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胃癌是最常见的癌症类型之一，根据国际癌症研究机构的统计数据，2020年全世界胃癌新发病例占恶性肿瘤发病人数的第5位，死亡病例居恶性肿瘤死亡人数的第4位，其中43.9% 发病病例和48.6% 死亡病例发生在中国[1]。根据我国最新胃癌流行病学调查数据显示，2003-2015年胃癌年龄标化生存率虽然均呈不同程度增加，但仍显著低于日本和韩国[2]。目前胃癌仍以手术治疗为主，临床亟需寻找安全有效的治疗靶点并了解其对胃癌的作用机制至关重要，是目前研究关注的热点。
大黄酚是中药大黄的主要活性成分之一，是一种天然蒽醌类化合物。研究[3-6]证实，大黄酚通过诱导、调节多条信号转导通路如核因子κB、活性氧、蛋白激酶B、细胞外调节蛋白激酶等发挥抗肿瘤作用。我们先前研究[7]也表明大黄酚可通过靶向核心蛋白聚糖(decorin，DCN)抑制结直肠癌细胞活性。然而，大黄酚治疗胃癌的潜在分子机制仍然知之甚少。NLRP3炎症小体是一种由NLRP3、ASC和caspase-1组成的细胞质复合物，通过触发caspase-1、白细胞介素(IL)-1β和IL-18的成熟以执行炎症反应。目前研究发现NLRP3炎症小体在肿瘤的发生和发展中起着重要作用[8]，这可能与NLRP3炎症小体的另一个关键作用触发焦亡相关[9]。本研究通过观察大黄酚对胃癌细胞焦亡的影响，并进一步探讨在此过程中大黄酚对NLRP3炎症小体的调控作用及其机制，以期为其在胃癌治疗中的潜在价值提供理论基础。
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人胃癌细胞株MKN28(中国医学科学院，北京)；大黄酚[纯度≥98.0%(HPLC), Sigma-Aldrich, 美国]; DMEM培养基和胎牛血清(Gibco，美国); 二甲基亚砜(DMSO)(久亿化学试剂有限公司，中国); FAM-FLICA caspase-1试剂盒(ImmunoChemistry Technologies，美国); 乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(建成生物科技有限公司，中国); NLRP3、cleaved caspase-1、supernatant IL-1β、lysate IL-1β和IL-1β(Abcam, Shanghai, 美国)；Trizol(Invitrogen)；PrimeScript TM RT试剂盒(Applied Biosystems，USA)。
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将人胃癌细胞株MKN28细胞培养于DMEM培养基(含10%胎牛血清-青链霉素双抗溶液)。置于5%CO2、37 ℃的培养箱内培养。每隔2~3 d传代1次，取对数生长期的细胞进行实验。用DMSO将大黄酚制成储备溶液，使用生长培养基稀释成系列浓度(2、5和10 μmol/L)。以含有0.1%DMSO的正常生长培养基作为对照。
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取对数生长期细胞, 0.25%胰蛋白酶消化离心后，以0.5×104个/孔的密度铺于96孔板中。处理组用含有不同浓度大黄酚(0、2、5、10 μmol/L)的培养基，空白对照组加入等量DMEM培养液。在37 ℃的5% CO2的培养箱中培养24 h或48 h。采用CCK-8检测不同浓度大黄酚、不同处理时间(24、48 h)的细胞增殖活力。于各时间点每孔加入10 μL CCK8试剂并置于37 ℃孵育4 h，用酶标仪测定450 nm波长处各孔的吸光度值(OD450)。每个处理组设3个平行孔，另设阴性对照和空白调零孔。存活率(%)=[OD450处理组-OD450空白组]/[OD450对照组-OD450空白组]×100%。以时间为横坐标, 细胞存活率为纵坐标, 绘制细胞生长曲线。
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MKN28细胞以1 000个/孔接种于6孔板中，37 ℃孵育24 h后，以不同浓度的大黄酚(0、5和10 μmol/L)培养细胞2周，期间每隔3 d更换1次含有大黄酚的培养液。2周后，弃去培养基，PBS洗涤细胞1次，4%多聚甲醛室温固定20 min，然后用0.1%的结晶紫室温染色30 min，PBS洗涤细胞3次之后，于倒置显微镜下观察并拍照，Image-Pro Plus计数各组克隆数，细胞数>15个计为1个克隆。
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将细胞传代至6孔板，待细胞贴壁后更换含有不同浓度大黄酚(0、5和10 μmol/L)的培养液培养12 h。使用胰酶消化、离心收集细胞制备成单细胞悬液，随后参照FAM-FLICA caspase-1分析试剂盒说明，对细胞中活化的caspase-1和碘化丙啶(PI)进行双阳性染色来评估细胞凋亡。每组设3个重复组，同时以DMSO作为对照组。
