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皮肤是最易受损伤的组织,创伤愈合是多种修复细胞、生长因子和细胞外基质之间相互作用的动态修复过程,可简单概括为3个阶段:止血和炎症反应阶段;细胞增殖分化阶段;组织重塑、瘢痕形成阶段[1]。皮肤创伤后, 立即发生血管收缩、血小板聚集及纤维蛋白凝块形成等反应, 参与创面止血。局部炎症反应由纤维蛋白凝块及聚集的血小板脱颗粒引起,炎症阶段募集的炎细胞、上皮细胞、真皮细胞等分泌的生长因子诱导并维持细胞增生,启动细胞迁移。同时,创面内成纤维细胞增生并合成细胞外基质, 形成新生肉芽组织,随后被重塑为早期瘢痕组织。最后, 成纤维细胞凋亡, 形成相对无细胞的瘢痕组织, 其结构和功能与正常皮肤组织相似[2-3]。在皮肤创伤愈合过程中,成纤维细胞是主要修复细胞,是细胞外基质、肉芽组织及瘢痕组织形成中的主要功能细胞[4]。黄芪入药历史悠久,是一味临床上常用的中药材。黄芪的主要活性成分是黄芪甲苷(astragaloside-Ⅳ,AS-Ⅳ),AS-Ⅳ具有提高免疫力、调节血糖、抗肿瘤等功效[5]。有文献报道[6],在皮肤创伤后,给予AS-Ⅳ有助于皮肤创面愈合。但文献研究的是较低浓度的AS-Ⅳ,并未探索较高浓度AS-Ⅳ产生的不利影响,忽略了药物本身的毒性作用。本研究通过观察AS-Ⅳ对小鼠成纤维细胞L929的细胞毒性及影响机制,为AS-Ⅳ在皮肤创伤治疗中的合理应用提供实验依据。
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Control组及0.3% DMSO组L929细胞形态无明显改变,多为贴壁生长的梭形及多角形细胞。与Control组相比,30、60、120 μmol/L的AS-Ⅳ处理L929细胞12、24 h,随给药浓度及给药时间增加,圆形细胞逐渐增多,悬浮细胞增多,死亡细胞逐渐增多(见图 1)。
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30、60、90、120 μmol/L AS-Ⅳ处理L929细胞12 h和24 h,其OD值均低于Control组(P < 0.05~P < 0.01)。在同一处理时间(12 h、24 h),随着给药浓度增加,其OD值逐渐降低(P < 0.05~P < 0.01)。同一浓度AS-Ⅳ处理L929细胞12 h和24 h,其OD值均低于处理6 h(P < 0.05~P < 0.01)。0.3% DMSO组与Control组细胞OD值随时间增加而升高,2组OD值差异无统计学意义(P>0.05)(见表 1)。
分组 6 h OD值 12 h OD值 24 h OD值 F P MS组内 Control组 1.81±0.01 1.90±0.01 2.18±0.04 540.51 < 0.01 0.000 0.3% DMSO组 1.81±0.34 1.93±0.22 2.17±0.04 5.20 < 0.05 0.055 AS-Ⅳ 30 μmol/L组 1.75±0.25 1.73±0.32* 1.43±0.01** 4.53 < 0.05 0.055 AS-Ⅳ 60 μmol/L组 1.67±0.20* 1.55±0.01**▲ 1.42±0.03**▲ 9.15 < 0.05 0.014 AS-Ⅳ 90 μmol/L组 1.58±0.22*▲ 1.42±0.10**▲▲■ 1.35±0.04**▲■ 5.50 < 0.05 0.020 AS-Ⅳ 120 μmol/L组 1.39±0.16*▲■△ 1.16±0.01**▲▲■■△ 0.91±0.15**▲▲■■△△ 28.18 < 0.01 0.017 F 4.20 26.53 412.41 — — — P < 0.05 < 0.01 < 0.01 — — — MS组内 0.049 0.026 0.005 — — — q检验:与Control组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与0.3% DMSO组比较#P < 0.05;与AS-Ⅳ 30 μmol/L组比较▲P < 0.05,▲▲P < 0.01;与AS-Ⅳ 60 μmol/ L组比较■P < 0.05,■■P < 0.01;与AS-Ⅳ 90 μmol/L组比较△P < 0.05, △△P < 0.01 表 1 AS-Ⅳ干预后L929细胞各组OD值比较(ni=8;x±s)
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AS-Ⅳ 30、60、120 μmol/L分别干预L929细胞24 h,细胞凋亡率均高于Control组(P < 0.05~P < 0.01)(见图 2、表 2)。
分组 细胞凋亡率/% Control组 2.19±0.36 AS-Ⅳ 30 μmol/L组 7.51±1.49* AS-Ⅳ 60 μmol/L组 26.79±2.18**## AS-Ⅳ 120 μmol/L组 54.34±2.20**##▲▲ F 746.71 P < 0.01 MS组内 2.980 q检验:与Control组比较*P < 0.05, **P < 0.01;与AS-Ⅳ 30 μmol/L组比较##P < 0.01, 与AS-Ⅳ 60 μmol/L组比较▲▲P < 0.01 表 2 各组L929细胞凋亡率比较(ni=4;x±s)
