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癫痫是一种临床表现为异常的、过度的神经元放电，导致大脑功能持续紊乱的病症，对病人的神经系统、认知、心理和社会适应都带来不利的影响[1-2]。由于神经元通过生化反应产生生物电，而每个神经元放电后或激发或抑制其他的脑细胞，当大脑某些部位的神经元过度兴奋，过度放电后，就会导致癫痫发作[3-4]。通常，至少有一次癫痫发作才可能诊断为癫痫，因脑部神经元生物电紊乱，癫痫发作常具有自发性和复发性的特点[5]。
癫痫按病因分为原发性癫痫和继发性癫痫，原发性癫痫的确切病因尚未研究清楚，但各种流行病学研究表明，其发病呈家族性遗传[6-7]。继发性癫痫则与病人的神经递质及受体异常[8]、免疫系统紊乱[9]、离子通道异常[10]、遗传等因素密切相关。其中，γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种与癫痫发病有关的神经递质，GABA受体与癫痫关系密切[11-12]。GABRA1是GABA受体中的一种，有研究[13-15]表明，其表达或功能异常与癫痫发病有紧密关联。
miR-155是一种功能强大的microRNA，研究[16]表明，miR-155在炎症反应、病毒感染、癌症和心血管疾病中表达上调，并在其发病中发挥了重要作用。但miR-155与癫痫的发病是否有关联尚鲜见研究。本研究拟通过比较癫痫病人和脑出血病人的脑组织中miR-155和GABA受体的表达水平，来研究miR-155在癫痫发病中可能的作用，以期为癫痫的诊断和治疗提供参考。现作报道。
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收集2017年在衡水市第二人民医院接受手术治疗的癫痫病人和脑出血病人的临床资料，分为癫痫组和脑出血组。为增强可比性，排除患有免疫系统疾病、心血管系统疾病、感染性疾病和其他神经系统疾病的病人。在病人知情同意、接受手术后，收集其脑组织标本，标本为包含病灶在内的大小约5 mm×5 mm×5 mm的脑组织。其中癫痫组病人共55例，男34例，女21例，平均年龄(34.6±26.5)岁；脑出血组病人共55例，男29例，女26例，平均年龄(42.3±19.8)岁。
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HepG2细胞和Wistar大鼠均购自中科院，DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司，RT-PCR所用的反转录试剂盒、SYBR-GREEN试剂盒均购自TOYOBO公司，转染试剂盒购自Sigma Aldrich公司。miR-155 mimic、miR-control和TRIzol Reagent均购自Thermo Fisher Scientific公司，小RNA提取试剂盒、加尾法miRNA cDNA第一链合成试剂盒和miRNA荧光定量PCR检测试剂盒均购自康为世纪生物公司，荧光素酶活性检测试剂盒购自上海泽叶生物。
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将剪碎的脑组织(或收获的细胞)加液氮研磨，用TRIzol法抽提总RNA，分光光度法进行定量，用反转录试剂盒获得cDNA，根据SYBR Green试剂盒进行qRT-PCR实验，用2-ΔΔct法分析数据。引物设计为miR-155 Pr：5′-TAA TCG TGA TAG GGG TTT-3′，Pf：5′-TAG GAG TCA GTT GGA GGC-3′；GABRA1 Pr：5′-GAT TGG CTA CTT TGT TAT TC-3′，Pf：5′-GAG TTT CTG GCA CTG ATG-3′；GAPDH Pr：5′-TGT GAC GTG GAC ATC CGC AAA G-3′, Pf：5′-TGG AAG GTG GAC AGC GAG GC-3′, 由上海英骏生物技术有限公司合成。
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120只体质量为210~260 g的健康雌性Wistar大鼠购于中国医学科学院实验动物繁育中心，在室温、自然光环境下给予充足的食物及水。随机选取60只雌性大鼠为模型组，剩余60只为正常对照组，在模型组大鼠的海马CA1区埋入电极，用低强度的电流反复刺激(每天12次，每次间隔10 min)，直至出现癫痫Ⅴ级发作，即可认为是造模成功。
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将HepG2细胞接种到6孔板中，加入适量DMEM1640和胎牛血清，置于37 ℃、5%CO2的恒温箱中培养。在细胞状态良好，密度为60%~80%时分别转染psicheck2S-GABRA1 3′-UTR和psicheck2S-mutant GABRA1 3′-UTR，转染操作按照试剂说明书进行。然后，分别加入miR-155 mimic和MNC，24 h后收获细胞进行检测。
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报告质粒与miRNA(mimics)共转染24 h后，用PBS轻柔洗2遍，加入100 μL新鲜配置的1×passive Lysis Buffer裂解液，摇床上裂解细胞15 min；将细胞裂解液收集于1.5 mL EP管，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取20 μL上清液于另一新的1.5 mL EP管中备用；按照Dual-Luciferase Reporter Assay System说明书配制Luciferase Assay Reagent Ⅱ(LARⅡ)和Stop & Glo®Reagent；双荧光素酶报告基因检测分析仪设置参数测定萤火虫(Firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Renilla luciferase)活性；将100 μL LARⅡ与上述检测样本混匀后10 s内测定Firefly luciferase，再加入100 μL 1×Stop & Glo®Reagent，10 s内测定Renilla luciferase，计算Firefly/Renilla相对比值。
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采用t检验和Pearson相关性分析。
