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叶酸缺乏对L02细胞增殖、凋亡及纺锤体组装检查点相关蛋白表达的影响

任欢欢 杨瑜 徐洪宝 王忠迈 程宗 梁猛 王春景 廖亚平

引用本文:
Citation:

叶酸缺乏对L02细胞增殖、凋亡及纺锤体组装检查点相关蛋白表达的影响

    作者简介: 任欢欢(1994-), 女, 硕士研究生, 检验技师
    通讯作者: 廖亚平, liaoyaping2003@sina.com
  • 基金项目:

    蚌埠医学院研究生创新项目 Byycxz1802

    安徽省大学生创新训练项目 201810367033

    国家级大学生创新训练项目 201910367047

  • 中图分类号: R329.28

Effects of folate deficiency on proliferation, apoptosis and expression of spindle assembly checkpoint-related proteins in L02 cells

    Corresponding author: LIAO Ya-ping, liaoyaping2003@sina.com
  • CLC number: R329.28

  • 摘要: 目的探讨叶酸缺乏对L02细胞增殖、凋亡以及纺锤体组装检查点相关蛋白基因表达的影响及其机制。方法用不同浓度的叶酸(200 nmol/L、20 nmol/L、0 nmol/L)培养L02细胞2周后,用倒置显微镜观察L02细胞形态;流式细胞术检测细胞周期与凋亡;CCK8测定细胞增殖情况;qRT-PCR检测Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表达;Western blotting检测相关蛋白Mad2、Bub1、BubR1的表达。结果与正常对照组相比,叶酸缺乏使L02细胞出现细胞体积变大、形态不规则现象;叶酸缺乏可降低L02细胞活性(P < 0.01),诱导细胞发生S期阻滞(P < 0.05),促进细胞凋亡(P < 0.05),上调Mad2、Bub1、BubR1 mRNA及蛋白水平(P < 0.01)。结论在L02细胞培养中,叶酸浓度为200 nmol/L时导致叶酸缺乏,SAC功能受损,细胞增殖异常,严重缺乏时导致细胞发生凋亡。
  • 图 1  倒置显微镜下各组细胞形态

    图 2  各组细胞凋亡情况

    图 3  不同浓度叶酸培养2周后对SAC蛋白表达的影响

    表 1  引物序列

    名称 引物序列
    β-actin Forward: AAT CTG GCA CCA CAC CT TCT A
    Reverse: ATA GCA CAG CCT GGA TAG CAA
    Mad2 Forward: CGT GCT GCG TCG TTA CTT TT
    Reverse: GCC GAA TGA GAA GAA CTC GG
    Bub1 Forward: TGT CCT TCA ATA CAT ACA GTG GGT
    Reverse: AGG TCA CTG TTG TAC TCA GCA A
    BubR1 Forward: TCA GCG GCT TTC GGA CTG
    Reverse: ACA ATT CAC CAT CTT TTA GCT CAG
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    表 2  不同浓度叶酸培养2周后对细胞增殖能力(OD450值)的影响(x±s)

    分组 n 第13天OD值 第14天OD值 第15天OD值 F P MS组内
    对照组 3 0.26±0.01 0.42±0.04 1.22±0.06 449.439 < 0.01 0.000
    200 nmol/L组 3 0.23±0.01* 0.40±0.04 0.85±0.04** 272.126 < 0.01 0.000
    20 nmol/L组 3 0.21±0.01**## 0.36±0.01* 0.68±0.07**## 96.650 < 0.01 0.002
    0 nmol/L组 3 0.19±0.01**##Δ 0.28±0.01**##Δ 0.50±0.03**##ΔΔ 242.502 < 0.01 0.000
    F 31.77 11.96 104.21
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01
    MS组内 0.000 0.001 0.003
    q检验:与对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与200 nmol/L组比较##P < 0.01;与20 nmol/L组比较ΔP < 0.05,ΔΔP < 0.01
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    表 3  不同浓度叶酸培养2周后对细胞周期的影响(x±s; %)