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将MKN28细胞在24孔培养板中孵育，并进行如下分组：含0.1%DMSO的培养基组(对照组)，不经caspase-1选择性抑制剂VX-765 (10 nmol/L) 或NLRP3选择性抑制剂MCC950 (100 nmol/L)预处理的5 μmol/L和10 μmol/L大黄酚组，经VX-765(10 nmol/L) 或MCC950 (100 nmol/L)预处理的5 μmol/L和10 μmol/L大黄酚组，抑制剂对照组。使用酶标仪检测吸光值并计算LDH释放率。
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细胞处理结束后，PBS清洗并用胰酶消化，收集细胞沉淀，用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后将蛋白煮沸12 min变性。以20 μg蛋白上样至10%的聚丙烯酰胺凝胶，通过SDSPAGE将蛋白混合样分离。再250 mA转膜2 h，用5%脱脂牛奶封闭90 min，TBST清洗3次，每次5 min。加入特异性一抗，4 ℃摇床孵育过夜，TBST清洗4次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，TBST清洗4次，每次10 min。以GAPDH为内参照，ECL曝光显影。
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Trizol法提取总RNA，逆转录获得cDNA。采用qRT-PCR检测各组细胞NLRP3、cleaved caspase-1和IL-1β的mRNA表达，引物序列见表 1。qRT-PCR反应体系和反应程序参照说明书。β-actin基因作为内参对照。每组NLRP3、cleaved caspase-1、IL-1β基因的相对表达量按2-△△Ct法计算。
基因 引物序列(5′-3′) NLRP3 正向CGG TGA CCT TGT GTG TGC TT 反向TCA TGT CCT GAG CCA TGG AAG caspase-1 正向GAA CAA AGA AGG TGG CGC AT 反向AGA CGT GTA CGA GTG GGT CT IL-1β 正向CCT ATG TCT TGC CCG TGG AG 反向CAC ACA CTA GCA GGT CGT CA β-action 正向TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG 反向GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG 表 1 引物序列
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采用t检验、方差分析和q检验。
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大黄酚(2、5和10 μmol/L)处理MKN28细胞24 h时，大黄酚以剂量和时间依赖的方式降低细胞活性(P < 0.01)；48 h后与0 μmol/L组比较，大黄酚2 μmol/L和5 μmol/L浓度细胞活性降低(P < 0.01)，10 μmol/L浓度时又恢复到0 μmol/L水平(P>0.05)(见表 2)。克隆形成实验结果显示，大黄酚处理后抑制了MKN28细胞的集落形成能力(P < 0.01)(见表 3)。
大黄酚浓度/ (μmol/L) n 24 h存活率/% 48 h存活率/% t P 0 6 99.52±1.6 85.32±1.6 15.37 < 0.01 2 6 92.42±3.9** 62.28±1.9** 17.02 < 0.01 5 6 71.44±2.9**△△ 47.36±1.6**△△ 17.81 < 0.01 10 6 62.34±1.9**△△ ## 85.28±1.6△△ ## 22.62 < 0.01 F — 244.98 737.17 — — P — < 0.01 < 0.01 — — MS组内 — 7.448 2.823 — — q检验：与同期0 μmol/L组相比**P < 0.01；与同期2 μmol/L组比较△△P < 0.01;与同期5 μmol/L组比较## P < 0.01 表 2 大黄酚对MKN28细胞增殖活性的影响(x±s)
大黄酚浓度/(μmol/L) n 克隆数目 0 6 129.32±3.6 5 6 97.52±3.8** 10 6 81.38±2.8**△△ F — 202.61 P — < 0.01 MS组内 — 11.747 q检验：与0 μmol/L比较**P < 0.01；与5 μmol/L组比较△△P < 0.01 表 3 大黄酚对MKN28细胞克隆形成能力的影响(x±s)
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大黄酚可引起细胞形态改变，包括细胞密度降低、细胞变圆和细胞漂浮(见图 1)。流式细胞仪检测caspase-1和PI阳性细胞百分率，结果显示与0 μmol/L大黄酚组相比，5 μmol/L和10 μmol/L大黄酚组caspase-1活化细胞数逐渐升高，呈剂量依赖性(F=221.47, P < 0.01)(见图 2)。
图 1 不同浓度大黄酚处理MKN28细胞细胞形态变化