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收集癫痫病人和脑出血病人的脑组织标本，qRT-PCR检测其中miR-155的表达水平，结果显示，癫痫组病人脑组织中miR-155的表达水平(3.170±1.016)显著高于脑出血病人的(1.952±0.594)(t=7.68，P＜0.01)。癫痫病人脑组织中GABRA1相对水平为1.855±0.329，分析癫痫病人脑组织中miR-155的表达水平和GABRA1的表达水平的相关性，结果显示，miR-155的表达与GABRA1的表达呈显著正相关关系(r=0.768，P＜0.01)。
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制造癫痫大鼠模型，并以健康大鼠作为正常对照，取其脑组织(见图 1)，RT-PCR检测其中miR-155和GABRA1的表达，结果显示，癫痫模型大鼠的脑组织中miR-155的表达水平(0.858±0.107)显著高于正常对照组大鼠(0.572±0.061)(t=18.00, P＜0.01)。癫痫模型大鼠脑组织中GABRA1相对水平为1.855±0.329，分析癫痫模型大鼠脑组织中miR-155的表达水平和GABRA1的表达水平的相关性，结果显示，miR-155的表达和GABRA1的表达呈强正相关(r=0.798，P＜0.01)。
图 1 大鼠脑组织图
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在癫痫病人和癫痫大鼠模型的脑组织中，miR-155均与GABRA1的表达呈正相关，经Targetscan分析发现，GABRA1的3′UTR上存在可与miR-155结合的序列(见表 1)。将GABRA1的3′UTR的全长序列构建到psicheck2S质粒载体上，并将GABRA1的3′UTR中miR-155结合序列进行突变后再构建到psicheck2S质粒载体上，将构建的质粒转染到HepG2细胞中，并加入miR-155 mimic，通过检测荧光素酶活性判断GABRA1是否与miR-155相互结合，结果显示，转染GABRA1突变的质粒后，荧光素酶的活性显著降低(P＜0.01)(见表 2)，表明GABRA1与miR-155相互结合，而且结合序列为3′-UTR中的AGC AUU AA(见表 1)。
序列 miRNA与预测的靶基因序列结合部位 GABRA1 3′非编码区第1405-1412位置的碱基序列hsa-miR-155-5p 5′...UGU UGU ACC AUA UGU AGC AUU AA... 3′ UGG GGA UAG UGC UAA UCG UAA UU 突变的GABRA1 3′非编码区第1405-1412位置的碱基序列 5′...UGU UGU ACC AUA UGU TCG TAA TT... 表 1 Targetscan分析miR-155与GABRA1的结合序列
分组 n 荧光素酶相对活性 F P MS组内 miR-155 mimic+mutant GABRA1 12 0.434±0.098 67.59 ＜0.01 0.007 miR-155 mimic+GABRA1 MNC+GABRA1 12 12 0.790±0.115** 0.837±0.053** MNC+mutant GABRA1 12 0.871±0.058** q检验：与miR-155 mimic + mutant GABRA1比较**P＜0.01 表 2 GABRA1与miR-155是否结合的荧光素酶分析
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癫痫是一种严重影响病人生活质量和身心健康的疾病，其发病因素多样，目前针对癫痫的治疗整体上以控制症状为主。因影响其发病的因素众多，其治疗相关的靶点也比较多。其中GABA和GABA受体是癫痫的治疗中非常重要的一对靶点，有GABA受体激动剂类药物、GABA再摄取抑制剂类药物、GABA转氨酶抑制剂类药物等均是针对这些靶点而设计研发[17-20]。
本研究结果表明，miR-155在癫痫病人脑组织中的表达量显著高于脑出血病人，而在阿尔兹海默症病人中，miR-155表达上调，并可通过作用于T细胞来调节炎症反应[21]，这与我们的研究有相符之处，miR-155是一个功能强大的miRNA，在炎症反应、病毒感染、癌症和心血管疾病中表达上调[16]，而根据本研究结果，miR-155在癫痫中也表达上调，部分癫痫病人存在免疫系统紊乱和炎症反应，提示miR-155也可能参与了癫痫病人体内的免疫系统紊乱或炎症反应，miR-155也可能在癫痫病人中作用于某些脑细胞或免疫细胞，导致了病人的生物电紊乱，这提示以后的研究中，可通过动物模型和细胞试验来检测miR-155在疾病中的作用。
本研究显示，在癫痫病人和癫痫模型大鼠的脑组织中，GABRA1的mRNA的表达是均上调，而且其表达与miR-155的水平呈正相关，表明GABRA1可能是miR-155的靶基因，miR-155可能能促进GABRA1的表达的上调。然后通过Targetscan分析，发现二者存在可结合的序列，我们将该序列进行突变并构建到psicheck2S质粒载体上，发现突变后荧光素酶的活性显著降低，表明miR-155可与GABRA1结合，而且可结合的序列部分为Targetscan所预测的序列，GABRA1可能属于miR-155的靶基因。
综上所述，miR-155在癫痫中的表达显著上调，而且与GABRA1的表达呈正相关，miR-155可与GABRA1结合，GABRA1可能属于miR-155的靶基因。这说明miR-155可能有潜力作为癫痫的诊断标志和治疗的靶点。下一步我们将研究miR-155与GABRA1作用方式和具体的分子机制，并通过细胞试验和动物模型进一步验证，以期进一步阐述miR-155在癫痫中的作用和相应机制。
miRNA-155在癫痫病人中的表达及其机制研究
Study on the expression and mechanism of miRNA-155 in epileptic patients
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摘要:
目的检测癫痫病人的脑组织标本中miR-155的表达水平，并分析miR-155与癫痫发病的关联。 方法收集癫痫病人、脑出血微创手术病人的脑组织标本各55例，用qRT-PCR检测其中miR-155和GABRA1的表达水平，并分析miR-155与GABRA1表达的关联。制作大鼠癫痫电点燃模型，用qRT-PCR检测其中miR-155和GABRA1的表达水平，并分析miR-155与GABRA1表达的关联。用Targetscan分析GABRA1是否为miR-155的靶基因，并分别将GABRA1的3'-UTR和突变的3'-UTR构建到psicheck2S质粒载体上，将构建的质粒分别转染到HepG2细胞中，并加入miR-155 mimic，通过检测荧光素酶活性判断GABRA1是否与miR-155相互结合。 结果癫痫病人脑组织中miR-155和GABRA1的表达显著上调(P < 0.01)，而且miR-155的表达水平与GABRA1的表达水平呈正相关(P < 0.01)；癫痫电点燃模型大鼠脑组织中miR-155和GABRA1的表达显著上调(P < 0.01)，且miR-155的表达水平与GABRA1的表达水平呈正相关(P < 0.01)。转染了GABRA1的3'-UTR的HepG2细胞荧光素酶活性显著高于转染突变型3'-UTR的HepG2细胞(P < 0.01)。 结论miRNA155在癫痫病人脑组织表达上调，可能通过调节GABRA1的表达而参与癫痫病理生理过程。 Abstract:ObjectiveTo detect the expression levels of miR-155 in brain tissue samples of epileptic patient, and analyze the association between miR-155 and pathogenesis of epilepsy. MethodsThe expression levels of miR-155 and GABRA1 in 55 brain tissue samples of epilepsy patients and 55 brain tissue samples of cerebral hemorrhage patients were detected using qRT-PCR, and the correlation between the expression of miR-155 and GABRA1 was analyzed.The rat epilepsy model was established, the mRNA expression of miR-155 and GABRA1 was determined using qRT-PCR, and the correlation between the expression of miR-155 and GABRA1 was analyzed.Targetscan was used to analyze whether GABRA1 was a target gene of miR-155, 3'-UTR of GABRA1, the mutant 3'-UTR was inserted into psicheck2S vector, and then transfected into HepG2 cells.Luciferase assay was used to determine whether GABRA1 combined with miR-155 in HepG2 cells treated with miR-155 mimic. ResultsThe expression levels of miR-155 and GABRA1 in brain tissue samples of epilepsy patients significantly increased(P < 0.01), and the expression levels of miR-155 were positively correlated with GABRA1(P < 0.01).The expression levels of miR-155 and GABRA1 in the brain tissue of rat epilepsy model significantly increased(P < 0.01), and the expression levels of miR-155 were positively correlated with GABRA1(P < 0.01).The luciferase activity of HepG2 cells transfected with 3'-UTR of GABRA1 was significantly higher than that of HepG2 cells transfected with mutation 3'-UTR(P < 0.01). ConclusionsThe miR-155 level significantly increases in brain samples of epilepsy patients, which may be involved in the pathological and physiological process of epilepsy by regulating the expression of GABRA1. -
Key words:
- epilepsy /
- miR-155 /
- r-aminobutyric acid receptor /
- rat
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表 1 Targetscan分析miR-155与GABRA1的结合序列
序列 miRNA与预测的靶基因序列结合部位 GABRA1 3′非编码区第1405-1412位置的碱基序列hsa-miR-155-5p 5′...UGU UGU ACC AUA UGU AGC AUU AA... 3′ UGG GGA UAG UGC UAA UCG UAA UU 突变的GABRA1 3′非编码区第1405-1412位置的碱基序列 5′...UGU UGU ACC AUA UGU TCG TAA TT... 
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表 2 GABRA1与miR-155是否结合的荧光素酶分析
分组 n 荧光素酶相对活性 F P MS组内 miR-155 mimic+mutant GABRA1 12 0.434±0.098 67.59 ＜0.01 0.007 miR-155 mimic+GABRA1 MNC+GABRA1 12 12 0.790±0.115** 0.837±0.053** MNC+mutant GABRA1 12 0.871±0.058** q检验：与miR-155 mimic + mutant GABRA1比较**P＜0.01
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