    分组 n G0/G1期 S期
    对照组 3 65.13±2.25 31.39±0.84
    200 nmol/L组 3 63.23±2.56 34.29±2.50
    20 nmol/L组 3 57.50±0.79**## 39.01±0.16**##
    0 nmol/L组 3 50.03±1.39**##ΔΔ 48.52±1.70**##ΔΔ
    F 39.07 68.55
    P < 0.01 < 0.01
    MS组内 3.539 2.464
    q检验:与对照组比较**P < 0.01;与200 nmol/L组比较##P < 0.01;与20 nmol/L组比较ΔΔP < 0.01
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    表 4  不同浓度叶酸培养2周后对细胞凋亡的影响(x±s; %)

    分组 n 细胞凋亡率
    对照组 3 6.34±0.72
    200 nmol/L组 3 7.78±1.39
    20 nmol/L组 3 10.25±1.44*
    0 nmol/L组 3 16.16±4.13**##ΔΔ
    F 23.64
    P < 0.01
    MS组内 2.382
    q检验:与对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与200 nmol/L组比较##P < 0.01;与20 nmol/L组比较ΔΔP < 0.01
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    表 5  不同浓度叶酸培养2周后对SAC相关基因表达的影响(x±s)

    分组 n Mad2 Bub1 BubR1
    对照组 3 1.00±0.01 1.00±0.01 1.02±0.03
    200 nmol/L组 3 1.54±0.13** 1.48±0.09* 3.5±0.84**
    20 nmol/L组 3 2.59±0.23**## 2.10±0.42**# 4.02±0.53**
    0 nmol/L组 3 3.28±0.26**## 2.22±0.23**## 4.62±0.41**#
    F 91.23 16.32 26.01
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01
    MS组内 0.034 0.059 0.289
    q检验:与对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与200 nmol/L组比较#P < 0.05,##P < 0.01
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    表 6  不同浓度叶酸培养2周后对SAC相关蛋白表达的影响(x±s)

