用的炎症网络。因此，探讨ARDS中CD4+ T细胞的亚群及其功能对于影响ARDS的发生发展，缓解炎性损伤具有重要意义。
根据CD4+ T细胞亚群分泌的细胞因子的类型及效应的不同，可将其分为IFN-γ+Th1、IL-4+Th2、IL-17+Th17以及Foxp3+Treg。上述细胞因子在ARDS炎性反应发病中的分布格局及贡献度鲜见研究。本研究分析了CD4+ T细胞亚群在ARDS中的格局变化，并评估了其在ARDS发病中的影响。现作报道。
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选择2017年3月至2019年10月我院儿科ICU收治的ARDS患儿61例，其中男37例，女24例；均符合2015年版“儿童急性呼吸窘迫综合征：儿童急性肺损伤会议共识推荐”中制定的诊断标准[6]，同时排除存在心力衰竭、肺动脉高压、弥散性肺出血患儿，以及存在先天性遗传代谢性疾病患儿。儿童ARDS(PARDS)新的诊断标准为：(1)排除有围生期相关肺部疾病的患儿；(2)发生在7 d以内的已知临床表现；(3)不能完全用心功能衰竭或液体超负荷来解释的呼吸衰竭；(4)胸部影像学出现新的渗出性改变与急性器质性肺损伤的表现一致；(5)在无创机械通气时，面罩BiPAP或CPAP≥5 cmH2O，满足P/F≤300或S/F≤264，可诊断PARDS；(6)在有创机械通气时，满足4≤氧指数≤8或5≤OSI < 7.5，可诊断轻度PARDS；8≤氧指数 < 16或7.5≤OSI < 12.3，可诊断中度PARDS；氧指数≥16或OSI≥12.3，可诊断重度PARDS。将ARDS患儿分为轻度(25例)、中度(20例)和重度(16例)。同时，选取同期同性别、同年龄的61名健康查体儿童作为对照组，对照组儿童身体健康，近1个月内未发生感染、过敏性疾病，且没有免疫抑制剂治疗史，血、尿常规检查均在正常范围正常。ARDS组和对照组儿童性别与年龄分布见表 1。所有研究对象的监护人对本研究均知情同意，并签署知情同意书，并经我院医学伦理委员会审核批准开展。
分组 新生儿 婴儿 幼儿 3岁以上 ARDS组 男 22 8 3 4 女 9 3 5 7 对照组 男 22 8 3 4 女 9 3 5 7 表 1 ARDS组和对照组儿童性别与年龄分布
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BD CantoⅡ流式细胞分析仪(BD公司)及其提供的配套试剂。
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ARDS患儿入科病程第1天，健康体检儿童按预约清晨抽取外周空腹肘静脉血2 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，按照标准操作规程操作，避光孵育后，采用流式细胞术检测T细胞绝对数量及Treg、Th17、Th1和Th2占CD4+T细胞的比例。
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采用Real-timePCR检测患儿CD4+T细胞亚群的标志性细胞因子的表达。ARDS患儿入科病程第1天，健康体检儿童按预约清晨抽取外周空腹肘静脉血2 mL，置于生化管中离心分离血清，采用试剂微球代替红细胞与细胞因子结合，通过标准曲线检测患儿血清中IL-4、IFN-γ、IL-17A及IL-17F的水平。
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包含10项生理参数，总分100分，评分越低，患儿病情越危重，≤70分为极危重，>70~80分为危重，>80分为非危重[7]。观察并记录各组患儿额心率及收缩压等指标变化，评分越低，提示其病情程度越严重。
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采用t检验、方差分析和Spearman相关分析。
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与对照组比较，ARDS患儿T细胞总量、Th1、Th2均明显升高(P＜0.01)；3指标在ARDS组不同程度之间的比较显示，Th1指标为重度高于轻度(P＜0.05)，Th2指标为重度高于中、轻度(P＜0.05)和(P＜0.01)，T细胞总量和Th1/Th2比例在不同程度组间差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 2)。
分组 n T细胞总量 Th1/% Th2/% Th1/Th2 对照组 61 1 095±372 12.93±4.66 3.15±1.21 3.69±1.74 ARDS组 61 1 596±528 17.83±7.15 3.92±1.45 4.54±1.33 t — 6.06 4.48 3.18 3.03 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 重度组 25 1 674±536 19.93±6.02 4.66±1.22 4.27±1.65 中度组 20 1 408±466 17.58±5.41 3.73±1.31* 4.89±1.72 轻度组 16 1 318±419 15.49±5.34* 2.96±1.08** 5.23±1.88 F — 3.09 3.09 9.85 1.63 P — >0.05 >0.05 ＜0.01 >0.05 MS组内 — 235 422.121 31.959 1.480 3.010 q检验：与重度组比较*P＜0.05，**P＜0.01 表 2 ARDS患儿与对照组T细胞总量及Th1、Th2细胞的变化(x±s)