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与Control组相比,AS-Ⅳ 60 μmol/L干预L929细胞6 h、12 h、24 h能升高细胞内cleaved Caspase-3及γ-H2AX蛋白表达(P < 0.05~P < 0.01)(见图 3、表 3)。与Control组相比,AS-Ⅳ 30、60、120 μmol/L分别处理L929细胞12 h能升高细胞内γ-H2AX和cleaved Caspase-3蛋白表达(P < 0.05~P < 0.01)(见图 4、表 4)。
分组 给药时间/h γ-H2AX/ β-actin cleaved Caspase-3/ β-actin Control 0 0.03±0.26 0.03±0.04 AS-Ⅳ 60 μmol/L组 6 0.52±0.04** 0.19±0.02* 12 0.61±0.02** 0.34±0.04* 24 0.76±0.02**#▲ 0.46±0.02**#▲ F — 23.09 135.07 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.018 0.001 q检验:与Control组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与6 h组比较#P < 0.05;与12 h组比较▲ P < 0.05 表 3 60 μmol/L AS-Ⅳ对L929细胞cleaved Caspase-3及γ-H2AX表达水平的影响(ni=4;x±s)
分组 γ-H2AX/ β-actin cleaved Caspase-3/ β-actin Control组 0.03±0.05 0.07±0.31 AS-Ⅳ 30 μmol/L组 0.40±0.02** 0.20±0.16* AS-Ⅳ 60 μmol/L组 0.73±0.13**## 0.38±0.27*# AS-Ⅳ 120 μmol/L组 0.89±0.20**##▲ 0.58±0.01**#▲ F 38.74 7.76 P < 0.01 < 0.05 MS组内 0.015 0.024 q检验:与Control组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与AS-Ⅳ 30 μmol/L组比较#P < 0.05,##P < 0.01;与AS-Ⅳ 60 μmol/ L组比较▲P < 0.05 表 4 不同浓度AS-Ⅳ干预L929细胞12 h对cleaved Caspase-3及γ-H2AX表达水平的影响(ni=4;x±s)
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Control组与0.3%DMSO组的划痕逐渐愈合,24 h后基本完全愈合,2组相对迁移率差异无统计学意义(P>0.05)。与Control组相比,AS-Ⅳ 30、60、120 μmol/L分别干预L929细胞12 h及24 h,相对迁移率均下降(P < 0.05~P < 0.01)(见图 5、表 5)。
分组 相对迁移率/% 12 h 24 h Control 41.62±1.87 98.18±4.04 0.3% DMSO组 43.79±2.39 96.95±2.10 AS-Ⅳ 30 μmol/L组 8.18±1.34* 11.99±3.22* AS-Ⅳ 60 μmol/L组 1.57±1.48**▲ 1.30±1.09**▲▲ AS-Ⅳ 120 μmol/L组 0.00±0.00**▲▲■■ 0.00±0.00**▲▲■■ F 723.99 1629.12 P < 0.01 < 0.01 MS组内 2.636 6.443 q检验:与Control组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与AS-Ⅳ 30 μmol/L组比较▲P < 0.05,▲▲P < 0.01;与AS-Ⅳ 60 μmol/L组比较■■P < 0.01 表 5 AS-Ⅳ对L929细胞迁移能力的影响(ni=4;x±s)
黄芪甲苷对成纤维细胞的毒性研究
Study on the toxicity of astragaloside-Ⅳ to fibroblasts
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摘要:
目的探索黄芪甲苷(astragaloside-Ⅳ, AS-Ⅳ)对小鼠成纤维细胞L929的毒性及影响机制, 为AS-Ⅳ在皮肤创伤治疗中的应用提供实验依据。 方法体外培养L929细胞, 在倒置显微镜下观察各组细胞形态, 采用CCK8检测细胞增殖, Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡, Western blotting检测细胞内cleaved Caspase-3和γ-H2AX蛋白表达, 细胞划痕实验检测细胞迁移能力。 结果与Control组相比, 30、60、120 μmol/L的AS-Ⅳ处理L929细胞12 h、24 h, 随给药浓度及给药时间增加, 圆形细胞逐渐增多, 悬浮细胞增多, 死亡细胞逐渐增多。30、60、90、120 μmol/L AS-Ⅳ处理L929细胞12 h和24 h, 其OD值均低于Control组(P < 0.05~P < 0.01); 在同一处理时间, 随着给药浓度增加, 其OD值逐渐降低(P < 0.05~P < 0.01); 同一浓度AS-IV处理L929细胞12 h和24 h, 其OD值均低于处理6 h(P < 0.05~P < 0.01)。30、60、120 μmol/L AS-Ⅳ干预L929细胞24 h, 细胞凋亡率均高于Control组(P < 0.05~P < 0.01)。