图 2 流式细胞术检测不同浓度大黄酚处理MKN28细胞凋亡情况(caspase-1和PI染色)
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与0 μmol/L组相比，5 μmol/L和10 μmol/L大黄酚组，MKN28细胞NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA表达水平均明显升高(P < 0.01)(见表 4)；NLRP3、cleaved caspase-1、上清IL-1β、裂解IL-1β的蛋白水平均明显升高(P < 0.01)(见表 5)。
大黄酚浓度/ (μmol/L) n NLRP3 caspase-1 IL-1β 0 6 1.03±0.06 1.06±0.06 1.04±0.04 5 6 1.44±0.15** 1.36±0.09** 2.26±0.16** 10 6 2.56±0.19**△△ 2.28±0.12**△△ 3.69±0.28**△△ F — 181.51 278.71 299.88 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.021 0.009 0.035 q检验：与0 μmol/L比较**P < 0.01；与5 μmol/L组比较△△P < 0.01 表 4 大黄酚对MKN28细胞中NLRP3、caspase-1及IL-1β的mRNA表达量的影响(x±s)
大黄酚浓度/ (μmol/L) n NLRP3 cleaved caspase-1 IL-1β (上清) IL-1β (裂解) 0 6 1.03±0.06 1.06±0.06 1.04±0.04 1.06±0.02 5 6 1.44±0.15** 1.36±0.09** 2.26±0.16** 2.92±0.26** 10 6 2.56±0.19**△△ 2.28±0.12**△△ 3.89±0.28**△△ 3.29±0.32**△ F — 181.51 278.71 348.52 150.87 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.021 0.009 0.035 0.057 q检验：与0 μmol/L比较**P < 0.01；与5 μmol/L组比较△△P < 0.01 表 5 大黄酚对MKN28细胞中NLRP3、caspase-1及IL-1β的蛋白表达量的影响(x±s)
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与大黄酚(10 μmol/L)组比较，大黄酚(10 μmol/L)+VX-765组的MKN28细胞中LDH释放和caspase-1活化细胞数均降低(P < 0.01)(见表 6)，IL-1β的mRNA表达和上清IL-1β、裂解IL-1β的蛋白表达均下降(P < 0.01)(见表 7)。
分组 n LDH/% 双染细胞比例/% 对照组 6 15.02±0.26 1.06±0.06 VX-765(10 μmol/L) 6 12.44±0.98** 1.36±0.04 大黄酚(10 μmol/L) 6 52.24±1.24**△△ 13.52±0.76**△△ 大黄酚+VX-765 6 25.56±0.19**△△ ## 6.52±0.12**△△ ## F — 3052.68 1368.53 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.650 0.149 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与VX-765(10 μmol/L)组比较△△P < 0.01;与大黄酚(10 μmol/L)组比较## P < 0.01 表 6 caspase-1抑制剂VX-765对大黄酚诱导细胞LDH释放及caspase-1/PI双染阳性细胞比例的影响(x±s)
分组 n IL-1β mRNA IL-1β蛋白(上清) IL-1β蛋白(裂解) 对照组 6 1.04±0.04 1.04±0.04 1.06±0.02 VX-765(10 μmol/L) 6 1.06±0.06 1.05±0.08 1.03±0.04 大黄酚(10 μmol/L) 6 3.69±0.28**△△ 3.89±0.28**△△ 3.29±0.32**△△ 大黄酚+VX-765 6 1.64±0.24**△△## 2.14±0.26**△△## 2.32±0.36**△△## F — 266.84 281.15 122.00 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.035 0.039 0.059 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与VX-765(10 μmol/L)组比较△△P < 0.01;与大黄酚(10 μmol/L)组比较## P < 0.01 表 7 caspase-1抑制剂VX-765对大黄酚诱导细胞IL-1β的mRNA以及蛋白表达量的影响(x±s)