    分组 n Mad2 Bub1 BubR1
    对照组 3 0.54±0.03 0.77±0.06 0.54±0.03
    200 nmol/L组 3 0.90±0.07** 1.23±0.09* 1.06±0.07**
    20 nmol/L组 3 1.05±0.06**# 1.37±0.17** 1.13±0.11**
    0 nmol/L组 3 0.97±0.06** 1.38±0.30** 1.35±0.16**#Δ
    F 48.80 7.44 31.99
    P < 0.01 < 0.05 < 0.01
    MS组内 0.003 0.033 0.011
    q检验:与对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与200 nmol/L组比较#P < 0.05;与20 nmol/L组比较ΔP < 0.05
    下载: 导出CSV
  • [1] GUO X, NI J, ZHU Y, et al. Folate deficiency induces mitotic aberrations and chromosomal instability by compromising the spindle assembly checkpoint in cultured human colon cells[J]. Mutagenesis, 2017, 32(6): 547. doi: 10.1093/mutage/gex030
    [2] WANG X, FENECH M. A comparison of folic acid and 5-methyltetrahydrofolate for prevention of DNA damage and cell death in human lymphocytes in vitro[J]. Mutagenesis, 2003, 18(1): 81. doi: 10.1093/mutage/18.1.81
    [3] COURTEMANCHE C, HUANG A, ELSON-SCHWAB I, et al. Folate deficiency and ionizing radiation cause DNA breaks in primary human lymphocytes: a comparison[J]. FASEB J, 2004, 18(1): 209. doi: 10.1096/fj.03-0382fje
    [4] LIANG Y, LI Y, LI Z, et al. Mechanism of folate deficiency-induced apoptosis in mouse embryonic stem cells: Cell cycle arrest/apoptosis in G1/G0 mediated by microRNA-302a and tumor suppressor gene Lats2[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2012, 44(11): 1750. doi: 10.1016/j.biocel.2012.07.014
    [5] YANG Y, LI X, SUN Q, et al. Folate deprivation induces cell cycle arrest at G0/G1 phase and apoptosis in hippocampal neuron cells through down-regulation of IGF-1 signaling pathway[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2016, 79: 222. doi: 10.1016/j.biocel.2016.08.040
    [6] ALARCON-VARGAS D, RONAI Z. P53-Mdm2-the affair that never ends[J]. Carcinogenesis, 2002, 23(4): 541. doi: 10.1093/carcin/23.4.541
    [7] MICHEL L, LIBERAL V, CHATTERJEE A, et al. MAD2 haplo insufficiency causes premature anaphase and chromosome instability in mammalian cell[J]. Nature, 2001, 409(6818): 355. doi: 10.1038/35053094
    [8] BABU JR, JEGANATHAN KB, BAKER DJ, et al. Rae1 is an essential mitotic checkpoint regulator that cooperates with Bub3 to prevent chromosome missegregation[J]. J Cell Biol, 2003, 160(3): 341. doi: 10.1083/jcb.200211048
    [9] BASU J, BOUSBAA H, LOGARINHO E, et al. Mutations in the essential spindle checkpoint gene bub1 cause chromosome missegregation and fail to block apoptosis in Drosophlia[J]. Cell Biol, 1999, 146(1): 13. doi: 10.1083/jcb.146.1.13
    [10] DOBLES M, LIBERAL V, SCOTT M, et al. Chromosome missegregation and apoptosis in mice lacking the mitotic checkpoint protein mad2[J]. Cell, 2000, 101(6): 635. doi: 10.1016/S0092-8674(00)80875-2
    [11] BAKER DJ, JEGANATHAN KB, CAMERON JD, et al. BubR1 insufficiency causes early onset of aging-associated phenotypes and infertility in mice[J]. Nat Genet, 2004, 36(7): 744. doi: 10.1038/ng1382
    [12] SCHLIEKELMAN M, COWLEY DO, O'QUINN R, et al. Impaired Bub1 function in vivo compromises tension-dependent checkpoint function leading to aneuploidy and tumorigenesis[J]. Cancer Res, 2009, 69(1): 45. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-07-6330
    [13] WANG L, WANG J, JIN Y, et al. Downregulation of Mad2 and BubR1 increase the malignant potential and nocodazole resistance by compromising spindle assembly checkpoint signaling pathway in cervical carcinogenesis[J]. J Obstet Gynaecol Res, 2019, 45(12): 2407. doi: 10.1111/jog.14120
    [14] WANG L, YIN F, DU Y, et al. Depression of MAD2 inhibits apoptosis and increases proliferation and multidrug resistance in gastric cancer cells by regulating the activation of phosphorylated survivin[J]. Tumour Biol, 2010, 31(3): 225. doi: 10.1007/s13277-010-0036-6