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与对照组比较，ARDS患儿Th17细胞数量、Treg细胞和Th17/Treg比例均明显升高(P＜0.01)。3个指标在ARDS组不同程度之间的比较显示，均为重度的高于轻、中度(P＜0.05~P＜0.01)，轻、中度之间差异无统计学意义(P>0.05)(见表 3)。
分组 n Th17/% Treg/% Th17/Treg 对照组 61 0.87±0.24 2.74±0.88 0.66±0.22 ARDS组 61 3.84±1.22 4.42±1.29 0.98±0.24 t — 18.66 8.40 7.68 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 重度 25 5.93±1.67 5.63±1.88 1.04±0.19 中度 20 4.08±1.33** 4.51±1.32* 0.86±0.24** 轻度 16 3.27±1.16** 3.77±1.09** 0.73±0.14** F — 18.71 7.66 12.66 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 2.082 2.341 0.039 q检验：与重度组比较*P＜0.05，**P＜0.01 表 3 ARDS患儿与对照组Treg、Th17及Th17/Treg的变化(x±s)
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ARDS组患儿中IL-4、IFN-γ、IL-17A及IL-17F水平明显高于对照组(P＜0.01)，而且随着疾病程度的加重，4个因子的水平呈升高趋势(P＜0.01)(见表 4)。
分组 n IL-4/(pg/mL) IFN-γ/(pg/mL) IL-17A/(pg/mL) IL-17F/(pg/mL) 对照组 61 4.87±1.24 8.74±1.88 24.87±1.55 27.59±1.92 ARDS组 61 23.84±3.22 40.42±4.29 93.84±4.52 75.09±3.47 t — 42.94 52.83 112.73 93.55 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 重度 25 55.93±4.67 59.63±2.88 125.93±3.697 89.91±3.96 中度 20 34.08±3.33** 45.51±2.32** 104.08±2.34** 67.91±2.81** 轻度 16 26.27±3.16**△△ 36.77±2.09**△△ 84.27±2.32**△△ 51.27±2.03**△△ F — 328.16 431.75 981.33 749.91 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 15.239 6.325 8.841 10.141 q检验：与重度组比较**P＜0.01；与中度组比较△△P＜0.01 表 4 ARDS患儿与对照组CD4+ T细胞标志性细胞因子的变化(x±s)
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因子与病情严重程度的相关性ARDS患儿外周血IL-4、IFN-γ、IL-17A及IL-17F水平与小儿危重病评分评分均呈负相关关系(rs=-0.933、rs=-0.910、rs=-0.946、rs=-0.930，P＜0.01)。
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ARDS是指由严重感染、休克、创伤及烧伤等疾病诱导的肺组织出现弥漫性的炎性损伤及炎性水肿为主要病理特征的临床危重症。临床可出现肺容积降低、肺顺应性下降、严重通气/血流比例失调为主的进行性低氧血症和呼吸窘迫等表现。目前，ARDS发病机制尚不清楚，机体的促炎反应与抗炎反应的失调可能与ARDS的发病密切相关。当机体受到各种因素刺激后，可导致炎性细胞在内皮细胞表面黏附，引起血管内皮的损伤，最终产生大量炎性细胞因子的释放[8-9]，肺毛细血管通透性增加，肺组织发生炎性水肿等病理改变。但具体的炎症调控机制尚不明确。CD4+T淋巴细胞亚群在多种炎症性疾病的发生发展中均发挥重要作用，本研究推测，ARDS的炎性因子损伤过程可能与CD4+T淋巴细胞亚群的变化密切相关。
Th细胞在正常机体中处于前体状态，当受到外界特异性抗原的刺激下，可分化为Th1细胞和Th2细胞两个亚群，Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ及TNF-α，参与机体的细胞免疫；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5及IL-6等，参与机体的体液免疫。研究[10-11]发现，当肺组织受到创伤、手术等外界刺激后，可出现以Th2为优势的Th1/Th2比例的失衡，导致以抗炎细胞因子分泌增多的免疫抑制现象，导致机体IgE增高，气道出现高反应性，肺组织炎性损伤加剧。本研究结果显示，与对照组比较，ARDS患儿T细胞总量、Th1、Th2均显著升高，且Th2升高更显著，Th1/Th2比例降低，且病情越重，Th1、Th2细胞变化越显著(P＜0.05~P＜0.01)，同时，Th1、Th2细胞亚群的相关细胞因子也出现了相应的趋势，提示外周血Th1细胞和Th2细胞亚群可能参与了ARDS患儿的病理生理发病过程。