与大黄酚(10 μmol/L)组相比，大黄酚(10 μmol/L)+MCC950组的MKN28细胞中LDH释放和caspase-1活化细胞数均降低(P < 0.01)(见表 8)，cleaved caspase-1蛋白表达水平、IL-1β mRNA表达及上清IL-1β、裂解IL-1β的蛋白表达均下降(P < 0.01)(见表 9)。
分组 n LDH/% 双染细胞比例/% 对照组 6 15.02±0.26 1.06±0.06 MCC950(100 nmol/L) 6 14.44±0.78 1.24±0.06 大黄酚(10 μmol/L) 6 52.24±1.24**△△ 13.5±0.76**△△ 大黄酚+ MCC950 6 22.56±0.19**△△## 7.46±0.18**△△## F — 3 394.40 1 364.95 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.562 0.154 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与VX-765(10 μmol/L)组比较△△P < 0.01;与大黄酚(10 μmol/L)组比较## P < 0.01 表 8 NLRP3抑制剂MCC950对大黄酚诱导细胞LDH释放以及caspase-1/PI双染阳性细胞比例的影响(x±s)
分组 n 活化caspase-1表达 IL-1β mRNA IL-1β蛋白(上清) IL-1β蛋白(裂解) 对照组 6 1.06±0.06 1.04±0.04 1.04±0.04 1.06±0.02 MCC950(100 nmol/L) 6 1.04±0.08 0.98±0.04 1.09±0.07 1.05±0.05 大黄酚(10 μmol/L) 6 2.28±0.12**△△ 3.69±0.28**△△ 3.89±0.28**△△ 3.29±0.32**△△ 大黄酚+ MCC950 6 1.62±0.28**△△## 1.72±0.26**△△## 2.12±0.22**△△## 2.26±0.32**△△## F — 80.00 258.19 319.96 134.38 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.026 0.037 0.033 0.052 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与VX-765(10 μmol/L)组比较△△P < 0.01;与大黄酚(10 μmol/L)组比较##P < 0.01 表 9 NLRP3抑制剂MCC950对大黄酚诱导细胞caspase-1活化、IL-1β的mRNA以及蛋白表达量的影响(x±s)
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我国胃癌病人临床确诊时常常已处于晚期，治疗手段包括外科手术治疗、化疗和分子靶向治疗。近年来尽管外科治疗技术和化疗方案得到提高和改进，但疗效并不尽人意，我国胃癌疾病负担仍较严重。目前研究发现中药有效成分在肿瘤辅助治疗中不仅具有抗癌活性，而且不良反应少，因此在抗肿瘤领域成为研究热点。
研究表明，大黄酚可以多途径、多环节、多阶段引起多种癌细胞的增殖抑制、细胞死亡，因此可能成为天然有效的抗癌化疗药物；大黄酚靶向调节核因子κB信号通路，抑制乳腺癌细胞活性，促进凋亡[3]；大黄酚也可以通过刺激活性氧，诱导线粒体钙超载，并激活MAPK途径，从而抑制卵巢癌细胞恶性生物学行为[5]；大黄酚还可通过靶向DCN促进结肠癌细胞线粒体凋亡[7]。然而，在胃癌的发生发展过程中，大黄酚是否具有抗癌作用，以及其如何调节胃癌细胞生长的潜在机制尚并不清楚。本研究通过将不同浓度大黄酚作用于胃癌细胞(MKN28和AGS细胞)，从而观察大黄酚对胃癌细胞的调节作用并对其可能机制进行了探讨。本研究发现，采用不同浓度大黄酚处理胃癌细胞(MKN28)后，与对照组相比，大黄酚以剂量和时间依赖的方式降低细胞活性，抑制细胞的集落形成能力。结果提示大黄酚抑制了MKN28细胞的增殖，说明大黄酚在胃癌的治疗中具有抑癌作用。
NLRP3炎性小体是由多种蛋白质组成的复合物，是体内主要的炎症调控元件，在肿瘤的发生和发展中起着重要作用[10]。NLRP3炎性小体一方面介导caspase-1的激活，促进包括前体IL-1β和前体IL-18在内的细胞因子前体的成熟和分泌[11]，另一方面调节caspase-1依赖的细胞焦亡，在应激、病理和炎症条件下诱导细胞死亡[12]。研究[13]表明，中药可以通过调节NLRP3炎症小体从而参与疾病的发展过程。本研究中，大黄酚可引起MKN28细胞形态改变和细胞焦亡。大黄酚处理后MKN28细胞中NLRP3炎性小体相关蛋白NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA水平以及NLRP3、cleaved caspase-1、上清IL-1β、裂解IL-1β的蛋白水平均显著升高, 提示大黄酚可能通过激活胃癌细胞的焦亡从而抑制细胞增殖。进一步应用caspase-1抑制剂VX-765和NLRP3抑制剂MCC950处理后，相对于大黄酚组，cleaved caspase-1蛋白表达水平、IL-1β mRNA表达以及上清IL-1β、裂解IL-1β蛋白表达均显著下降，提示两者均可消除大黄酚对细胞焦亡和NLRP3炎症相关蛋白表达的影响，从而说明2种抑制剂均可有效减弱大黄酚诱导的MKN28细胞NLRP3炎症小体的激活。同时，抑制剂处理后，相对于大黄酚组，MKN28细胞中LDH释放及caspase-1活化细胞数均显著降低。因此，该结果更进一步说明了，抑制NLRP3炎症小体的激活削弱了大黄酚对胃癌细胞抑癌作用。但之前的研究[14]发现，在小鼠的脑缺血/再灌注过程中，大黄酚可以阻断NLRP3炎性小体的激活，从而防止病程进展。由此说明，大黄酚对NLRP3炎性小体的影响可能与其微环境有关，尤其是内质网应激可能在其对肿瘤细胞生长抑制过程中发挥重要作用[4]。