    [15] ROWALD K, MANTOVAN M, PASSOS J, et al. Negative selection and chromosome instability induced by mad2 overexpression delay breast cancer but facilitate oncogene-independent outgrowth[J]. Cell Rep, 2016, 15(12): 2679. doi: 10.1016/j.celrep.2016.05.048
    [16] CHUNG K, CHOI H, SHIN J, et al. 6, 7-Dimethoxy-3-(3-methoxyphenyl) isoquinolin-1-amine induces mitotic arrest and apoptotic cell death through the activation of spindle assembly checkpoint in human cervical cancer cells[J]. Carcinogenesis, 2013, 34(8): 1852. doi: 10.1093/carcin/bgt133
    [17] DAS T, ROY KS, CHAKRABARTI T, et al. Withaferin A modulates the Spindle assembly checkpoint by degradation of Mad2-Cdc20 complex in colorectal cancer cell lines[J]. Biochem Pharmacol, 2014, 91(1): 31. doi: 10.1016/j.bcp.2014.06.022
    [18] XU B, XU T, LIU H, et al. MiR-490-5p suppresses cell proliferation and invasion by targeting bub1 in hepatocellular carcinoma cells[J]. Pharmacology, 2017, 100(5/6): 269.
    [19] TILSTON V, TAYLOR SS, PERERA D. Inactivating the spindle checkpoint kinase Bub1 during embryonic development results in a global shutdown of proliferation[J]. BMC Res Notes, 2009, 2: 190. doi: 10.1186/1756-0500-2-190
  • [1] 唐乃秀刘靖张广兰常红侠王瑞 . 叶酸预防妊娠期妇女巨幼红细胞性贫血和胎儿神经管缺陷的调查分析. 蚌埠医学院学报, 2013, 37(11): 1485-1487.
    [2] 陈辰王双燕夏玉军 . Kif15调控大鼠星形胶质细胞增殖、细胞周期及凋亡的研究. 蚌埠医学院学报, 2018, 43(1): 8-12. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2018.01.003
    [3] 许培权郭伟龚建平 . 二甲基亚砜诱导HL-60细胞分化的细胞周期时相性研究. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(6): 661-664.
    [4] 夏俊陈俊霞盛甫秀崔秀云 . As2O3诱导人膀胱癌BIU-87细胞株凋亡及其对细胞周期的影响. 蚌埠医学院学报, 2005, 30(1): 11-13.
    [5] 周蕾于东红王萍承泽农 . 舒林酸对胃癌细胞株BGC-823作用的实验研究. 蚌埠医学院学报, 2007, 32(2): 132-135.
    [6] 廖亚平鲍明升梁玉华 . 叶酸代谢相关基因多态性与Down综合征发生的关系. 蚌埠医学院学报, 2009, 34(10): 949-951.
    [7] 徐萍芳宋丽娟姜衡 . 缬沙坦联合叶酸在社区老年H型高血压患者中的疗效观察. 蚌埠医学院学报, 2015, 40(6): 727-729. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2015.06.009
    [8] 刘峰刘辉郝继东王伟峰万建省 . 奥曲肽对人前列腺癌细胞生长周期的作用. 蚌埠医学院学报, 2013, 37(7): 792-794.
    [9] 张菊香 . 高血压与冠心病病人血清同型半胱氨酸、叶酸及维生素B12检测的临床应用. 蚌埠医学院学报, 2018, 43(6): 801-803. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2018.06.029
    [10] 仇冬霞 . 不同基因型H型高血压病人血压和血浆同型半胱氨酸水平比较及补充叶酸对其的影响. 蚌埠医学院学报, 2019, 44(12): 1601-1604. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2019.12.007
    [11] 潘丹丹申庆文 . 血清同型半胱氨酸、叶酸及维生素B12在子痫前期病人中的表达及其相关性分析. 蚌埠医学院学报, 2022, 47(5): 624-626. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2022.05.016
    [12] 董文红褚强强章车明张尧吴政治 . 高血压病人同型半胱氨酸与MTHFR 677C/T基因多态性相关性研究及不同剂量叶酸干预效果评价. 蚌埠医学院学报, 2022, 47(3): 334-336. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2022.03.015
    [13] 赵锐盛以芸朱光能丁淑琴李友建夏俊 . occludin蛋白与人乳腺癌细胞恶性增殖的相关性研究. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(9): 925-930.
    [14] 周蕾俞岚于东红王萍 . 姜黄素对人胃癌BGC-823细胞体外生长的影响. 蚌埠医学院学报, 2012, 36(5): 509-511,515.
    [15] 蒋永波李庆文 . 膀胱移行细胞癌组织中S期激酶相关蛋白2的表达及临床意义. 蚌埠医学院学报, 2012, 36(3): 274-276.
    [16] 高洁丁淑琴邓蓉郭普张伦军黄桦 . 奥沙利铂通过p53信号通路抑制肝癌细胞增殖的机制研究. 蚌埠医学院学报, 2018, 43(8): 984-988. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2018.08.002
    [17] 唐晓燕夏俊张克昌陈俊霞崔秀云 . 转染人核糖核酸酶抑制因子对乳腺癌细胞增殖的抑制作用. 蚌埠医学院学报, 2009, 34(1): 5-8.
    [18] 傅毅陈生弟马飞月 . 脑血管病患者血浆同型半胱氨酸浓度及相关因素分析. 蚌埠医学院学报, 2004, 29(2): 151-153.
    [19] 赵宏张成斌 . 缺血性脑卒中与血浆同型半胱氨酸水平关系的临床研究. 蚌埠医学院学报, 2014, 38(3): 307-309.
    [20] 庞国庆 . 血清同型半胱氨酸水平与急性脑梗死相关性分析. 蚌埠医学院学报, 2016, 41(7): 900-902,905. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.07.020
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-10-30
  • 录用日期:  2020-09-01
  • 刊出日期:  2021-05-15