同时，Th17细胞亚群也是CD4+T细胞亚群的重要一员，参与了类风湿性关节炎、自身免疫性心肌炎等多种炎症性疾病的免疫损伤过程[12-13]。Th17细胞具有强大的促炎作用，主要通过分泌IL-17、IL-21及IL-6等促炎细胞因子发挥作用。在TGF-β1和IL-6作用下，CD4+T细胞可被活化并转化为Th17细胞，Th17细胞可促进其主要效应因子IL-17的分泌，促进免疫应答的发生，参与炎症性肠病、哮喘、移植排斥等多种炎症性疾病的病理过程。Treg细胞是发挥免疫抑制作用的T淋巴细胞亚群，主要通过分泌IL-4和IL-10等细胞因子发挥抑制炎症反应的过程。研究[14]发现，TGF-β1可促进初始CD4+T细胞表达Foxp3，促进其向Treg细胞的转化，同时，在TGF-β1在初始CD4+T细胞转化为Th17细胞中亦发挥重要作用，因此，Th17细胞与Treg细胞存在相互转化的分化过程，可影响对方的增殖、活化，二者之间的平衡直接影响着机体免疫功能的平衡状态，炎症的消散和吸收的过程。Th17/Treg平衡在慢性阻塞性肺疾病、儿童脓毒症的发病中均发挥重要作用。本研究中，我们推测Th17/Treg在ARDS患儿中发挥重要作用，结果显示，ARDS患儿Th17细胞数量显著升高，Treg细胞降低，Th17/Treg比例升高，且病情越重，Th17及Treg细胞变化越显著(P＜0.05~P＜0.01)，且相关细胞因子也出现了相应的变化，提示Th17细胞在ARDS患儿发病过程中发挥了重要影响。
小儿危重病评分是评估为重症患儿病情情况和疾病预后的重要指标，在儿科领域被广泛接受和采纳，应用于院前转运、急诊室救治、危重症临床研究等多种领域。本研究采用小儿危重病评分评分评估ARDS患儿病情，并与CD4+T细胞亚群相关细胞因子进行相关性分析，结果显示，ARDS患儿外周血IL-4、IFN-γ、IL-17A及IL-17F水平与小儿危重病评分评分之间呈显著负相关。提示CD4+T细胞亚群相关细胞因子可在一定程度上反映ARDS患儿的病情变化。
儿童急性呼吸窘迫综合征CD4+ T细胞亚群格局及其影响研究
Pattern and influence of CD4+ T cell subsets in children with acute respiratory distress syndrome
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摘要:
目的研究儿童急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患儿中CD4+ T细胞亚群格局的变化及其对ARDS的关系。 方法选择61例ARDS患儿，分为轻度组（25例）、中度组（20例）和重度组（16名）。同时，选取同期61例健康儿童作为对照组，采用流式细胞仪检测ARDS患儿和对照组外周血中T细胞总量、调节性T细胞（Treg）、Th17、Th1和Th2占CD4+ T细胞的比例。并观察CD4+ T细胞亚群主要细胞因子γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素（IL）-4、IL-17A、IL-17F的变化情况。 结果与对照组比较，ARDS患儿T细胞总量、Th1、Th2、Th17细胞数量、Treg细胞、Th17/Treg比例、IL-4、IFN-γ、IL-17A及IL-17F因子均有不同程度的升高（P＜0.05~P＜0.01）；Spearman相关分析发现，ARDS患儿外周血IL-4、Foxp3、IFN-γ、IL-17A及IL-17F水平与小儿危重病评分均呈负相关关系（P＜0.01）。 结论CD4+ T细胞亚群格局变化和ARDS发病密切相关，CD4+ T细胞亚群格局变化促进了ARDS的发生发展，形成了一个相互作用的炎症网络。 Abstract:ObjectiveTo study the changes of CD4+ T cell subsets and its effects on acute respiratory distress syndrome(ARDS) in children with ARDS. MethodsSixty-one children with ARDS were divided into the mild group(25 cases), moderate group(20 cases) and severe group(16 cases).At the same time, 61 healthy children were set as the control group.Flow cytometry was used to detect the total amount of T cells, regulatory T cells(Treg), Th17, proportion of Th1 and Th2 in CD4+ T cells in the peripheral blood of ARDS patients and control group.The major cytokines interferon-γ(IFN-γ), interleucin(IL-4), IL-17A and IL-17F in CD4+ T cell subsets were observed. ResultsCompared with the control group, the total amount of T cells, number of Th1, Th2, and Th17 cells and Treg cells, Th17/Treg ratio, and levels of IL-4, IFN-γ, IL-17A and IL-17F increased in ARDS children(P < 0.05 to P < 