综上所述，大黄酚对胃癌MKN28细胞具有诱导其焦亡，从而发挥增殖抑制作用，其机制可能与大黄酚激活NLRP3炎症小体有关。本研究未来将进一步研究大黄酚是否通过诱导内质网应激从而激活NLPR3炎性小体发挥抑制胃癌细胞增殖作用，为证实大黄酚在治疗胃癌的潜在价值提供基础理论依据。
大黄酚通过激活NLRP3炎症小体诱导胃癌细胞焦亡的机制研究
Study on the mechanism of chrysophanol inducing pyroptosis of gastric cancer cells by activating NLRP3 inflammasome
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摘要:
目的探索大黄酚诱导人胃癌细胞焦亡的作用及其可能的作用机制。 方法不同浓度大黄酚（0、5、10 μmol/L）和NLRP3抑制剂、caspase-1抑制剂先后处理人胃癌MKN28细胞，CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术检测细胞焦亡；实时荧光定量PCR检测焦亡、NLRP3炎症小体相关蛋白的mRNA水平；Western blotting检测焦亡、NLRP3炎症小体的蛋白表达水平。 结果不同浓度的大黄酚（0、5、10 μmol/L）作用于MKN28细胞后，均降低了细胞存活率（P < 0.01），并促进了细胞焦亡的发生（P < 0.01）。大黄酚呈剂量依赖性地上调胃癌MKN28细胞中NLRP3、caspase-1和白细胞介素-1β的mRNA以及蛋白表达水平（P < 0.01）。采用caspase-1抑制剂VX-765、NLPR3抑制剂MCC950抑制NLPR3炎症小体表达，可削弱大黄酚对细胞焦亡的诱导作用（P < 0.01）。 结论大黄酚抑制人胃癌MKN28细胞增殖、促进LDH释放和caspase-1活性升高，诱导胃癌细胞焦亡，其作用机制与NLRP3/caspase-1通路密切相关。 Abstract:ObjectiveTo explore the effects of chrysophanol on pyroptosis of human gastric cancer cells and its possible mechanism. MethodsThe human gastric cancer MKN28 cells were treated with chrysophanol at different concentrations(0, 5 and 10 μmol/L), NLRP3 inhibitor and caspase-1 inhibitor.The pyroptosis was detected using CCK-8 method, clone formation experiment and flow cytometry.The mRNA levels of pyroptosis and NLRP3 inflammasome-related proteins detected using real-time PCR.The protein expression levels of pyroptosis and NLRP3 inflammasome-related proteins were detected using Western blotting. ResultsThe different concentrations of chrysophanol(0, 5 and 10 μmol/L) could decrease the cell viability and promote the occurrence of pyroptosison of MKN28 cells(P < 0.01).In a dose-dependent manner, the chrysophanol increased the mRNA and protein expression levels of NLRP3, caspase-1 and IL-1β in MKN28 cells(P < 0.01).The caspase-1 inhibitor VX-765 and NLPR3 inhibitor MCC950 were used to inhibit the expression of NLPR3 inflammasome, which could reduce the induced effect of chrysophanol on pyrotosis(P < 0.01). ConclusionsThe chrysophanol can inhibit the proliferation, promote the release of LDH, increase the caspase-1 activity and induce the pyroptosis of gastric cancer MKN28 cells, and which might be related to the NLRP3/caspase-1 pathway. -