叶酸缺乏对L02细胞增殖、凋亡及纺锤体组装检查点相关蛋白表达的影响

    通讯作者: 廖亚平, liaoyaping2003@sina.com
    作者简介: 任欢欢(1994-), 女, 硕士研究生, 检验技师
  • 1. 蚌埠医学院 生命科学学院, 安徽 蚌埠 233030
  • 2. 安徽省阜阳市第五人民医院 检验科, 236015
基金项目:  蚌埠医学院研究生创新项目 Byycxz1802安徽省大学生创新训练项目 201810367033国家级大学生创新训练项目 201910367047

摘要: 目的探讨叶酸缺乏对L02细胞增殖、凋亡以及纺锤体组装检查点相关蛋白基因表达的影响及其机制。方法用不同浓度的叶酸(200 nmol/L、20 nmol/L、0 nmol/L)培养L02细胞2周后,用倒置显微镜观察L02细胞形态;流式细胞术检测细胞周期与凋亡;CCK8测定细胞增殖情况;qRT-PCR检测Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表达;Western blotting检测相关蛋白Mad2、Bub1、BubR1的表达。结果与正常对照组相比,叶酸缺乏使L02细胞出现细胞体积变大、形态不规则现象;叶酸缺乏可降低L02细胞活性(P < 0.01),诱导细胞发生S期阻滞(P < 0.05),促进细胞凋亡(P < 0.05),上调Mad2、Bub1、BubR1 mRNA及蛋白水平(P < 0.01)。结论在L02细胞培养中,叶酸浓度为200 nmol/L时导致叶酸缺乏,SAC功能受损,细胞增殖异常,严重缺乏时导致细胞发生凋亡。

English Abstract

  • 纺锤体组装检查点(spindle assembly checkpoint,SAC)是细胞周期调控中的众多检查点之一,有助于维持细胞有丝分裂期间基因组稳定性,SAC结构功能异常是导致染色体不稳定性与非整倍体的重要原因之一,Mad2、Bub1、BubR1是SAC中的关键组分。

    叶酸是一碳代谢循环中重要的甲基供体,在DNA合成、稳定性及修复中起关键作用。其缺乏会导致DNA损伤、染色体和基因组不稳定等。叶酸缺乏会对损坏SAC网络,从而致使细胞发生有丝分裂异常与非整倍性[1],但是非整倍体发生的机制尚不明确且叶酸缺乏对SAC影响的报道较少。本研究通过探索不同浓度叶酸对L02细胞增殖、凋亡及Mad2、Bub1、BubR1 mRNA及蛋白水平的影响,并讨论可能的作用机制。

    • L02细胞(武汉普诺赛细胞库);无叶酸RPMI-1640培养基、胎牛血清(Gibco公司);叶酸粉末(Sigma公司);Annexin V-FITC/PI试剂盒、细胞周期试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液、PMSF(江苏碧云天生物有限公司);Mad2、Bub1、BubR1抗体(美国Bethyl公司);β-actin抗体(Cell Signaling Technology公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(武汉博士德生物工程有限公司);荧光定量PCR试剂盒(Takara公司);Mad2、Bub1、BubR1引物(上海生工生物有限公司)。

    • 将L02细胞培养于含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中。将细胞分为正常对照组和不同浓度叶酸组(分别给予200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L叶酸处理2周)。

    • 倒置显微镜下观察不同浓度叶酸培养2周后的L02细胞形态。

    • 将培养第12天的L02细胞按3.0×103个/孔接种于96孔板,各组3孔,过夜贴壁后,每孔加入10 μL CCK8试剂后置于培养箱中培养2 h,并于450 mm处检测吸光度(OD)值。

    • 将培养2周的L02细胞以5×105个/mL接种于6孔板中,收集细胞;按照说明书进行PI染色,流式细胞仪上机检测。

    • 将培养2周的L02细胞以5×105个/mL接种于6孔板中,收集细胞;按照说明书进行Annexin V-FITC/PI进行染色,流式细胞仪上机检测。

    • 收集各组细胞,TRIzol法提取细胞总RNA,按照Takara的反转录试剂盒合成cDNA,PCR扩增Mad2、Bub1、BubR1。根据GenBank上公布的人类Mad2、Bub1、BubR1序列,应用Primer Primer5软件设计引物,由上海生工生物工程公司合成(见表 1)。同一标本β-actin作为内参照,采用2-ΔΔCT法进行相对定量分析。qRT-PCR的反应条件: 95 ℃ 15 s,60 ℃ 34 s,72 ℃ 30 s,40个循环。