与Control组相比, 60 μmol/L AS-Ⅳ干预L929细胞6 h、12 h、24 h均能升高细胞内cleaved Caspase-3及γ-H2AX蛋白表达(P < 0.05~P < 0.01); 与Control组相比, 30、60、120 μmol/L AS-Ⅳ处理L929细胞12 h均能升高细胞内γ-H2AX和cleaved Caspase-3蛋白表达(P < 0.05~P < 0.01)。与Control组相比, 30、60、120 μmol/L AS-Ⅳ干预L929细胞12 h及24 h, 相对迁移率均下降(P < 0.05~P < 0.01)。 结论AS-Ⅳ浓度大于30 μmol/L时能抑制L929细胞增殖、迁移, 诱导其凋亡。 Abstract:ObjectiveTo investigate the cytotoxicity and mechanism of astragaloside-Ⅳ(AS-Ⅳ) on L929 cells, and provide the experimental basis for the application of AS-Ⅳ in treating skin wounds. MethodsThe L929 cells were cultured in vitro, and the cell morphology of each group was observed under inverted microscope.The cell proliferation was detected using CCK8, and the apoptosis was detected using Annexin V-FITC/PI double staining.The expression levels of cleaved Caspase-3 and γ-H2AX protein were detected using Western blotting, and the cell migration ability was detected using cell scratch test. ResultsCompared with the control group, the L929 cells were treated with 30, 60 and 120 μmol/L AS-Ⅳ for 12 h and 24 h, with the increasing of drug concentration and time, the number of round cells, suspended cells and dead cells increased gradually.The OD value of L929 cells treated with 30, 60, 90 and 120 μmol/L AS-Ⅳ for 12 h and 24 h were lower than that of control group(P < 0.05 to P < 0.01).At the same treatment time, with the increasing of drug concentration, the OD value decreased gradually(P < 0.05 to P < 0.01).The OD value of L929 cells treated with the same concentration of AS-Ⅳ for 12 h and 24 h were lower than that of L929 cells treated for 6 h(P < 0.05 to P < 0.01).The apoptosis rate of L929 cells treated with 30, 60 and 120 μmol/L AS-Ⅳ for 24 h were higher than that of control group(P < 0.05 to P < 0.01).Compared with the control group, the expression levels of cleaved Caspase-3 and γ-H2AX protein in L929 cells treated with 60 μmol/L AS-Ⅳ for 6 h, 12 h and 24 h increased(P < 0.05 to P < 0.01).Compared with the control group, the expression levels of cleaved caspase-3 and γ-H2AX protein in L929 cells treated with 30, 60 and 120 μmol/L AS-Ⅳ for 12 h increased(P < 0.05 to P < 0.01).Compared with the control group, the relative mobility of L929 cells treated with 30, 60 and 120 μmol/L AS-Ⅳ for 12 h and 24 h decreased(P < 0.05 to P < 0.01). ConclusionsWhen the concentration of AS-Ⅳ is higher than 30 μmol/L, it can inhibit the proliferation and migration, and induce the apoptosis of L929 cells. -
Key words:
- astragaloside-Ⅳ /
- fibroblast /
- proliferation /
- apoptosis