Key words:
- gastric neoplasms /
- chrysophanol /
- pyroptosis /
- caspase-1 /
- NLRP3 inflammasome
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表 1 引物序列
基因 引物序列(5′-3′) NLRP3 正向CGG TGA CCT TGT GTG TGC TT 反向TCA TGT CCT GAG CCA TGG AAG caspase-1 正向GAA CAA AGA AGG TGG CGC AT 反向AGA CGT GTA CGA GTG GGT CT IL-1β 正向CCT ATG TCT TGC CCG TGG AG 反向CAC ACA CTA GCA GGT CGT CA β-action 正向TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG 反向GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG 
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表 2 大黄酚对MKN28细胞增殖活性的影响(x±s)
大黄酚浓度/ (μmol/L) n 24 h存活率/% 48 h存活率/% t P 0 6 99.52±1.6 85.32±1.6 15.37 < 0.01 2 6 92.42±3.9** 62.28±1.9** 17.02 < 0.01 5 6 71.44±2.9**△△ 47.36±1.6**△△ 17.81 < 0.01 10 6 62.34±1.9**△△ ## 85.28±1.6△△ ## 22.62 < 0.01 F — 244.98 737.17 — — P — < 0.01 < 0.01 — — MS组内 — 7.448 2.823 — — q检验：与同期0 μmol/L组相比**P < 0.01；与同期2 μmol/L组比较△△P < 0.01;与同期5 μmol/L组比较## P < 0.01
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表 3 大黄酚对MKN28细胞克隆形成能力的影响(x±s)
大黄酚浓度/(μmol/L) n 克隆数目 0 6 129.32±3.6 5 6 97.52±3.8** 10 6 81.38±2.8**△△ F — 202.61 P — < 0.01 MS组内 — 11.747 q检验：与0 μmol/L比较**P < 0.01；与5 μmol/L组比较△△P < 0.01
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表 4 大黄酚对MKN28细胞中NLRP3、caspase-1及IL-1β的mRNA表达量的影响(x±s)
大黄酚浓度/ (μmol/L) n NLRP3 caspase-1 IL-1β 0 6 1.03±0.06 1.06±0.06 1.04±0.04 5 6 1.44±0.15** 1.36±0.09** 2.26±0.16** 10 6 2.56±0.19**△△ 2.28±0.12**△△ 3.69±0.28**△△ F — 181.51 278.71 299.88 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.021 0.009 0.035 q检验：与0 μmol/L比较**P < 0.01；与5 μmol/L组比较△△P < 0.01
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表 5 大黄酚对MKN28细胞中NLRP3、caspase-1及IL-1β的蛋白表达量的影响(x±s)
大黄酚浓度/ (μmol/L) n NLRP3 cleaved caspase-1 IL-1β (上清) IL-1β (裂解) 0 6 1.03±0.06 1.06±0.06 1.04±0.04 1.06±0.02 5 6 1.44±0.15** 1.36±0.09** 2.26±0.16** 2.92±0.26** 10 6 2.56±0.19**△△ 2.28±0.12**△△ 3.89±0.28**△△ 3.29±0.32**△ F — 181.51 278.71 348.52 150.87 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.021 0.009 0.035 0.057 q检验：与0 μmol/L比较**P < 0.01；与5 μmol/L组比较△△P < 0.01