      名称 引物序列
      β-actin Forward: AAT CTG GCA CCA CAC CT TCT A
      Reverse: ATA GCA CAG CCT GGA TAG CAA
      Mad2 Forward: CGT GCT GCG TCG TTA CTT TT
      Reverse: GCC GAA TGA GAA GAA CTC GG
      Bub1 Forward: TGT CCT TCA ATA CAT ACA GTG GGT
      Reverse: AGG TCA CTG TTG TAC TCA GCA A
      BubR1 Forward: TCA GCG GCT TTC GGA CTG
      Reverse: ACA ATT CAC CAT CTT TTA GCT CAG

      表 1  引物序列

    • 收集各组细胞,用RIPA裂解液进行裂解,BCA蛋白定量后调整蛋白浓度,取适量蛋白进行SDS-PAGE电泳。电转到PVDF膜,用5%脱脂牛奶封闭室温封闭2 h。室温孵育一抗Mad2、Bub1和BubR1(1∶ 1 000稀释)1 h,洗膜3次,室温孵育相应二抗1 h,细洗膜3次。ECL显色后置于凝胶成像仪中曝光,Image J进行灰度值分析。

    • 采用方差分析和q检验。

    • 与正常对照组相比,20 nmol/L与0 nmol/L叶酸培养2周后,细胞体积增大、形态不规则,0 nmol/L叶酸组现象更加显著(见图 1)。

      图  1  倒置显微镜下各组细胞形态

    • 与正常对照组相比,200 nmol/L、20 nmol/L组与0 nmol/L细胞活性明显降低(P < 0.01);与200 nmol/L相比,20 nmol/L与0 nmol/L组细胞活性明显降低(P < 0.01)(见表 2)。

      分组 n 第13天OD值 第14天OD值 第15天OD值 F P MS组内
      对照组 3 0.26±0.01 0.42±0.04 1.22±0.06 449.439 < 0.01 0.000
      200 nmol/L组 3 0.23±0.01* 0.40±0.04 0.85±0.04** 272.126 < 0.01 0.000
      20 nmol/L组 3 0.21±0.01**## 0.36±0.01* 0.68±0.07**## 96.650 < 0.01 0.002
      0 nmol/L组 3 0.19±0.01**##Δ 0.28±0.01**##Δ 0.50±0.03**##ΔΔ 242.502 < 0.01 0.000
      F 31.77 11.96 104.21
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01
      MS组内 0.000 0.001 0.003
      q检验:与对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与200 nmol/L组比较##P < 0.01;与20 nmol/L组比较ΔP < 0.05,ΔΔP < 0.01

      表 2  不同浓度叶酸培养2周后对细胞增殖能力(OD450值)的影响(x±s)

    • 与正常对照组相比,200 nmol/L组细胞G1/G0期、S期均值差异无统计学意义(P>0.05);20 nmol/L组和0 nmol/L组细胞G1/G0期明显降低(P < 0.01)、S期明显升高(P < 0.01)。与200 nmol/L相比,20 nmol/L组和0 nmol/L组细胞G1/G0期明显降低(P < 0.01)、S期明显升高(P < 0.01)。与20 nmol/L组相比,0 nmol/L组S期明显增加、G1/G0期明显减少(P < 0.01)(见表 3)。

      分组 n G0/G1期 S期
      对照组 3 65.13±2.25 31.39±0.84
      200 nmol/L组 3 63.23±2.56 34.29±2.50
      20 nmol/L组 3 57.50±0.79**## 39.01±0.16**##
      0 nmol/L组 3 50.03±1.39**##ΔΔ 48.52±1.70**##ΔΔ
      F 39.07 68.55
      P < 0.01 < 0.01
      MS组内 3.539 2.464
      q检验:与对照组比较**P < 0.01;与200 nmol/L组比较##P < 0.01;与20 nmol/L组比较ΔΔP < 0.01