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表 1 AS-Ⅳ干预后L929细胞各组OD值比较(ni=8;x±s)
分组 6 h OD值 12 h OD值 24 h OD值 F P MS组内 Control组 1.81±0.01 1.90±0.01 2.18±0.04 540.51 < 0.01 0.000 0.3% DMSO组 1.81±0.34 1.93±0.22 2.17±0.04 5.20 < 0.05 0.055 AS-Ⅳ 30 μmol/L组 1.75±0.25 1.73±0.32* 1.43±0.01** 4.53 < 0.05 0.055 AS-Ⅳ 60 μmol/L组 1.67±0.20* 1.55±0.01**▲ 1.42±0.03**▲ 9.15 < 0.05 0.014 AS-Ⅳ 90 μmol/L组 1.58±0.22*▲ 1.42±0.10**▲▲■ 1.35±0.04**▲■ 5.50 < 0.05 0.020 AS-Ⅳ 120 μmol/L组 1.39±0.16*▲■△ 1.16±0.01**▲▲■■△ 0.91±0.15**▲▲■■△△ 28.18 < 0.01 0.017 F 4.20 26.53 412.41 — — — P < 0.05 < 0.01 < 0.01 — — — MS组内 0.049 0.026 0.005 — — — q检验:与Control组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与0.3% DMSO组比较#P < 0.05;与AS-Ⅳ 30 μmol/L组比较▲P < 0.05,▲▲P < 0.01;与AS-Ⅳ 60 μmol/ L组比较■P < 0.05,■■P < 0.01;与AS-Ⅳ 90 μmol/L组比较△P < 0.05, △△P < 0.01 表 2 各组L929细胞凋亡率比较(ni=4;x±s)
分组 细胞凋亡率/% Control组 2.19±0.36 AS-Ⅳ 30 μmol/L组 7.51±1.49* AS-Ⅳ 60 μmol/L组 26.79±2.18**## AS-Ⅳ 120 μmol/L组 54.34±2.20**##▲▲ F 746.71 P < 0.01 MS组内 2.980 q检验:与Control组比较*P < 0.05, **P < 0.01;与AS-Ⅳ 30 μmol/L组比较##P < 0.01, 与AS-Ⅳ 60 μmol/L组比较▲▲P < 0.01 表 3 60 μmol/L AS-Ⅳ对L929细胞cleaved Caspase-3及γ-H2AX表达水平的影响(ni=4;x±s)
分组 给药时间/h γ-H2AX/ β-actin cleaved Caspase-3/ β-actin Control 0 0.03±0.26 0.03±0.04 AS-Ⅳ 60 μmol/L组 6 0.52±0.04** 0.19±0.02* 12 0.61±0.02** 0.34±0.04* 24 0.76±0.02**#▲ 0.46±0.02**#▲ F — 23.09 135.07 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.018 0.001 q检验:与Control组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与6 h组比较#P < 0.05;与12 h组比较▲ P < 0.05 表 4 不同浓度AS-Ⅳ干预L929细胞12 h对cleaved Caspase-3及γ-H2AX表达水平的影响(ni=4;x±s)
分组 γ-H2AX/ β-actin cleaved Caspase-3/ β-actin Control组 0.03±0.05 0.07±0.31 AS-Ⅳ 30 μmol/L组 0.40±0.02** 0.20±0.16* AS-Ⅳ 60 μmol/L组 0.73±0.13**## 0.38±0.27*# AS-Ⅳ 120 μmol/L组 0.89±0.20**##▲ 0.58±0.01**#▲ F 38.74 7.76 P < 0.01 < 0.05 MS组内 0.015 0.024 q检验:与Control组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与AS-Ⅳ 30 μmol/L组比较#P < 0.05,##P < 0.01;与AS-Ⅳ 60 μmol/ L组比较▲P < 0.05 表 5 AS-Ⅳ对L929细胞迁移能力的影响(ni=4;x±s)
分组 相对迁移率/% 12 h 24 h Control 41.62±1.87 98.18±4.04 0.3% DMSO组 43.79±2.39 96.95±2.10 AS-Ⅳ 30 μmol/L组 8.18±1.34* 11.99±3.22* AS-Ⅳ 60 μmol/L组 1.57±1.48**▲ 1.30±1.09**▲▲ AS-Ⅳ 120 μmol/L组 0.00±0.00**▲▲■■ 0.00±0.00**▲▲■■ F 723.99 1629.12 P < 0.01 < 0.01 MS组内 2.636 6.443 q检验:与Control组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与AS-Ⅳ 30 μmol/L组比较▲P < 0.05,▲▲P < 0.01;与AS-Ⅳ 60 μmol/L组比较■■P < 0.01 -
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