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表 6 caspase-1抑制剂VX-765对大黄酚诱导细胞LDH释放及caspase-1/PI双染阳性细胞比例的影响(x±s)
分组 n LDH/% 双染细胞比例/% 对照组 6 15.02±0.26 1.06±0.06 VX-765(10 μmol/L) 6 12.44±0.98** 1.36±0.04 大黄酚(10 μmol/L) 6 52.24±1.24**△△ 13.52±0.76**△△ 大黄酚+VX-765 6 25.56±0.19**△△ ## 6.52±0.12**△△ ## F — 3052.68 1368.53 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.650 0.149 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与VX-765(10 μmol/L)组比较△△P < 0.01;与大黄酚(10 μmol/L)组比较## P < 0.01
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表 7 caspase-1抑制剂VX-765对大黄酚诱导细胞IL-1β的mRNA以及蛋白表达量的影响(x±s)
分组 n IL-1β mRNA IL-1β蛋白(上清) IL-1β蛋白(裂解) 对照组 6 1.04±0.04 1.04±0.04 1.06±0.02 VX-765(10 μmol/L) 6 1.06±0.06 1.05±0.08 1.03±0.04 大黄酚(10 μmol/L) 6 3.69±0.28**△△ 3.89±0.28**△△ 3.29±0.32**△△ 大黄酚+VX-765 6 1.64±0.24**△△## 2.14±0.26**△△## 2.32±0.36**△△## F — 266.84 281.15 122.00 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.035 0.039 0.059 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与VX-765(10 μmol/L)组比较△△P < 0.01;与大黄酚(10 μmol/L)组比较## P < 0.01
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表 8 NLRP3抑制剂MCC950对大黄酚诱导细胞LDH释放以及caspase-1/PI双染阳性细胞比例的影响(x±s)
分组 n LDH/% 双染细胞比例/% 对照组 6 15.02±0.26 1.06±0.06 MCC950(100 nmol/L) 6 14.44±0.78 1.24±0.06 大黄酚(10 μmol/L) 6 52.24±1.24**△△ 13.5±0.76**△△ 大黄酚+ MCC950 6 22.56±0.19**△△## 7.46±0.18**△△## F — 3 394.40 1 364.95 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.562 0.154 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与VX-765(10 μmol/L)组比较△△P < 0.01;与大黄酚(10 μmol/L)组比较## P < 0.01
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表 9 NLRP3抑制剂MCC950对大黄酚诱导细胞caspase-1活化、IL-1β的mRNA以及蛋白表达量的影响(x±s)
分组 n 活化caspase-1表达 IL-1β mRNA IL-1β蛋白(上清) IL-1β蛋白(裂解) 对照组 6 1.06±0.06 1.04±0.04 1.04±0.04 1.06±0.02 MCC950(100 nmol/L) 6 1.04±0.08 0.98±0.04 1.09±0.07 1.05±0.05 大黄酚(10 μmol/L) 6 2.28±0.12**△△ 3.69±0.28**△△ 3.89±0.28**△△ 3.29±0.32**△△ 大黄酚+ MCC950 6 1.62±0.28**△△## 1.72±0.26**△△## 2.12±0.22**△△## 2.26±0.32**△△## F — 80.00 258.19 319.96 134.38 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.026 0.037 0.033 0.052 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与VX-765(10 μmol/L)组比较△△P < 0.01;与大黄酚(10 μmol/L)组比较##P < 0.01
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图(2)表(9)
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