      表 3  不同浓度叶酸培养2周后对细胞周期的影响(x±s; %)

    • 与正常对照组相比,200 nmol/L组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);20 nmol/L组细胞发生凋亡(P < 0.05),0 nmol/L组细胞明显发生凋亡(P < 0.01)。与200 nmol/L相比,20 nmol/L组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05),0 nmol/L组凋亡率明显增加(P < 0.01)。与20 nmol/L组相比,0 nmol/L组凋亡率明显增加(P < 0.01)(见图 2表 4)。

      图  2  各组细胞凋亡情况

      分组 n 细胞凋亡率
      对照组 3 6.34±0.72
      200 nmol/L组 3 7.78±1.39
      20 nmol/L组 3 10.25±1.44*
      0 nmol/L组 3 16.16±4.13**##ΔΔ
      F 23.64
      P < 0.01
      MS组内 2.382
      q检验:与对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与200 nmol/L组比较##P < 0.01;与20 nmol/L组比较ΔΔP < 0.01

      表 4  不同浓度叶酸培养2周后对细胞凋亡的影响(x±s; %)

    • 与正常对照组相比,叶酸浓度为200 nmol/L时,Bub1 mRNA的表达量增加(P < 0.05), Mad2和BubR1 mRNA的表达量明显增加(P < 0.01);叶酸浓度为20 nmol/L及0 nmol/L时,Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表达量均明显增加(P < 0.01)(见表 5)。

      分组 n Mad2 Bub1 BubR1
      对照组 3 1.00±0.01 1.00±0.01 1.02±0.03
      200 nmol/L组 3 1.54±0.13** 1.48±0.09* 3.5±0.84**
      20 nmol/L组 3 2.59±0.23**## 2.10±0.42**# 4.02±0.53**
      0 nmol/L组 3 3.28±0.26**## 2.22±0.23**## 4.62±0.41**#
      F 91.23 16.32 26.01
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01
      MS组内 0.034 0.059 0.289
      q检验:与对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与200 nmol/L组比较#P < 0.05,##P < 0.01

      表 5  不同浓度叶酸培养2周后对SAC相关基因表达的影响(x±s)

    • 与正常对照组相比,200 nmol/L组Bub1蛋白表达量增加(P < 0.05),20 nmol/L、0 nmol/L组Bub1蛋白表达量明显增加(P < 0.01);200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L组Mad2和BubR1蛋白表达量均明显增加(P < 0.01)(见图 3表 6)。

      图  3  不同浓度叶酸培养2周后对SAC蛋白表达的影响

      分组 n Mad2 Bub1 BubR1
      对照组 3 0.54±0.03 0.77±0.06 0.54±0.03
      200 nmol/L组 3 0.90±0.07** 1.23±0.09* 1.06±0.07**
      20 nmol/L组 3 1.05±0.06**# 1.37±0.17** 1.13±0.11**
      0 nmol/L组 3 0.97±0.06** 1.38±0.30** 1.35±0.16**#Δ
      F 48.80 7.44 31.99
      P < 0.01 < 0.05 < 0.01
      MS组内 0.003 0.033 0.011
      q检验:与对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与200 nmol/L组比较#P < 0.05;与20 nmol/L组比较ΔP < 0.05

      表 6  不同浓度叶酸培养2周后对SAC相关蛋白表达的影响(x±s)