0.01).The results of Spearman correlation analysis showed that the levels of IL-4, Foxp3, IFN-γ, IL-17A and IL-17F were negatively correlated with prediatric critical illness scores in children with ARDS(P < 0.01). ConclusionsThe pattern of CD4+ T cell subsets is closely related to the pathogenesis of ARDS.The change of CD4+ T cell subsets promotes the development of ARDS, and forms an interactive inflammatory network. -
Key words:
- acute respiratory distress syndrome /
- immune function /
- CD4+T cell /
- Th17 cell
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表 1 ARDS组和对照组儿童性别与年龄分布
分组 新生儿 婴儿 幼儿 3岁以上 ARDS组 男 22 8 3 4 女 9 3 5 7 对照组 男 22 8 3 4 女 9 3 5 7 
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表 2 ARDS患儿与对照组T细胞总量及Th1、Th2细胞的变化(x±s)
分组 n T细胞总量 Th1/% Th2/% Th1/Th2 对照组 61 1 095±372 12.93±4.66 3.15±1.21 3.69±1.74 ARDS组 61 1 596±528 17.83±7.15 3.92±1.45 4.54±1.33 t — 6.06 4.48 3.18 3.03 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 重度组 25 1 674±536 19.93±6.02 4.66±1.22 4.27±1.65 中度组 20 1 408±466 17.58±5.41 3.73±1.31* 4.89±1.72 轻度组 16 1 318±419 15.49±5.34* 2.96±1.08** 5.23±1.88 F — 3.09 3.09 9.85 1.63 P — >0.05 >0.05 ＜0.01 >0.05 MS组内 — 235 422.121 31.959 1.480 3.010 q检验：与重度组比较*P＜0.05，**P＜0.01
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表 3 ARDS患儿与对照组Treg、Th17及Th17/Treg的变化(x±s)
分组 n Th17/% Treg/% Th17/Treg 对照组 61 0.87±0.24 2.74±0.88 0.66±0.22 ARDS组 61 3.84±1.22 4.42±1.29 0.98±0.24 t — 18.66 8.40 7.68 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 重度 25 5.93±1.67 5.63±1.88 1.04±0.19 中度 20 4.08±1.33** 4.51±1.32* 0.86±0.24** 轻度 16 3.27±1.16** 3.77±1.09** 0.73±0.14** F — 18.71 7.66 12.66 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 2.082 2.341 0.039 q检验：与重度组比较*P＜0.05，**P＜0.01
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表 4 ARDS患儿与对照组CD4+ T细胞标志性细胞因子的变化(x±s)
分组 n IL-4/(pg/mL) IFN-γ/(pg/mL) IL-17A/(pg/mL) IL-17F/(pg/mL) 对照组 61 4.87±1.24 8.74±1.88 24.87±1.55 27.59±1.92 ARDS组 61 23.84±3.22 40.42±4.29 93.84±4.52 75.09±3.47 t — 42.94 52.83 112.73 93.55 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 重度 25 55.93±4.67 59.63±2.88 125.93±3.697 89.91±3.96 中度 20 34.08±3.33** 45.51±2.32** 104.08±2.34** 67.91±2.81** 轻度 16 26.27±3.16**△△ 36.77±2.09**△△ 84.27±2.32**△△ 51.27±2.03**△△ F — 328.16 431.75 981.33 749.91 P — ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 MS组内 — 15.239 6.325 8.841 10.141 q检验：与重度组比较**P＜0.01；与中度组比较△△P＜0.01
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