    • 相关实验研究显示[2]叶酸浓度为120 nmol/L时便可维持人淋巴细胞基因组结构稳定,因此本实验选取略高于基因组稳定的叶酸浓度即200 nmol/L、20 nmol/L、0 nmol/L作为实验组。CCK8结果显示叶酸浓度为200 nmol/L、20 nmol/L、0 nmol/L时叶酸增殖受到了明显抑制,细胞周期与凋亡结果显示,叶酸浓度为200 nmol/L时,L02细胞G1/G0期、S期及凋亡率均值与正常对照组差异无统计学意义。叶酸浓度为20 nmol/L、0 nmol/L细胞发生S期阻滞,凋亡数量增多,且叶酸浓度越低S期阻滞越明显、细胞凋亡数量越多。COURTEMANCHE等[3]的研究显示叶酸缺乏可以降低细胞增殖,诱导凋亡和细胞周期阻滞,本研究与上述研究结果相符合。LIANG等[4-5]研究表明叶酸缺乏诱导细胞发生G1/G0期阻滞,从而导致细胞发生凋亡,在G1/G0期阻滞与凋亡之间建立了联系。HUANG等[6]研究结果显示在叶酸缺乏的培养基中HepG2细胞叶酸浓度较低,细胞在S期积累随后发生G2/M期阻滞,进而诱导细胞发生凋亡。低叶酸缺诱导的DNA的损伤程度具有凋亡反应,这是叶酸缺乏引起细胞凋亡的原因之一。本研究中,当叶酸浓度为20 nmol/L、0 nmol/L时细胞发生S期阻滞,进而诱导细胞发生凋亡。本研究与上述研究结果有所不同,本研究结果显示叶酸缺乏时细胞发生S期阻滞,我们认为差生差异的原因可能是由于所用细胞系、培养细胞时间不同造成的。

      SAC作为细胞周期检查点对于维持细胞周期正常进行至关重要,Bub1参与染色体排列,Mad2和BubR1通过结合底物CDC20,阻止CDC20激活APC/C以达到抑制APC/C的效果,防止细胞提前进入后期。SAC作为细胞周期的监控机制,其某些成分的异常表达会使SAC功能发生改变,导致染色体不稳定和非整倍体。对果蝇和小鼠的研究均证实了SAC在维持染色体稳定方面的重要性[7-11],在SAC发生突变的细胞中,有丝分裂错误的发生率很高,导致非整倍体细胞的比例急剧增加[11-12]。在一项宫颈癌研究中[13]发现,下调Mad2和BubR1可以促进SiHa细胞增长,增强细胞侵袭和迁移能力,抑制细胞凋亡,降低药物治疗作用[13]。并且下调Mad2可以通过调控磷酸化survivin的活化,调控胃癌细胞周期,增加增殖,提高胃癌细胞的耐药性[14]。另一项对乳腺癌研究[15]中,与KrasG12D或Her2同时在成年小鼠乳腺中过表达有丝分裂检查点蛋白Mad2,会导致有丝分裂检查点过度激活,过早的Mad2表达会导致强烈的有丝分裂停止和细胞死亡增加。用特异性的小干扰RNA敲低纺锤体检查点蛋白BubR1或Mad2,可显著减少6, 7-二甲氧基-3-(3-甲氧基苯基)异喹啉-1-胺(CWJ-082)诱导的有丝分裂细胞积累和凋亡[16]。印度的一项药物研究[17]也显示,过表达的Mad2通过恢复适当的后期启动和维持更多的细胞存活,部分地挽救了药物的有害作用。在肝细胞性癌组织和细胞中,miR-490-5p的过表达或Bub1的过表达抑制了肝细胞性癌细胞的增殖、迁移、侵袭,增加了凋亡率[18]。缺少Bub1的小鼠胚胎成纤维细胞不能使其染色体对齐或维持SAC功能[19]。本研究结果显示,叶酸浓度为200 nmol/L、20 nmol/L和0 nmol/L时Mad2、Bub1、BubR1 mRNA的表达量明显增加,Western blotting检测也显示在蛋白水平上Mad2、Bub1、BubR1表达量明显增加。

      结合上述研究和实验结果我们得出这样一个结论:对于SAC来说叶酸浓度为200 nmol/L已经达到一种缺乏状态,Mad2、Bub1、BubR1的高表达用于增加SAC的活性,可以维持细胞有丝分裂进行,避免细胞发生凋亡。当叶酸极度缺乏时(20 nmol/L和0 nmol/L),SAC功能活性受到了严重损害,Mad2、Bub1、BubR1的高表达不足以维持其正常活性,有丝分裂出现异常,可能导致非整倍体及染色体不稳定的发生,使得细胞增殖受到抑制,细胞周期发生阻滞,诱导细胞发生凋亡。综上所述,本研究结果显示,对于L02细胞来说叶酸浓度为200 nmol/L时已经达到一种缺乏状态,叶酸缺乏时SAC功能异常,可能是阻碍细胞增殖、诱导凋亡的原因。

参考文献 (19)

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